Notre protocole est significatif parce qu’il permet aux chercheurs d’étudier le mécanisme moléculaire de l’angiogenèse coronaire en dehors d’un organisme. Le principal avantage de cette technique est qu’elle modèle avec précision le processus d’angiogenèse coronaire à l’intérieur d’un organisme, facilitant l’étude des mécanismes de l’angiogenèse coronaire. Commencez par pulvériser une souris enceinte portant des embryons de jour 11,5 embryons avec 70% d’éthanol.
Soulevant la peau sur le ventre avec des forceps, utilisez des ciseaux pour faire une peau abdominale et une incision péritonéale latéralement et antérieurement jusqu’au diaphragme pour exposer la corne utérine. Saisir l’utérus, couper le tissu librement et retirer la corne utérine. Placez la chaîne d’embryons dans le PBS stérile glacé sous un microscope stéréo, et épluchez le muscle utérin, le sac de jaune, et le couvercle d’amnion de chaque embryon.
Au fur et à mesure que chaque embryon est isolé, utilisez une cuillère perforée pour transférer les tissus dans une nouvelle boîte de Pétri contenant du PBS stérile sur la glace. Pour récolter le tissu cardiaque embryonnaire, transférez le premier embryon à être disséqué dans une nouvelle boîte de Pétri sous le microscope, et placez l’embryon dans le côté ventral vers le haut. Utilisez des forceps fins pour faire une petite incision dans la poitrine, légèrement au-dessus du diaphragme, et insérez les forceps fermés dans l’incision pour agrandir l’incision.
En utilisant les forceps pour maintenir la paroi thoracique ouverte pour exposer le cœur et les poumons, utilisez une deuxième paire de forceps pour déplacer doucement le cœur antérieurement 90 degrés pour exposer l’aorte dorsale et la veine. Puis, saisissant ces vaisseaux à la base du cœur, retirez soigneusement le cœur et les poumons antérieurement et rincez les tissus avec du PBS froid. Lorsque tout le tissu cardiaque a été récolté, placez les échantillons cardiaques sous le microscope et retirez les lobes pulmonaires de chaque cœur.
Orientez le premier cœur sur son côté dorsal, et en tenant le cœur à sa base, utilisez des forceps fins pour gratter les atrias gauche et droite dans le tissu adjacent entourant le SV du cœur. Pour isoler le SV, orientez le côté dorsale du cœur vers le haut. Retirez soigneusement le SV du cœur et utilisez une pipette de transfert stérile pour placer le tissu isolé dans une nouvelle boîte de Petri de six centimètres contenant du PBS stérile glacé sur la glace.
Pour isoler l’ensemble des ventricules, retirez le tractus sortant et utilisez une nouvelle pipette de transfert stérile pour placer les ventricules dans une boîte de Petri séparée de six centimètres contenant du PBS stérile glacé sur la glace. Pour mettre en place des cultures de SV et de ventricules entiers, enduire d’abord les membranes d’un insert de culture PET de huit micromètres pore par puits d’une plaque de culture de puits de 24 puits, avec 100 microlitres de matrice extracellulaire fraîchement diluée par culture pendant au moins 30 minutes à 37 degrés Celsius. Lorsque la matrice s’est solidifiée, utilisez une pipette de transfert pour transférer une explantation sur chaque insert et déplacez la plaque au microscope.
À l’aide de forceps propres, placez les explants au centre de chaque insert pour s’assurer qu’ils ne sont pas fixés aux parois latérales, et retirez soigneusement tout PBS supplémentaire. Ensuite, transférez la plaque avec le couvercle fermé sous un capot de culture de tissu d’écoulement laminaire, et ajoutez 100 microlitres de milieu complet préchauffé à chaque insert, et 200 microlitres au puits au-dessous de chaque insert. Ajouter ensuite 300 microlitres de PBS à tous les puits inutilisés, et placer la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant cinq jours.
Pour le traitement VEGF-A le deuxième jour de la culture, retirez le milieu des deux chambres de chaque culture et ajoutez 100 microlitres de PBS à chaque insert, et 200 microlitres de PBS à chaque puits. Après avoir tourbillonné la plaque à quelques reprises, remplacer le PBS par 300 microlitres de milieu basal complété par 1% de sérum bovin fœtal pour démarrer les cultures, et retourner la plaque à l’incubateur. Le troisième jour après la famine, ajouter 300 microlitres de milieu basal frais plus sérum aux puits de contrôle et au milieu basal plus 50 nanogrammes par millilitre de VEGF-A aux puits de traitement, et retourner la plaque à l’incubateur de culture cellulaire.
Le sixième jour de la culture, laver les chambres avec PBS comme démontré, et fixer les cultures avec 200 microlitres de 4% paraformaldéhyde dans chaque puits, et 100 microlitres de fixatif dans chaque insert. Après 20 minutes à 4 degrés Celsius avec basculement, laver les cultures avec 300 microlitres de PBS pendant 10 minutes par lavage avec basculement à température ambiante. Après le dernier lavage, ajouter 300 microlitres de solution d’anticorps primaires aux puits et des inserts pour une culture nocturne à quatre degrés Celsius avec basculement.
Le lendemain matin, lavez les cultures 10 fois dans du surfactant non ionique en PBS avec du basculement, en changeant la solution de lavage toutes les 10 minutes avant d’étiqueter les cultures avec 300 microlitres d’un anticorps secondaire conjugué fluorophore approprié à quatre degrés Celsius pendant la nuit avec le basculement. Le lendemain, lavez les cultures 10 fois en PBS frais avec du surfactant non ionique comme démontré. Après le dernier lavage, utilisez des forceps fins pour peler soigneusement la membrane de chaque insert et placer les membranes sur des glissières individuelles au microscope en verre, explanter le côté vers le haut.
Couvrez les échantillons avec le milieu de montage complété par DAPI dans un glissement de couverture, et scellez les bords des glissements de couverture avec le vernis à ongles clair. Lorsque le vernis à ongles a séché, imagez les diapositives par microscopie confoccale. Comme les cellules SV initiales se développent sur le ventricule cardiaque, elles cessent de produire des marqueurs veineux tels que Coup-TF2.
Après cinq jours de culture, les cellules endothéliales SV poussent et migrent sur la membrane. Comme dans le cœur embryonnaire, l’expression coup-TF2 est réduite à mesure que les vaisseaux migrent loin du SV. Les cultures stimulées par vegf-A présentent une croissance accrue des germes angiogéniques à la fois en densité et en longueur. D’autres cultures de SV stimulées par VEGF-A démontrent une augmentation presque triple de la longueur de pousse comparée aux contrôles, suggérant que les pousses endothéliales du SV et de l’endocardium répondent au VEGF-A.
Il est important de ne pas perdre le tissu SV tout en tirant le cœur et les poumons, en enlevant les atria, et en nettoyant le tissu adjacent entourant le SV. Des expériences d’imagerie en direct peuvent être réalisées pour visualiser l’angiogenèse coronaire et pour capturer les détails de la dynamique cellulaire et moléculaire pendant le processus. Cette technique est extrêmement utile pour évaluer les mécanismes moléculaires potentiels de l’angiogenèse coronaire et comme système modèle pour étudier l’angiogenèse en général.
