Cette méthode démontre l’utilisation de cellules AML-12 qui permettront la construction de modèles et l’étude des effets protecteurs de la platycodine D sur la NAFLD. La dépendance excessive à l’égard de l’utilisation de modèles animaux augmente le fardeau du développement de médicaments thérapeutiques. L’utilisation de modèles cellulaires au stade précoce du développement de médicaments NAFLD est plus pratique et rentable.
Ce modèle de MTC peut aider à améliorer la compréhension de la fonction biologique de la platycodine D et à étudier l’utilisation d’autres MTC pour le traitement de la NAFLD. Commencez par ensemencer un millilitre de cellules AML-12 par puits dans des plaques de 12 puits. Ensuite, divisez la plaque de 12 puits en quatre groupes de traitement différents et étiquetez-les comme groupe témoin, traité par MP, traité PA et PA plus traité.
Ajouter un millilitre de milieu de culture cellulaire normal par puits au groupe témoin et au groupe traité par MP. Ajouter un millilitre de milieu de culture cellulaire normal complété par 300 micromolaires d’acide palmitique au groupe traité PA et PA plus traité. Après 24 heures d’incubation, retirez le milieu de culture des cellules, puis lavez les cellules avec un millilitre de milieu sans sérum deux fois.
Ensuite, ajoutez un millilitre de milieu de culture cellulaire normal complété avec un véhicule au groupe témoin et un millilitre de milieu de culture cellulaire normal complété par une platycodine D micromolaire au groupe traité par MP. Ajouter un millilitre de milieu de culture cellulaire normal supplémenté avec 300 micromolaires d’acide palmitique au groupe traité PA et un millilitre de milieu de culture cellulaire normal complété par 300 micromolaires d’acide palmitique et une micromolaire platycodine D au groupe traité PA plus. Après avoir traité les cellules pendant 24 heures, lavez les cellules avec un millilitre de 1X PBS par puits trois fois.
Colorez ensuite les cellules avec 100 microlitres de 10 micromolaires DCFH-DA par puits. Incuber les cellules dans l’obscurité pendant 30 minutes. Après l’incubation, lavez les cellules avec 1X PBS trois fois et ajoutez un millilitre de 1X PBS à chaque puits.
Placez la plaque à 12 puits sur la platine du microscope et utilisez un objectif 20X pour observer la morphologie des cellules à un grossissement de 200X. Pour mesurer le potentiel de la membrane mitochondriale, lavez trois fois les cellules traitées préparées plus tôt avec un millilitre de 1X PBS par puits. Ensuite, colorez les cellules avec 100 microlitres de solution de travail JC-1 de cinq microgrammes par millilitre et incuber les cellules pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans l’obscurité.
Ensuite, lavez les cellules avec 1X PBS trois fois et ajoutez un millilitre de 1X PBS à chaque puits. Placez la plaque à 12 puits sur la platine du microscope et utilisez un objectif 20X pour observer la morphologie des cellules à un grossissement de 200X. Lyser les cellules traitées et recueillir le lysat cellulaire dans des tubes microcentrifugés de 1,5 millilitre.
Centrifuger les tubes à 12 000 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Ajoutez ensuite un tampon de chargement d’échantillon 5X SDS-PAGE au surnageant de lysat cellulaire à un rapport de volume de un à quatre. Ensuite, placez le gel SDS-PAGE à 12% préparé avec 12 puits dans le réservoir d’électrophorèse et ajoutez 1X SDS up tampon d’échantillon dilué avec de l’eau ultrapure à la limite de hauteur recommandée.
Après électrophorèse SDS-PAGE, effectuer le transfert électro des protéines vers une membrane PVDF de 0,45 micron. Incuber la membrane dans cinq millilitres d’anticorps primaires dilués dans un tampon de blocage. Utilisez des anticorps spécifiques pour LC-III, p62 et bêta-actine.
Incuber pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Incuber ensuite la membrane PVDF avec l’anticorps secondaire LGG HRP anti-souris lapin dilué un à 10 000 dans un tampon de blocage. Incuber la membrane à température ambiante à l’abri de la lumière pendant deux heures.
Après l’incubation, placez la membrane de PVDF sur une pellicule de plastique. Ajouter une quantité appropriée de solution de travail ECL et incuber pendant deux minutes. Retirez ensuite la solution de travail ECL et exposez la membrane PVDF dans le système d’imagerie pour le développement d’images.
La coloration DCFH-DA a montré que la platycodine D pouvait réduire de manière significative le niveau de ROS intracellulaire dans les cellules ALM-12, indiquant que ce traitement peut réduire le stress oxydatif cellulaire. De plus, la fluorescence verte représentant les monomères JC-1 ou les mitochondries dépolarisées était plus élevée dans les cellules traitées à l’acide palmitique que dans les cellules non traitées, tandis que la fluorescence rouge représentant les dimères JC-1 ou les mitochondries polarisées était plus faible dans les cellules traitées à l’acide palmitique que dans les cellules non traitées, indiquant une dépolarisation MMP induite par l’acide palmitique. De plus, par rapport au groupe témoin, le rapport des monomères JC-1 aux dimères a diminué dans le groupe de traitement par platycodine D, ce qui indique qu’il pourrait améliorer la MMP induite par l’acide palmitique.
Les niveaux d’expression protéique des protéines LC-III et p62 liées à l’autophagie ont été étudiés par transfert Western. Le rapport LC-32/LC-31 a significativement diminué et le niveau d’expression protéique de p62 a augmenté après avoir été traité avec de l’acide palmitique. D’autre part, la platycodine D a significativement réduit le niveau d’expression protéique de p62 et augmenté le rapport LC-32/LC-31, indiquant la restauration du flux autophagique induit par l’acide palmitique.
Si la valeur de fluorescence des cellules du groupe témoin négatif est relativement élevée, les concentrations de travail des sondes fluorescentes peuvent être ajustées au besoin.
