Ce travail a été soutenu par des subventions des États-Unis la National Science Foundation # MCB-0741914 et 0843627 MCB-; un soutien supplémentaire des infrastructures a été fourni au City College de New York par les Instituts nationaux de la santé 2 G12 RR03060-26 à partir du Centre National de Ressources de recherche. Nous tenons à remercier le JKC Rose groupe dans le département de l&#39;Université Cornell Biologie végétale pour fournir M82 (type sauvage) et CM15 (mutant) cuticules de tomate. Nous remercions le Dr Spyros Monastiriotis du groupe d&#39;ingénierie chimique CCNY du professeur Alexander Couzis pour son aide généreuse avec les expériences AFM. Nous remercions Mme Lauren Gohara pour aide à la conception graphique.

1. Isolement enzymatique de la tomate cuticules 5 <ol><li> Placez plusieurs tomates commerciales ou cultivées dans un bol. Retirer la peau des fruits en grandes sections; jeter le péricarpe interne. Laver les peaux de tomates avec de l&#39;eau déminéralisée et de les conserver sous l&#39;eau dans un bécher. </li><li> Préparer un pH 4,0 à 50 mM de tampon acétate de sodium (à 31 ° C) en mettant 1,22 g de trihydrate d&#39;acétate de sodium (M r. 136,08 g / mole) et 2,34 ml d&#39;acide acétique glacial (17,485 M) dans un bécher, ajoutant 200 ml d&#39; de l&#39;eau désionisée, puis ajustement du pH à 4,0 à 31 ° C. Préparer un mélange contenant 4 ml de pectinase (EC 3.2.1.15; 10 U ml -1, TCI America), 0,2 g de cellulase (CE 232.734.4; 1,3 unités / mg de solide, Sigma-Aldrich), et 13 mg NaN 3, puis ajouter 196 ml de tampon acétate de sodium du mélange d&#39;enzymes pour obtenir 200 ml de cocktail enzymatique finale. 5 immerger complètement la peau des tomates pelées dans le cocktail enzymatique et incuberà 31 ° C pendant 24 heures avec une agitation constante (G24 environnement Incubateur agité; New Brunswick Scientific Co.). </li><li> Recueillir les peaux de tomates à l&#39;aide d&#39;une passoire de cuisine ou entonnoir Büchner et les laver avec de l&#39;eau déminéralisée. Par la suite, placez-les dans un four sous vide à température ambiante pendant une heure. Préserver les peaux de tomates séchées dans une bouteille étiquetée et plafonné pour les procédures ultérieures de déparaffinage. </li></ol> 2. Déparaffinage exhaustive par extraction Soxhlet 6 <ol><li> L&#39;équipement utilisé pour le déparaffinage exhaustive se compose d&#39;une source de chaleur (chauffage manteau et Variac contrôleur), ballon à fond rond pour un réservoir de solvant, extraction Soxhlet, en verre fritté dé à coudre ou cartouche d&#39;extraction jetables, anti-puces de supplantation et un condenseur (voir Fig. 1). Notez que le bras de siphon étroit (parties 6 et 7 dans la Fig. 1) est très délicate et sujette à la rupture, nécessitant une manipulation minutieuse. </li><li> Mettez 0,5-1 g de peau de la tomate (obtenue enl&#39;étape 1.) dans un mortier, et broyer l&#39;échantillon pour obtenir une poudre grossière avec un pilon à moins que les échantillons doivent être utilisés pour les mesures AFM (section 5). Remplir une cartouche en verre fritté ou en papier à mi-chemin avec l&#39;échantillon et à utiliser des pinces pour le placer soigneusement à la base de la colonne d&#39;extraction. </li><li> Fixer le condenseur et l&#39;envelopper de papier d&#39;aluminium. Chauffer le méthanol (qualité ACS) solvant, en présence de quelques anti-puces de supplantation jusqu&#39;à ébullition doucement et reflux sur les parois du ballon. Couvrir le réservoir de solvant avec de la laine de verre à la fois et une feuille d&#39;aluminium. Vérifier le processus pendant une heure, réglage de la tension Variac sorte que le réservoir accumule environ une goutte par seconde et le siphonnage se produit au sein de l&#39;appareil de Soxhlet lorsque la cartouche est pleine. </li><li> Continuer le processus d&#39;extraction pendant 12 h, puis baisser le manteau de chauffage et de permettre à l&#39;appareil de se refroidir. Retirez l&#39;extracteur et le réservoir comme une seule unité à disposer du solvant. Utilisez tweezers pour élever la cartouche à juste en dessous du col de la colonne d&#39;extraction, le solvant en excès s&#39;écouler de lui, et placer la cartouche sur une surface propre. Inclinez la colonne d&#39;extraction afin de permettre la solution dans le flacon ci-dessous. Débranchez le flacon et verser les déchets dans un récipient à déchets dûment étiqueté solvant. </li><li> Répétez les étapes 2.3 et 2.4 pour les solvants successifs de polarité diminuant progressivement, par exemple, le chloroforme et l&#39;hexane pendant 12 h dans chaque cas. </li><li> Laisser l&#39;échantillon cutine tomates pour sécher l&#39;intérieur de la cosse, soit par soufflage d&#39;un courant d&#39;azote gazeux au-dessus ou en le plaçant dans un four sous vide à température ambiante. Enfin, mesurer la masse de l&#39;échantillon sec et de le stocker à température ambiante dans un bocal vis-dessus scellée avec du parafilm. </li></ol> 3. Isolement sélectif des cires épicuticulaires et Intracuticular 3,4 <ol><li> D&#39;abord, lavez les tomates entières (un lot distinct de tomates de celles décrites en 1.) Avec de l&#39;eau distillée. Séchez-les avec papserviettes er et Kimwipes et placez-les souches à la baisse sur un morceau de papier d&#39;aluminium. </li><li> Peignez les tomates entières avec 120% (ratio de la masse w / w,) la gomme arabique solution aqueuse dans un top-down de mode et de permettre à environ une heure pour la gomme arabique à sécher sur la peau du fruit, laissant une fine pellicule. Retirez ce film en utilisant des pinces, en prenant soin de ne pas percer la peau de la tomate. Répétez la procédure une fois de plus. </li><li> Ajouter des films dans des flacons contenant 1:1 (v / v) de chloroforme-eau et mélanger pendant trois minutes. Après une agitation vigoureuse et une séparation de phase, pipeter les fractions de chloroforme et les flacons séparés s&#39;évaporer dans découverts, laissant la cire épicuticulaire. Les tomates restera physiquement intact. Trempez-les dans du chloroforme pour les deux minutes à température ambiante et de recueillir la cire intracuticular après évaporation du solvant. Maintenant, peler les tomates et les traiter par voie enzymatique (avec de la cellulase et la pectinase dans du tampon acétate de sodium) pour enlever la cellulose et pectine, respectivement (comme décrit dans <strong&gt; 1). </li><li> Si vous le souhaitez, effectuer un déparaffinage exhaustive sur ces cuticules isolées enzymatiquement par extraction Soxhlet (voir étape 2), en utilisant trois solvants de polarité variable (méthanol, le chloroforme et l&#39;hexane, respectivement). </li></ol> 4. Caractérisation moléculaire de cutine fruit de la tomate par la Croix-polarisation Magic-angle spinning à l&#39;état solide résonance magnétique nucléaire (CPMAS ssNMR) 6 <ol><li> Lieu 4-6 mg de cuticules de tomate pleinement déparaffinées (enclenchements) dans un rotor de 1,6 mm fastMAS zircone en utilisant le fournisseur fourni outil d&#39;emballage. (Soit les cuticules au sol de tomate déparaffinées ou très petits morceaux de cuticules partiellement déparaffinées sont adaptés.) Veiller à ce que l&#39;échantillon est emballé de manière uniforme, mais pas trop serré, dans le rotor. Après avoir mis sur le capuchon supérieur, peindre la moitié du capital avec un marqueur à encre noire pour faciliter les mesures de la vitesse de rotation. </li><li> Régler le calage du spectromètre RMN pour la largeur de ligne minimale spectrale à mi-hauteur d&#39;une calibrer le proton (H 1) et de carbone (13 C) 90 ° largeurs d&#39;impulsion en utilisant un composé standard tel que l&#39;adamantane. </li><li> Utilisation de la glycine ou la glutamine comme composés modèles, d&#39;obtenir l&#39;intensité maximale du signal en optimisant tous les paramètres (Hartmann-Hahn niveaux de puissance correspondant, 1 h - 13 temps de contact C, hétéronucléaire 1 H découplage de résistance) de la polarisation croisée à l&#39;angle magique de filature (CPMAS) expérience. Pour spectres obtenus à une fréquence 1 H à 600 MHz, les conditions recommandées comprennent de 10 kHz ou 15 kHz filature, un délai de 3-sec entre les acquisitions, et RACHIDIENNE protons hétéronucléaire découplage 7 à une intensité de champ magnétique correspond à une fréquence de 185 kHz. </li><li> Insérez le rotor cutine-emballé dans la sonde. Ensuite, placer la sonde dans l&#39;aimant. Augmenter la vitesse de filage jusqu&#39;à 10 kHz progressivement pour vérifier emballage bon échantillon et la stabilité du rotor. Vérifier la stabilité de filage finale du rotor à l&#39;intérieur± 20 Hz. </li><li> Ajustez la mise au point et l&#39;appariement des condensateurs de la sonde de manière itérative pour obtenir une réflexion minimum de puissance à la fois 1 H et 13 C RMN fréquences. Réglez la température expérimentale à 25 ° C (ou température ambiante). </li><li> Commencer l&#39;expérience pré-optimisée CPMAS correspondant à la condition de Hartmann-Hahn correspondant à la fréquence déterminée de 10 kHz filature. </li><li> Acquérir 4096 transitoires, l&#39;état du spectre avec exponentielle (lorentzienne) l&#39;élargissement des raies de 50-100 Hz, et de faire une transformée de Fourier pour générer un spectre RMN de l&#39;intensité du signal par rapport à blindage chimique (ppm). </li><li> Référence du produit chimique C 13 quarts de travail à l&#39;extérieur en utilisant ensemble l&#39;adamantane à 38,4 ppm (-CH 2 - groupe) 8 en tant que norme. </li><li> Augmenter la fréquence du rotor de filature à 15 kHz et répéter la mesure CPMAS (étapes 4.6-4.8) correspondant à la condition de Hartmann-Hahn correspondant à cette fréquence déterminée ci de tourner. </li><li> Repeles expériences CPMAS (étapes 4.1-4.9) avec naturelles (cire) et partiellement déparaffiné échantillons de fruits cuticules. </li></ol> 5. Sondage de la surface de la cuticule de tomates avec la microscopie à force atomique (Digital Instruments Nanoscope IIIa; procédures varient légèrement entre les microscopes) 6 <ol><li> Allumez le microscope à sonde locale (SPM) (Fig. 2) et assurez-vous que le commutateur de mode microscope toggle est définie sur la microscopie à force de contact atomique (AFM) mode. </li><li> Manuellement relever la tête en tournant ses SPM deux boutons avant réglables par l&#39;utilisateur. Détachez le tipholder AFM de la tête SPM en tournant la vis de serrage à l&#39;arrière de la tête. </li><li> Utilisez des pinces pour enlever le cantilever AFM existant de la tipholder, puis soigneusement prendre un nouveau levier silicium nitrure (AFM sonde) de son emballage et installez-le à la place de l&#39;ancienne porte à faux. Utilisation d&#39;un microscope optique pour vérifier que le cantilever nouvellement installé AFM ne se décompose pas. </li><li> Fixez el&#39;échantillon e cuticule de la tomate (une section de la cuticule de tomate partiellement déparaffinée ~ 10 mm x 10 mm) à un disque en acier inoxydable (échantillon rondelle) avec un adhésif double face. Utiliser un microscope optique pour vérifier que le surface de la cuticule reste plane et lisse après le placement de l&#39;échantillon sur la rondelle. </li><li> Placer la rondelle avec l&#39;échantillon cuticule de tomate sur la région magnétique au sommet du scanner SPM. </li><li> Définissez les deux vis de réglage manuel avant de le scanner haute en tournant les boutons; régler la vis de réglage arrière motorisé à environ le même niveau que les deux autres vis à l&#39;avant. Assurez-vous que tous les trois vis sont suffisamment élevés pour éviter de casser la pointe de l&#39;AFM lors de la passation de la tipholder dans la tête de SPM. </li><li> Réinsérez le tipholder dans la tête de SPM et le fixer en serrant la vis de serrage à l&#39;arrière de la tête. </li><li> Après avoir allumé le laser, aligner le spot laser sur le cantilever AFM en utilisant la centrale (y) et de droite (x) boutons de réglage laser sur le dessus de la tête.Surveiller le faisceau laser réfléchi sur un morceau de papier pour positionner le spot laser exactement à la fin du cantilever AFM. </li><li> Ajuster la position du miroir mobile itérative en utilisant les boutons de réglage de photodétecteur pour obtenir un signal maximal (signal SUM), assurant ainsi que le faisceau laser réfléchi est reçu par uniformément les quatre quadrants de la photodétecteur. </li><li> Abaissez la pointe de l&#39;AFM en rétractant les vis manuelles avant d&#39;ajustement et de la vis de réglage arrière motorisé du scanner SPM, contrôler visuellement l&#39;approche de la pointe de l&#39;AFM vers la surface de l&#39;échantillon avec un microscope inversé. Assurez-vous que tous les trois vis sont au même niveau pour éviter les artefacts de l&#39;imagerie d&#39;un échantillon incliné. Apportez la pointe vers l&#39;échantillon, mais pas si proche que les touches de pointe ou des ruptures à travers la surface de l&#39;échantillon. </li><li> À ce stade, la lumière laser réfléchie par le cantilever AFM rebondir sur le miroir mobile vers le photodétecteur. Pour le mode de contact AFM avec un siliconecon nitrure AFM pointe, régler le signal de sortie (Déviation verticale) de tension à -2 V pour une valeur de consigne 0 V et le signal DIFF (vertical / horizontal de différence) à 0 V en ajustant la position du miroir. </li><li> Utilisation du logiciel Nanoscope, cliquez sur l&#39;icône loupe et sélectionnez le profil approprié (Contact Mode AFM). </li><li> Utilisation de la &quot;commandes de numérisation Paramètres&quot; du panneau, réglez la vitesse de balayage et par exemple la taille de numérisation, de 10 microns format de numérisation et 2 vitesse de balayage Hz. </li><li> Laisser la pointe d&#39;AFM pour engager la surface de l&#39;échantillon en cliquant sur l&#39;icône engager pointe. En contrôlant la vis arrière motorisé de la base de SPM, le programme va maintenant diminuer la pointe jusqu&#39;à ce qu&#39;elle s&#39;engage dans la surface de l&#39;échantillon. Le processus de numérisation démarre automatiquement une fois la pointe a engagé avec succès. </li><li> Surveiller le processus de numérisation à l&#39;aide des deux modes d&#39;image et de la portée du logiciel, le réglage des paramètres tels que la consigne, gain intégral, gain proportionnel, la taille de numérisation, vitesse de balayage, des lignes et des échantillons / ligne de manière itérative pour réaliser la plus forteimages à haute résolution. Démarrer le balayage avec une grande plage de l&#39;axe z (échelle de données); ensuite soigneusement réduire la valeur de l&#39;échelle des données d&#39;observer le meilleur contraste de caractéristiques de surface sur l&#39;image. Minimiser l&#39;apparition de zones blanches de l&#39;image numérisée, qui indiquent que la hauteur des éléments de surface est supérieure à la disposition de l&#39;axe z plage. </li><li> Capturer l&#39;image pour enregistrer le fichier de données, puis traiter les données en utilisant des fonctions d&#39;aplatissement pour supprimer les artefacts d&#39;image dus à la dérive de balayage vertical (Z), des arcs d&#39;image, et décalage vertical entre les lignes de balayage, 9 enfin calculer la rugosité moyenne. Après avoir enregistré les données, rétracter la pointe de l&#39;AFM en inversant l&#39;action du moteur vis commandé par ordinateur qui a été utilisé pour l&#39;engager. Traitement de l&#39;image peut être effectuée en mode déconnecté d&#39;analyse d&#39;images et / ou en utilisant un autre ordinateur. </li><li> Utilisez les boutons avant de fond en métal gris de la porte-embout à changer les positions x et y de la zone de numérisation, puis répéter la mesure à cinq loca échantillontions pour vérifier la reproductibilité, le remplacement de la console AFM si la qualité d&#39;image se détériore. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Analyse du déplacement chimique de la CPMAS 13 spectres RMN C (Fig. 3) a identifié les principaux groupes fonctionnels présents dans la cuticule de tomate exhaustive déparaffinées (cutine). Les fragments de carbone clés dans le biopolyester cutine ont été jugés à longue chaîne aliphatiques (0-45 ppm), aliphatiques oxygénés (45-110 ppm), se multiplient-collés et aromates (110-160 ppm), et carbonyles (160-220 ppm). Les groupements oxygénés alkyle (CHO + CH 2 O) jouent un rôle crucial dans l&#39;établissement de connexions covalentes entre les unités monomères de cutine le biopolymère, formant ainsi l&#39;architecture moléculaire de la matrice cutine. Les différences dans les surfaces relatives des pics observés dans la région spectrale entre 45 et 100 ppm suggèrent que la cutine mutant a une proportion relativement importante de cross-link structura formation CHO<html> fractions l par rapport à la de type sauvage cutine; minutieuses des mesures quantitatives en utilisant la polarisation directe (DPMAS) RMN 5 méthodes appuyer cette conclusion (données non présentées). CPMAS 13 C RMN également de la cire présente un pic progressivement dégressif à 31 ppm (fig. 4), indiquant l&#39;élimination séquentielle d&#39;épi-et cires intracuticular à partir du composite cutine-cire, tout en conservant l&#39;architecture chimique principal du biopolymère cutine. Parallèlement l&#39;analyse d&#39;image AFM (Fig. 5) a révélé des irrégularités de surface dues à l&#39;extraction progressive des épi-et cires intracuticular de la cuticule des fruits, ce qui signifie des modifications dans l&#39;organisation de l&#39;assemblée cuticulaire. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig1.jpg" /> . Figure 1 extracteur Soxhlet (source image: Wikipedia). &quot;/&gt; Figure 2. Un microscope) sonde à balayage. B) la tête SPM (adapté du manuel de formation fournis par l&#39;AFM Digital Instruments). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig3.jpg" /> Figure 3. 150 MHz CPMAS 13 C RMN de manière exhaustive déparaffinées rouges mûrs cuticules fruits de tomate (enclenchements) de type sauvage (M82) et mutant (CM15) montrent des résonances avec les déplacements chimiques correspondant à des groupes fonctionnels d&#39;un acide gras hydroxy réticulé à base de polyester et aussi quelques fragments se multiplient en servitude. Tous les spectres ont été acquis avec une fréquence de 10 kHz de filage. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig4.jpg" /> Figure 4. 150 MHz 13 CCPMAS spectres RMN commerciaux rouges mûrs cuticules fruits de tomate présentent des changements de composition lors de l&#39;enlèvement séquentiel des cires épicuticulaires et intracuticular par la gomme extraction mécanique arabe et un two minutes dip chloroforme, respectivement. Tous les spectres ont été acquis avec une fréquence de 15 kHz de filage. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig5.jpg" /> Figure 5. Images AFM et les estimations de rugosité pour la tomate partiellement déparaffinée commerciale cuticules décrit dans la figure 4, après le retrait par étapes des épicuticulaires (à gauche) et intracuticular (à droite) les cires.

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A. 106, 127-131 (1994).</li><li>lessandrini, A., Facci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM:+a+versatile+tool+in+biophysics.">AFM: a versatile tool in biophysics.</a> Measurement Sci. &#38; Tech. 16, 10-1088 (2005).</li><li>Ben&#237;tez, J. J., Matas, A. J., Heredia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+plant+biopolyester+cutin+by+AFM+and+spectroscopic+techniques.">Molecular characterization of the plant biopolyester cutin by AFM and spectroscopic techniques.</a> J. Struct. Biol. 147, 179-184 (2004).</li><li>Koch, K., Neinhuis, C., Ensikat, H. J., Barthlott, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self+assembly+of+epicuticular+waxes+on+living+plant+surfaces+imaged+by+atomic+force+microscopy+(AFM).">Self assembly of epicuticular waxes on living plant surfaces imaged by atomic force microscopy (AFM).</a> J. Exper. Bot. 55, 711-718 (2004).</li><li>Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM:+A+Nanotool+in+Membrane+Biology.">AFM: A Nanotool in Membrane Biology.</a> Biochemistry. 47, 7986-7998 (2008).</li><li>Last, J. A., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Applications+of+Atomic+Force+Microscopy+to+Vision+Science.">The Applications of Atomic Force Microscopy to Vision Science.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 51, 6083-6094 (2010).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Les protocoles décrits ici permettent pour la caractérisation moléculaire et micro-détaillée d&#39;un matériel végétal insoluble complexe sans la nécessité d&#39;une décomposition chimique destructrice. Pour enquêter sur le mélange de l&#39;biopolyester cutine avec différents lipides (cires) qui contrôlent l&#39;organisation structurelle de l&#39;ensemble cuticulaire, 10 nous avons effectué et contrôlé les procédures pour l&#39;élimination sélective des cires épicuticulaires et intracuticular à partir du mélange hétérogène cuticulaire. Solid-state 13 C RMN a été utilisée pour évaluer l&#39;extraction de composants de cire moléculaires, et microscopie à force atomique a permis d&#39;examiner des changements concomitants dans la rugosité de surface. 6,11 Afin de comparer les capacités de réticulation de deux enclenchements de cultivé de type sauvage et un seul gène des fruits de tomate mutantes, à l&#39;état solide 13 C RMN a aussi été utilisée pour estimer les nombres relatifs de CHO et CH 2 O des groupements chimiques. Un certain nombre de caractéristique de conceptions de ce protocole sont remarquables. Comme les matériaux de cire englobent un large éventail de lipides, le traitement de la cuticule des fruits avec une série de solvants de polarités divergentes est essentielle pour atteindre déparaffinage exhaustive. En outre, le temps de déparaffinage peut varier de 8 heures à 24 heures, selon la nature des échantillons cuticules. Pour extraire les cires épicuticulaires toujours de la cuticule des fruits intacts, il est impératif d&#39;appliquer le revêtement adhésif uniformément à la surface. À l&#39;état solide CPMAS 13 C RMN 12 est une méthode qualitative rapide pour identifier les différents composants structuraux de biopolymères d&#39;origine végétale très hétérogènes et insolubles, tout en préservant leurs caractéristiques physiques autochtones, 13 solution traditionnelle RMN à l&#39;état peut également être utilisée pour caractériser les mélanges de cires extraites. Si l&#39;estimation quantitative des groupes fonctionnels est souhaitée pour les polymères végétaux intacts, 5 de haute fidélité directe de polarisation à l&#39;angle magique de filage (DPMAS) RMN 13 C 5,14 doit être utilisé comme un procédé complémentaire. Une quantification précise des groupes fonctionnels exige une optimisation minutieuse des temps de recyclage, les longueurs d&#39;impulsion d&#39;excitation, et la force de découplage hétéronucléaire 15. Le découplage hétéronucléaire peut être réglé pour une résistance à la 1 champ H allant de 50 kHz à 185 kHz en utilisant le TPPM 16 ou SPINAUX 7 méthodologies. En plus de ces paramètres, la sensibilité des mesures CPMAS dépend de la durée de rotation de verrouillage et de Hartmann-Hahn condition de correspondance 15. Au lieu de CPMAS traditionnels, une rampe d&#39;amplitude CP (RAMP-CP) technique peut être mis en œuvre pour maximiser la croix l&#39;efficacité de polarisation en faisant varier l&#39;amplitude du 1 H linéairement (~ 20-50%) ou tangentiellement tout en conservant l&#39;amplitude de l&#39;intensité de champ en C 13 constante pendant la période de rotation de verrouillage (ou vice versa). 17,18 Mise en oeuvre des mesures CPMAS à un minimum de deux ro différenteteur de filage fréquences est impératif de distinguer des bandes latérales de filage à partir des pics principaux spectrales. Simultanées mesures AFM effectuées en mode contact permettre l&#39;imagerie directe de l&#39;état surface de la cuticule avec des vitesses de numérisation et haute résolution, 19 par exemple lors du retrait séquentiel de constituants cireux. D&#39;exploitation en tapant l&#39;AFM (sans contact) mode peut être utilisé comme une alternative pour la caractérisation des surfaces délicates de &quot;soft&quot; de matières végétales, en évitant de possibles dommages à cause de latéraux (cisaillement) et les forces de raclage de la surface de l&#39;échantillon. 5,20 Dans les deux cas , l&#39;acquisition séquentielle de plusieurs images de la même tache sur la surface sert à identifier tout dommage de surface en raison de &quot;sonde-surface interactions&quot; dans les mesures AFM. 6,21 Pour une reproductibilité optimale, sondes AFM avec des constantes de ressort approprié pour souples surfaces cuticulaires devrait être utilisé, et la constance de la température et l&#39;humidité doivent être maintenues. 6,15,20 </sjusqu&#39;à&gt; considérant que l&#39;état solide RMN offre un profil moléculaire d&#39;ensemble moyenne (en vrac) des biens immobiliers à cuticules de fruits de tomate, de l&#39;imagerie à force atomique fournit une sonde complémentaire non invasive 22,23 pour le suivi de la topographie de la surface de ces assemblages macromoléculaires complexes exquise. 1,2

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog no.</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8625-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pectinase</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>P0026</td>
			<td>EC 3.2.1.15; 10 U ml-1, store in refrigerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1184-100KU</td>
			<td>EC232.734.4; 1.3 units/mg, store in refrigerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9967</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-100G</td>
			<td>Extremely hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator/shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific Co.</td>
			<td>Model No.G24</td>
			<td>MFG No.M1036-000G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Oven</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>31566</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variac Controller</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sintered glass thimble (85 mm/25mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89056</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable extraction thimble ( 80 mm/ 25 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28320</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EMD-MX0485-7</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>VWR</td>
			<td>RK20789</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>01-213-100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-452</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-CX1050-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H302-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89002-984</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim wipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21905-026</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum arabic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9752</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.6 mm fastMAS zirconia rotor</td>
			<td>Varian (Agilent)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR spectrometer</td>
			<td>Varian 600 NMRS</td>
			<td>standard bore magnet</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50046</td>
			<td>Model compound for CPMAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49419</td>
			<td>Model compound for CPMAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adamantane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100277</td>
			<td>To calibrate 90&deg; pulse in NMR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode Scanning Probe Microscope (Nanoscope IIIA)</td>
			<td>Digital Instruments (Bruker AXS)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoscope software</td>
			<td>Digital Instruments (Bruker AXS)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Version 5.30r3sr3 (2005)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM probe (Nonconductive silicon nitride tip)</td>
			<td>Veeco (Bruker AXS)</td>
			<td>Model NP-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Digital Instruments</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic puck</td>
			<td>Digital Instruments</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fruit Peeler</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&uuml;chner funnel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and biophysical study of fruit cuticles

La cuticule, une couche hydrophobe de protection sur les parties aériennes de plantes terrestres, les fonctions comme une barrière défensive polyvalent à divers stress biotiques et abiotiques et elle réglemente également le débit d&#39;eau de l&#39;environnement extérieur. 1 A biopolyester (cutine) et à longue chaîne d&#39;acides gras ( cires) forment le cadre principal de la structure de la cuticule; l&#39;intégrité fonctionnelle de la couche cuticulaire dépend le monde extérieur »épicuticulaire« couche ainsi que le mélange constitué du biopolymère cutine et des cires intracuticular des 2 des présentes, nous décrivons un protocole complet. pour extraire les cires exhaustive de tomate du commerce (Solanum lycopersicum) de fruits ou de cuticules pour éliminer les cires et épicuticulaires intracuticular séquentiellement et de manière sélective à partir du composite cuticule. La méthode de Jetter et Schäffer (2001) a été adapté pour l&#39;extraction progressive des cires épicuticulaires et intracuticular de la cuticule des fruits. 3,4 Pour surveiller l&#39;processus d&#39;élimination de la cire séquentielle, à l&#39;état solide polarisation croisée à l&#39;angle magique de filage (CPMAS) 13 C RMN a été utilisée en parallèle avec la microscopie à force atomique (AFM), en fournissant à l&#39;échelle moléculaire profils structurels des matériaux en vrac, complétées par des informations sur la topographie et de micro-rugosité des surfaces cuticulaires. Pour évaluer les capacités de réticulation de cuticules de déparaffinées cultivées de type sauvage et un seul gène tomates mutantes, MAS RMN du 13 C a été utilisé pour comparer les proportions relatives d&#39;hydrocarbures aliphatiques oxygéné (CHO et CH 2 O) des groupements chimiques. Déparaffinage exhaustive par extraction Soxhlet par étapes avec un panel de solvants de polarité variable fournit un moyen efficace pour isoler des fragments de cire sur la base des caractéristiques hydrophobes de leur aliphatiques et constituants aromatiques, tout en préservant la structure chimique de la cutine biopolyester. L&#39;extraction mécanique de cires épicuticulaires and Selel&#39;élimination des cires ctive intracuticular, lors des contrôles par des méthodes physiques complémentaires, constitue un moyen sans précédent pour enquêter sur l&#39;ensemble de la cuticule: cette approche révèle l&#39;organisation supramoléculaire et l&#39;intégration structurelle des différents types de cires, de l&#39;architecture de la matrice cutine la cire, et le produit chimique Composition de chaque constituant. En outre, à l&#39;état solide 13 C RMN révèle des différences dans les nombres relatifs de CHO et CH 2 O des groupements chimiques de type sauvage et mutant fruits rouges tomate bien mûre. Les techniques de RMN à offrir des outils exceptionnels empreinte la structure moléculaire de matériaux qui sont insolubles cuticulaires, amorphe, et chimiquement hétérogène. Comme une technique d&#39;imagerie non invasive surface sélective, l&#39;AFM fournit un moyen direct et efficace pour sonder l&#39;organisation structurelle de l&#39;ensemble cuticulaire sur l&#39;échelle de longueur nm-um.

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Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

Organes de la plante aériennes sont protégés par la cuticule, un supramoléculaire biopolyester la cire de montage. Nous présentons les protocoles à suivre l&#39;élimination sélective des épi-et cires intracuticular de cuticules de fruits de tomate sur des échelles moléculaires et micro par RMN du solide et la microscopie à force atomique, respectivement, et d&#39;évaluer la capacité de réticulation de génie biopolyesters cuticulaires.

Isolement et étude biophysique des cuticules de fruits

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

isolation-and-biophysical-study-of-fruit-cuticles

Research

JoVE Journal

Biology

16.6K vues.  City College of New York, City University of New York Graduate Center and Institute for Macromolecular Assemblies. Organes de la plante aériennes sont protégés par la cuticule, un supramoléculaire biopolyester la cire de montage. Nous présentons les protocoles à suivre l'élimination sélective des épi-et cires intracuticular de cuticules de fruits de tomate sur des échelles moléculaires et micro par RMN du solide et la microscopie à force atomique, respectivement, et d'évaluer la capacité de réticulation de génie biopolyesters cuticulaires.

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Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Test sensibilité visuelle à la vitesse et la direction du mouvement chez les lézards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Recherche

Biologie

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources. This complex social behavior is influenced by genetic, hormonal and environmental factors. In many organisms, aggression is critical to survival but controlling and suppressing aggression in distinct contexts also has become increasingly important. In recent years, invertebrates have become increasingly useful as model systems for investigating the genetic and systems biological basis of complex social behavior. This is in part due to the diverse repertoire of behaviors exhibited by these organisms. In the accompanying video, we outline a method for analyzing aggression in Drosophila whose design encompasses important eco-ethological constraints. Details include steps for: making a fighting chamber; isolating and painting flies; adding flies to the fight chamber; and video taping fights. This approach is currently being used to identify candidate genes important in aggression and in elaborating the neuronal circuitry that underlies the output of aggression and other social behaviors.

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

Etudier l&#39;agressivité chez les drosophiles (mouches des fruits)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

Isolement et purification de Drosophile Neurones périphériques en triant bille magnétique

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Les articles inclus en paraffine et congelés de Drosophile</emMuscles adultes>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit aroma. Maturity at harvest is one of the key factors influencing the flavor quality of fruits and vegetables1. The validation of robust methods that rapidly assess fruit maturity and aroma quality would allow improved management of advanced breeding programs, production practices and postharvest handling. 
Over the last three decades, much research has been conducted to develop so-called electronic noses, which are devices able to rapidly detect odors and flavors2-4. Currently there are several commercially available electronic noses able to perform volatile analysis, based on different technologies. The electronic nose used in our work (zNose, EST, Newbury Park, CA, USA), consists of ultra-fast gas chromatography coupled with a surface acoustic wave sensor (UFGC-SAW). This technology has already been tested for its ability to monitor quality of various commodities, including detection of deterioration in apple5; ripeness and rot evaluation in mango6; aroma profiling of thymus species7; C6 volatile compounds in grape berries8; characterization of vegetable oil9 and detection of adulterants in virgin coconut oil10. 
This system can perform the three major steps of aroma analysis: headspace sampling, separation of volatile compounds, and detection. In about one minute, the output, a chromatogram, is produced and, after a purging cycle, the instrument is ready for further analysis. The results obtained with the zNose can be compared to those of other gas-chromatographic systems by calculation of Kovats Indices (KI). Once the instrument has been tuned with an alkane standard solution, the retention times are automatically converted into KIs. However, slight changes in temperature and flow rate are expected to occur over time, causing retention times to drift. Also, depending on the polarity of the column stationary phase, the reproducibility of KI calculations can vary by several index units11. A series of programs and graphical interfaces were therefore developed to compare calculated KIs among samples in a semi-automated fashion. These programs reduce the time required for chromatogram analysis of large data sets and minimize the potential for misinterpretation of the data when chromatograms are not perfectly aligned.
We present a method for rapid volatile compound analysis in fruit. Sample preparation, data acquisition and handling procedures are also discussed.

A rapid method for volatile compound analysis in fruit is described. The volatile compounds present in the headspace of a homogenate of the sample are rapidly separated and detected with ultra-fast gas chromatography (GC) coupled with a surface acoustic wave (SAW) sensor. A procedure for data handling and analysis is also discussed.

Analyse de fruits instable avec un nez électronique

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Capture d&#39;sélectif de 5-hydroxyméthylcytosine partir de l&#39;ADN génomique

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

Super-resolution Imaging Division de la machinerie bactérienne

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Mesure des taux métabolique dans<em&gt; Drosophila</em&gt; En utilisant Respirométrie

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.

Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.

Caractérisation biophysique des fonctions flagellaire moteur

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation of an adaptive immune response. Experimental work with these cells is rather challenging. Their abundance in organs and tissues is relatively low. As a result, they cannot be isolated in large numbers. They are also difficult to transfect with cDNA constructs. In the murine model, these problems can be partially overcome by in vitro differentiation from bone marrow progenitors in the presence of M-CSF for macrophages or GM-CSF for dendritic cells. In this way, it is possible to obtain large amounts of these cells from very few animals. Moreover, bone marrow progenitors can be transduced with retroviral vectors carrying cDNA constructs during early stages of cultivation prior to their differentiation into bone marrow derived dendritic cells and macrophages. Thus, retroviral transduction followed by differentiation in vitro can be used to express various cDNA constructs in these cells. The ability to express ectopic proteins substantially extends the range of experiments that can be performed on these cells, including live cell imaging of fluorescent proteins, tandem purifications for interactome analyses, structure-function analyses, monitoring of cellular functions with biosensors and many others. In this article, we describe a detailed protocol for retroviral transduction of murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages with vectors coding for fluorescently-tagged proteins. On the example of two adaptor proteins, OPAL1 and PSTPIP2, we demonstrate its practical application in flow cytometry and microscopy. We also discuss the advantages and limitations of this approach.

In this article, we provide a detailed protocol for the expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages. The method is based on the transduction of bone marrow progenitors with retroviral constructs followed by differentiation into macrophages and dendritic cells in vitro.

Expression des protéines de Fusion Fluorescent en Murine dérivés de la moelle osseuse des cellules dendritiques et Macrophages

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...