Les auteurs tiennent à souligner la contribution de plusieurs personnes et organisations à ce travail. Le laboratoire de thérapie cellulaire et génique et le laboratoire d’études translationnelles et corrélatives de Pennsylvanie ont fourni une aide précieuse pour le développement de processus et la préparation des demandes d’IND. Melissa Varghese et Amanda DiNofia ont contribué à l’élaboration du processus et à la préparation des soumissions d’IND qui sous-tendent ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par une subvention d’accélération du Cell and Gene Therapy Collaborative de l’hôpital pour enfants de Philadelphie. Les auteurs tiennent également à remercier Miltenyi Biotec pour son soutien technique et de recherche. La figure 1 est couverte par le droit d’auteur © 2023 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG ; Tous droits réservés.

Processeur automatisé pour la fabrication de cellules CAR-T à l’échelle clinique

<ol>
	<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tisagenlecleucel+in+children+and+young+adults+with+B-cell+lymphoblastic+leukemia.">Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li><li>Shah, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bispecific+anti-CD20,+anti-CD19+CAR+T+cells+for+relapsed+B+cell+malignancies:+A+phase+1+dose+escalation+and+expansion+trial.">Bispecific anti-CD20, anti-CD19 CAR T cells for relapsed B cell malignancies: A phase 1 dose escalation and expansion trial.</a> Nature Medicine. 26 (10), 1569-1575 (2020).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+humanized+CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+(CAR)-modified+T+cells+in+children+and+young+adults+with+relapsed/refractory+acute+lymphoblastic+leukemia.">Efficacy of humanized CD19-targeted chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cells in children and young adults with relapsed/refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 128 (22), 217 (2016).</li><li>Mock, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+manufacturing+of+CAR-T+cells+for+adoptive+immunotherapy+using+CliniMACS+Prodigy.">Automated manufacturing of CAR-T cells for adoptive immunotherapy using CliniMACS Prodigy.</a> Cytotherapy. 18 (8), 1002-1011 (2016).</li><li>Fern&#225;ndez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GMP-compliant+manufacturing+of+NKG2D+CAR+memory+T+cells+using+CliniMACS+Prodigy.">GMP-compliant manufacturing of NKG2D CAR memory T cells using CliniMACS Prodigy.</a> Frontiers in Immunology. 10 (10), 2361 (2019).</li><li>Zhu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closed-system+manufacturing+of+CD19+and+dual-targeted+CD20/19+chimeric+antigen+receptor+T+Cells+using+CliniMACS+Prodigy+device+at+an+academic+medical+center.">Closed-system manufacturing of CD19 and dual-targeted CD20/19 chimeric antigen receptor T Cells using CliniMACS Prodigy device at an academic medical center.</a> Cytotherapy. 20 (3), 394-406 (2018).</li><li>Zhang, W., Jordan, K. R., Schulte, B., Purev, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+clinical+grade+CD19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+produced+using+automated+CliniMACS+prodigy+system.">Characterization of clinical grade CD19 chimeric antigen receptor T cells produced using automated CliniMACS prodigy system.</a> Drug Design, Development and Therapy. 12 (12), 3343-3356 (2018).</li><li>Abou-El-Enein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+manufacturing+of+CAR+T+cells+for+cancer+immunotherapy.">Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy.</a> Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).</li><li>Miltenyi Biotec. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CliniMACS Prodigy User Manual. , (2021).</li><li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+manufacturing+of+non-activated+potent+CAR+T+cells.">Rapid manufacturing of non-activated potent CAR T cells.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (2), 118-128 (2022).</li><li>U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemistry, manufacturing, and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drug applications (INDs) guidance for industry. , (2020).</li><li>U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Considerations for the development of chimeric antigen receptor (CAR) T cell products draft guidance for industry. , (2022).</li></ol>

S.K., S.G. et Y.W. ont reçu le soutien de Miltenyi Biotec pour leurs recherches.

La thérapie cellulaire CAR-T est apparue comme une approche thérapeutique prometteuse pour les cellules B et d’autres tumeurs malignes. Cependant, les méthodes traditionnelles de fabrication des cellules CAR-T présentent plusieurs limites, telles qu’un coût élevé, une production à forte intensité de main-d’œuvre et des étapes ouvertes qui augmentent le risque de contamination. Récemment, plusieurs plates-formes semi-automatisées, dont Miltenyi CliniMACS Prodigy (le « processeur »), ont vu le jour pou...

Le transfert adoptif de lymphocytes T modifiés pour exprimer un récepteur antigénique chimérique (CAR) a montré une efficacité remarquable dans le traitement des patients atteints de tumeurs malignes à cellules B réfractaires 1,2,3,4,5. Cependant, les méthodes traditionnelles de fabrication des cellules CAR-T sont à forte intensité de main-d’œuvre, prennent beaucoup de temps et nécessitent des techniciens hautement qualifiés pour effectuer des étapes hautement spécialisées. Par exemple, le processus de fabrication traditionnel d’un produit cellulaire CAR-T autologue implique la centrifugation par gradient de densité, l’élutriation ou la séparation magnétique pour enrichir les lymphocytes T, l’activation et la transduction avec un vecteur viral dans un flacon stérile, et l’expansion dans un bioréacteur avant la récolte et la formulation. Divers systèmes ont vu le jour récemment dans le but d’automatiser partiellement ce processus. Par exemple, le Miltenyi CliniMACS Prodigy (ci-après dénommé le « processeur ») est un dispositif de traitement cellulaire automatisé qui peut effectuer un grand nombre de ces étapes de manière automatisée 6,7,8,9. Une discussion approfondie des méthodes de fabrication CAR-T traditionnelles et automatisées est présentée dans un récent article de synthèse10.
Le processeur s’appuie sur les fonctionnalités du CliniMACS Plus, un dispositif médical approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis pour le traitement des cellules progénitrices hématopoïétiques. Le processeur comprend une unité de culture cellulaire qui permet le lavage, le fractionnement et la culture automatisés des cellules (Figure 1). Le processus de transduction des cellules T (TCT) est un programme prédéfini dans le dispositif du processeur qui reproduit en grande partie la fabrication manuelle des cellules CAR-T. TCT permet un traitement personnalisable des cellules à l’aide d’une interface utilisateur graphique (la « matrice d’activité », Figure 2). Étant donné que le processeur automatise de nombreuses étapes et consolide les fonctionnalités de plusieurs appareils en une seule machine, il nécessite moins de formation et de compétences de dépannage spécialisées de la part des technologues. Étant donné que toutes les étapes sont effectuées à l’intérieur d’un ensemble de tubes fermés à usage unique, le processeur peut être utilisé dans des installations dotées d’une infrastructure de traitement de l’air moins stricte que celle qui serait considérée comme acceptable pour un processus de fabrication ouvert. Par exemple, nous exploitons le transformateur dans une installation certifiée ISO classe 8 (comparable à la classe C de l’UE).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65488/65488fig01.jpg"> Figure 1 : Fabrication de cellules CAR-T à l’aide du système de transduction des cellules T. L’illustration montre le processeur avec le jeu de tubes installé. L’ensemble de tubes permet de connecter d’autres composants tels que des sacs contenant un tampon de traitement, un milieu de culture et un vecteur lentiviral par soudage stérile. Une fois que le produit de leucaphérèse est ajouté au sac d’application, il peut être étiqueté avec des billes de sélection de lymphocytes T, passé à travers la colonne de séparation, puis transféré dans le sac de réapplication. Les cellules sélectionnées sont ensuite dirigées vers l’unité de culture de l’instrument pour la culture et activées avec le réactif d’activation (voir le tableau des matériaux). Le produit final est collecté dans le sac de cellules cibles. Tout au long du processus, il est possible de prélever des échantillons pour le contrôle de la qualité de manière aseptique. Les chiffres gris à l’intérieur des cercles représentent les vannes numérotées du processeur qui dirigent le chemin du liquide à travers le jeu de tubes. Reproduit avec la permission de 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65488/65488fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65488/65488fig02.jpg"> Figure 2 : Matrice d’activité. Après la sélection et l’activation des cellules T, le reste du processus de fabrication des cellules CAR-T est entièrement personnalisable. Les activités peuvent être ajoutées ou supprimées et programmées pour le jour et l’heure appropriés, et le volume de culture après l’activité peut être spécifié (Volume). Par exemple, l’activité de transduction a été configurée pour commencer à 10h00 le jour 1 et le volume de culture à la fin de l’activité a été défini sur 100 ml. La matrice d’activité peut être modifiée tout au long de la période de culture. L’état du processus peut être surveillé sur l’écran intégré de l’appareil de traitement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65488/65488fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
L’objectif de ce manuscrit est de fournir un aperçu détaillé de la fabrication des cellules CAR-T à l’aide du processeur et de fournir des conseils sur les tests en cours de fabrication et de libération du produit qui seront probablement requis par les organismes de réglementation pour approuver une demande de nouveau médicament expérimental (IND). Le protocole présenté reste proche de l’approche recommandée par le fournisseur et constitue le protocole sous-jacent de l’IND 28617, qui est actuellement en cours d’évaluation dans le cadre d’un essai clinique de phase I/II initié par un investigateur monocentrique. Cet essai vise à déterminer l’innocuité et l’efficacité de l’utilisation de ce processeur pour fabriquer des cellules CAR-T autologues humanisées dirigées contre CD19 pour les patients atteints de leucémie aiguë lymphoblastique à cellules B (LAL B) ou de lymphome lymphoblastique de lignée B (B-LLY) [NCT05480449]. L’essai a débuté en septembre 2022 et devrait recruter jusqu’à 89 patients âgés de 0 à 29 ans atteints de B-ALL ou de B-Lly. Nous rapportons quelques résultats de fabrication de l’essai dans le manuscrit.
Nous tenons à souligner que, bien que le manuscrit soit présenté comme un protocole avec des étapes à suivre, il devrait être considéré comme un point de départ pour que d’autres commencent à optimiser leur propre processus de fabrication de cellules CAR-T. Une liste non exhaustive des variations possibles du protocole présenté comprend : l’utilisation de lymphocytes T frais au lieu de lymphocytes T cryoconservés comme matériau de départ ; l’utilisation d’une méthode différente d’enrichissement des lymphocytes T ou son omission totale ; l’utilisation de différents milieux et cocktails de cytokines tels que l’IL7/IL15 au lieu de l’IL2 ; faire varier la concentration de sérum AB humain ou l’omettre complètement ; le moment de la transduction ; l’utilisation de transductions « multi-hits » ; variation de l’agitation, des volumes de culture et du calendrier d’alimentation ; l’utilisation de différentes méthodes de transfert génétique, y compris l’électroporation d’acides nucléiques ou de vecteurs non lentiviraux ; l’utilisation d’un tampon de formulation finale et/ou d’un cryoprotecteur différent ; et l’infusion de cellules CAR-T fraîches au lieu d’être cryoconservées pour une perfusion ultérieure. Ces variations peuvent avoir un impact significatif sur la composition cellulaire et la puissance du produit thérapeutique.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Étape globale du processus</td>
			<td>Journée du processus</td>
			<td colspan="4">Détails techniques</td>
		</tr><tr><td>Enrichissement cellulaire</td>
			<td rowspan="2">Jour 0</td>
			<td colspan="4">Sélection des lymphocytes T CD4+/CD8+</td>
		</tr><tr><td>Activation cellulaire</td>
			<td colspan="4">Ensemencement et activation de la culture des lymphocytes T</td>
		</tr><tr><td>Transduction cellulaire</td>
			<td>Jour 1</td>
			<td colspan="4">Transduction lentivirale (volume de culture de 100 ml)</td>
		</tr><tr><td rowspan="12">Expansion cellulaire (suivie de la formulation cellulaire)</td>
			<td>Jour 2</td>
			<td colspan="4">--</td>
		</tr><tr><td>Jour 3</td>
			<td colspan="4">Lavage de culture (1 cycle) ; Agitateur activé ; Le volume de culture augmente jusqu’à 200 mL</td>
		</tr><tr><td>Jour 4</td>
			<td colspan="4">--</td>
		</tr><tr><td>Jour 5</td>
			<td colspan="4">Aliment (50 ml) ; Le volume de culture atteint le volume final de 250 mL</td>
		</tr><tr><td>Jour 6</td>
			<td colspan="4">Échantillon en cours de fabrication ; Échange de médias (-125 mL / +125 mL)</td>
		</tr><tr><td>Jour 7</td>
			<td colspan="4">Échange de milieux (-150 mL / +150 mL) ou Harvest</td>
		</tr><tr><td>Jour 8</td>
			<td colspan="4">Échantillon en cours de fabrication ; Échange de milieux (-150 mL / +150 mL) ou Harvest</td>
		</tr><tr><td>Jour 9</td>
			<td colspan="4">Échange de milieux (-180 mL / +180 mL) ou Harvest</td>
		</tr><tr><td>Jour 10</td>
			<td colspan="4">Échantillon en cours de fabrication ; Échange de milieux (-180 mL / +180 mL) ou Harvest</td>
		</tr><tr><td>Jour 11</td>
			<td colspan="4">Échange de milieux (-180 mL / +180 mL) ou Harvest</td>
		</tr><tr><td>Jour 12</td>
			<td colspan="4">Échange de milieux (-180 mL / +180 mL) ou Harvest</td>
		</tr><tr><td>Jour 13</td>
			<td colspan="4">Récolter</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Chronologie et aperçu du processus. Ce tableau résume les étapes du processus TCT utilisées dans un essai clinique en cours [NCT05480449]. Le processus commence par l’enrichissement des lymphocytes T par la sélection des CD4+/CD8+, l’ensemencement de la culture et l’activation le jour 0, suivi de la transduction le jour 1. Les cellules se reposent pendant 48 h, suivies d’un lavage de culture, d’une augmentation du volume de culture à 200 ml et d’une agitation à l’aide d’un mécanisme d’agitation. Le jour 6, le premier échantillon en cours de fabrication est prélevé. Les cellules sont prélevées une fois qu’il y a suffisamment de cellules disponibles pour au moins trois doses complètes de cellules CAR-T (5 × 10 6 cellules CAR-T/kg si le patient pèse <50 kg, sinon 2,5 × 108 cellules CAR-T) et des tests de contrôle de la qualité (~2 × 106 cellules CAR-T) ; ou une fois que la culture atteint un total de 4-5 x 109 cellules. Abréviations : TCT = transduction des lymphocytes T ; CAR-T = lymphocytes T récepteurs de l’antigène chimérique ; MACS = tri cellulaire activé par magnétisme.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 x 75 borosilicate tubes</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>TL1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL Reagent Bag</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>170-076-631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL Transfer Set</td>
			<td>Fenwal</td>
			<td>4R2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,000 mL Transfer Set</td>
			<td>Fenwal</td>
			<td>4R2041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BDB559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Prep</td>
			<td>Tyco/Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bag Access</td>
			<td>Medline</td>
			<td>2300E-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 APC-Vio770 REAfinity</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 CAR Detection Reagent Biotin</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-129-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 PE</td>
			<td>BD</td>
			<td>555413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 APC</td>
			<td>BD</td>
			<td>340440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 VioBright FITC REAfinity</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 VioBlue REAfinity</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 APC-Vio770 REAfinity</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Reference Beads 10um</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>B10-02-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Reference Beads 15um</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>B15-02-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Reference Beads 5um</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>B05-02-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Slides</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CHT4-SD100-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS CD4 GMP MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>276-01</td>
			<td>The CD4 reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS CD8 GMP MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>275-01</td>
			<td>The CD8 reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS PBS/EDTA Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-021-201</td>
			<td>The buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Origen</td>
			<td>CP-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Bag 50 mL</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>200-074-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Vial, 1.8 mL</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>12565171N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Vial, 4.5 mL</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>12565161N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human AB serum</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td></td>
			<td>Sterile filtered, heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin 25%</td>
			<td>Grifols</td>
			<td>68516-5216-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin 5%</td>
			<td>Grifols</td>
			<td>68516-5214-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS GMP Recombinant Human IL-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>170-076-148</td>
			<td>The cytokines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS GMP T Cell TransAct</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>200-076-202</td>
			<td>The activation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoSeq Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4460623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles, Hypodermic 14G</td>
			<td>Medline</td>
			<td>SWD200573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles, SlideSafe 18G</td>
			<td>BD</td>
			<td>B-D305918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips, 2-200 &#956;L, individually wrapped</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022492209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips, 50-1000 &#956;L, individually wrapped</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022492225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets 10 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-27F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets 25 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-675-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets 5 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-27E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmalyte-A</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2B2544X</td>
			<td>The electrolyte solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prodigy TS520 Tubing Set</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>170-076- 600</td>
			<td>The tubing set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Field</td>
			<td>Medline</td>
			<td>NON21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin PE-Vio770</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 3 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 30 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 50 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TexMACS GMP Medium</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>170-076-306</td>
			<td>The medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple Sampling Adapter</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>170-076-609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral Vector</td>
			<td>CHOP Clinical Vector Core</td>
			<td></td>
			<td>huCART19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet</td>
			<td>The Baker Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Auto 2000</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS Prodigy</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>200-075-301</td>
			<td>The processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controlled Rate Freezer</td>
			<td>Planer/Kryosave</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endosafe nexgen-PTS150K</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mettler Balance</td>
			<td>Mettler</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCD Sterile Tubing Welder</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sebra Tube Sealer</td>
			<td>Sebra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varitherm</td>
			<td>Barkey</td>
			<td></td>
			<td>The dry thaw device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XN-330 Hematology Analyzer</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chimeric antigen receptor t cell manufacturing on an automated cell processor

Les cellules T à récepteurs antigéniques chimériques (CAR)-T représentent une approche immunothérapeutique prometteuse pour le traitement de diverses maladies malignes et non malignes. Les cellules CAR-T sont des cellules T génétiquement modifiées qui expriment une protéine chimérique qui reconnaît et se lie à une cible de surface cellulaire, entraînant la destruction de la cellule cible. Les méthodes traditionnelles de fabrication des cellules CAR-T sont à forte intensité de main-d’œuvre, coûteuses et peuvent comporter un risque de contamination. Le CliniMACS Prodigy, un processeur cellulaire automatisé, permet de fabriquer des produits de thérapie cellulaire à l’échelle clinique dans un système fermé, minimisant ainsi le risque de contamination. Le traitement s’effectue de manière semi-automatique sous le contrôle d’un ordinateur et minimise ainsi l’implication humaine dans le processus, ce qui permet de gagner du temps et de réduire la variabilité et les erreurs.
Ce manuscrit et cette vidéo décrivent le processus de transduction des cellules T (TCT) pour la fabrication de cellules CAR-T à l’aide de ce processeur. Le processus TCT implique l’enrichissement des lymphocytes T CD4+/CD8+, l’activation, la transduction avec un vecteur viral, l’expansion et la récolte. À l’aide de la matrice d’activité, une fonctionnalité qui permet d’ordonner et de chronométrer ces étapes, le processus TCT peut être largement personnalisé. Nous fournissons une présentation de la fabrication des cellules CAR-T conformément aux bonnes pratiques de fabrication (BPF) actuelles et discutons des tests de libération requis et des expériences précliniques qui soutiendront une demande de nouveau médicament expérimental (IND). Nous démontrons la faisabilité et discutons des avantages et des inconvénients de l’utilisation d’un processus semi-automatique pour la fabrication clinique de cellules CAR-T. Enfin, nous décrivons un essai clinique en cours initié par un chercheur qui cible les tumeurs malignes à cellules B pédiatriques [NCT05480449] comme un exemple de la façon dont ce processus de fabrication peut être appliqué dans un cadre clinique.

Adoptive transfer of T cells engineered to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown remarkable efficacy in treating patients with refractory B-cell malignancies1,2,3,4,5. However, the traditional manufacturing methods for CAR-T cells are labor-intensive, time-consuming, and require highly trained technicians to carry out highly specialized steps. For example, the traditional manufacturing process of an autologous CAR-T cell product involves density gradient centrifugation, elutriation&#160;or magnetic separation to enrich T cells, activation, and transduction with a viral vector in a sterile flask, and expansion in a bioreactor prior to harvest and formulation. Various systems have emerged recently that aim to partially automate this process. For example, the Miltenyi CliniMACS Prodigy (hereafter referred to as the &#34;processor&#34;) is an automated cell processing device that can perform many of these steps in an automated fashion6,7,8,9. An in-depth discussion of traditional and automated CAR-T manufacturing methods is presented in a recent review article10.
The processor builds upon the functionality of the CliniMACS Plus, a U.S. Food and Drug Administration (FDA)-approved medical device for the processing of hematopoietic progenitor cells. The processor includes a cell cultivation unit that allows for&#160;automated washing, fractionation, and cultivation of cells (Figure 1). The T cell transduction (TCT) process is a preset program within the processor device that largely replicates manual CAR-T cell manufacture. TCT allows for customizable cell processing using a graphical user interface (the &#34;Activity Matrix,&#34; Figure 2). Because the processor automates many steps and consolidates the functionality of multiple devices into one machine, it requires less training and specialized troubleshooting skills from technologists. Because all steps are performed within a closed, single-use tubing set, the processor may be operated in facilities with less stringent air-handling infrastructure than would be considered acceptable for an open manufacturing process. For example, we are operating the processor in a facility certified as ISO class 8 (comparable to EU grade C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65488/65488fig01.jpg" /> 
Figure 1: CAR-T cell manufacturing using the T cell transduction system. Shown is the processor&#160;with the tubing set installed. The tubing set allows for connecting other components such as bags containing processing buffer, culture medium, and lentiviral vector via sterile welding. Once the leukapheresis product is added to the Application bag, it can be labeled with T Cell Selection Beads, passed through the Separation column, and then transferred into the Reapplication bag. Selected cells are then directed to the Cultivation unit of the instrument for culture and activated with the Activation reagent (see Table of Materials). The final product is collected in the Target cell bag. Throughout the process, it is possible to remove samples for quality control aseptically. Grey numbers inside of circles represent the numbered valves on the processor that direct the liquid path through the tubing set. Reproduced with permission from 11.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65488/65488fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65488/65488fig02.jpg" /> 
Figure 2: Activity Matrix. After T cell selection and activation, the remainder of the CAR-T cell manufacturing process is fully customizable. Activities&#160;can be added or deleted and scheduled for the appropriate day and time, and the culture volume after the activity can be specified (Volume). For example, the Transduction activity was configured to begin at 10:00 AM on Day 1, and the culture volume at the end of the activity was set as 100 mL. The Activity Matrix can be edited throughout the cultivation period. The status of the process can be monitored on the integrated screen of the processing device. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65488/65488fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
The aim of this manuscript is to provide a detailed walk-through of manufacturing CAR-T cells using the processor and additionally provide guidance on the in-process and product release testing that will likely be required by regulators to approve an investigational new drug (IND) application. The presented protocol stays close to the vendor&#39;s recommended approach and is the underlying protocol for IND 28617, which is currently being evaluated in a single-center investigator-initiated phase I/II clinical trial. This trial aims to determine the safety and efficacy of using this processor to manufacture humanized CD19-directed autologous CAR-T cells for patients with B cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) or B-lineage lymphoblastic lymphoma (B-Lly) [NCT05480449]. The trial started in September 2022 and is planned to enroll up to 89 patients ages 0-29 years with B-ALL or B-Lly. We report some manufacturing results from the trial in the manuscript.
We would like to point out that although the manuscript is presented as a protocol with steps to follow, it should be considered a starting point for others to begin optimizing their own CAR-T cell manufacturing process. A non-comprehensive list of possible variations to the presented protocol includes: using fresh instead of cryopreserved T cells as starting material; using a different method of T cell enrichment or omitting it altogether; using different media and cytokine cocktails such as IL7/IL15 instead of IL2; varying the concentration of human AB serum or omitting it altogether; timing of transduction; using &#34;multi-hit&#34; transductions; varying agitation, culture volumes, and feeding schedule; using different methods of genetic transfer including electroporation of nucleic acids or non-lentiviral vectors; using a different final formulation buffer and/or cryoprotectant; and infusing CAR-T cells fresh instead of cryopreserving for infusion at a later time. These variations may have a significant impact on the cellular composition and potency of the therapeutic product.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Overall Process Step</td>
			<td>Process Day</td>
			<td colspan="4">Technical Details</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Enrichment</td>
			<td rowspan="2">Day 0</td>
			<td colspan="4">Selection of CD4+/CD8+ T cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Activation</td>
			<td colspan="4">T cell culture seeding and activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Transduction</td>
			<td>Day 1</td>
			<td colspan="4">Lentiviral transduction (100 mL culture volume)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="12">Cell Expansion (followed by cell formulation)</td>
			<td>Day 2</td>
			<td colspan="4">--</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 3</td>
			<td colspan="4">Culture Wash (1 cycle); Shaker activated; Culture volume increases to 200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 4</td>
			<td colspan="4">--</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 5</td>
			<td colspan="4">Feed (50 mL); Culture volume reaches final volume of 250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 6</td>
			<td colspan="4">In-process sample; Media exchange (-125 mL / +125 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 7</td>
			<td colspan="4">Media exchange (-150 mL / +150 mL) or Harvest&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 8</td>
			<td colspan="4">In-process sample; Media exchange (-150 mL / +150 mL) or Harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 9</td>
			<td colspan="4">Media exchange (-180 mL / +180 mL) or Harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 10</td>
			<td colspan="4">In-process sample; Media exchange (-180 mL / +180 mL) or Harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 11</td>
			<td colspan="4">Media exchange (-180 mL / +180 mL) or Harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 12</td>
			<td colspan="4">Media exchange (-180 mL / +180 mL) or Harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 13</td>
			<td colspan="4">Harvest</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1: Process timeline and overview. This table summarizes the TCT process steps employed in a current clinical trial [NCT05480449]. The process starts with T cell enrichment by&#160;CD4+/CD8+ selection,&#160;culture seeding,&#160;and activation on Day 0, followed by transduction on Day 1. Cells rest for 48 h, followed by a culture wash, an increase of the culture volume to 200 mL, and agitation using a shaking mechanism. On Day 6, the first in-process sample is taken. Cells are harvested once sufficient cells are available for at least three full doses of CAR-T cells (5 &#215; 106 CAR-T cells/kg if the patient is &#60;50 kg, otherwise 2.5 &#215; 108 CAR-T cells) and quality control testing (~2 &#215; 106 CAR-T cells); or once the culture reaches a total of 4-5 x 109 cells. Abbreviations: TCT = T cell transduction; CAR-T = chimeric antigen receptor T cells; MACS = magnetic-activated cell sorting.

Pleins feux sur l’auteur : Progrès dans la fabrication de cellules CAR-T et la production de thérapie génique 

Fabrication de lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique sur un processeur cellulaire automatisé

The advantage of our protocol is that it is a semi-automated, closed system that still offers flexibility. The labor-intensive steps are replaced by the automation, which is run by a computer, and because it's run by a computer, the user can customize their protocol. This is also all done in a closed system.We found that the sort of stem cell laboratories that are commonly present in hospitals have the capability to produce clinical grade CAR-T cells at significantly lower cost than commercial alternatives. We think that our process could be easily adapted to make CAR-T cell specific for other targets, and also to manufacture other types of cell and gene therapies. Our team is poised to explore other CAR-T cell targets and new gene therapies.On a broader scale, cell and gene therapies are rapidly expanding, and we are excited to continue to support and innovate in this exciting field.

Les résultats des trois premiers essais de fabrication de CAR-T de l’essai NCT05480449 sont présentés ci-dessous dans le tableau 3. Le matériel de départ, le vecteur, les cytokines de culture et les concentrations sériques AB ont été maintenus constants pour chaque essai. Les produits ont été récoltés le jour 7 ou 8. La croissance cellulaire quotidienne moyenne était de 46 % (augmentation du nombre total de cellules), ce qui indique que le processus TCT était efficace pour favoriser l’e...

Watch this Scientific Journal Video about Advancements in CAR-T Cell Manufacturing and Gene Therapy Production at JoVE.com

Cet article détaille le processus de fabrication des lymphocytes T à récepteurs antigéniques chimériques à usage clinique, en particulier à l’aide d’un processeur cellulaire automatisé capable d’effectuer la transduction virale et la culture de lymphocytes T. Nous formulons des recommandations et décrivons les pièges à éviter qui doivent être pris en compte lors de l’élaboration du processus et de la mise en œuvre d’un essai clinique de phase précoce.

Chimeric antigen receptor (CAR)-T cells represent a promising immunotherapeutic approach for the treatment of various malignant and non-malignant ...

L’avantage de notre protocole est qu’il s’agit d’un système semi-automatisé et fermé qui offre tout de même de la flexibilité. Les étapes laborieuses sont remplacées par l’automatisation, qui est exécutée par un ordinateur, et comme elle est exécutée par un ordinateur, l’utilisateur peut personnaliser son protocole. Tout cela se fait également dans un système fermé.Nous avons constaté que les laboratoires de cellules souches couramment présents dans les hôpitaux ont la capacité de produire des cellules CAR-T de qualité clinique à un coût nettement inférieur à celui des alternatives commerciales. Nous pensons que notre procédé pourrait être facilement adapté pour rendre les cellules CAR-T spécifiques à d’autres cibles, et aussi pour fabriquer d’autres types de thérapies cellulaires et géniques. Notre équipe est prête à explorer d’autres cibles cellulaires CAR-T et de nouvelles thérapies géniques.À plus grande échelle, les thérapies cellulaires et géniques se développent rapidement, et nous sommes ravis de continuer à soutenir et à innover dans ce domaine passionnant.

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Medicine

Chimeric Antigen Receptor T Cell Manufacturing on an Automated Cell Processor

1.7K vues.  Children’s Hospital of Philadelphia. L’avantage de notre protocole est qu’il s’agit d’un système semi-automatisé et fermé qui offre tout de même de la flexibilité. Les étapes laborieuses sont remplacées par l’automatisation, qui est exécutée par un ordinateur, et comme elle est exécutée par un ordinateur, l’utilisateur peut personnaliser son protocole. Tout cela se fait également dans un système fermé.Nous avons constaté que les laboratoires de cellules souches couramment présents dans les hôp...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Progrès dans la fabrication de cellules CAR-T et la production de thérapie génique 

Chimeric antigen receptor (CAR)-T cells represent a promising immunotherapeutic approach for the treatment of various malignant and non-malignant diseases. CAR-T cells are genetically modified T cells that express a chimeric protein that recognizes and binds to a cell surface target, resulting in the killing of the target cell. Traditional CAR-T cell manufacturing methods are labor-intensive, expensive, and may carry the risk of contamination. The CliniMACS Prodigy, an automated cell processor, allows for manufacturing cell therapy products at a clinical scale in a closed system, minimizing the risk of contamination. Processing occurs semi-automatically under the control of a computer and thus&#160;minimizes human involvement in the process, which saves time and reduces variability and errors.
This manuscript and video describes the T cell transduction (TCT) process for manufacturing CAR-T cells using this processor. The TCT process involves CD4+/CD8+ T cell enrichment, activation, transduction with a viral vector, expansion, and harvest. Using the Activity Matrix, a functionality that allows ordering and timing of these steps, the TCT process can be customized extensively. We provide a walk-through of CAR-T cell manufacturing in compliance with current Good Manufacturing Practice&#160;(cGMP) and discuss required release testing and preclinical experiments that will support an Investigational New Drug (IND) application. We demonstrate&#160;the feasibility and discuss the advantages and disadvantages of using a&#160;semi-automatic process for clinical CAR-T cell manufacturing. Finally, we describe an ongoing investigator-initiated clinical trial that targets pediatric B-cell malignancies [NCT05480449] as an example of how this manufacturing process can be applied in a clinical setting.

This article details the manufacturing process for chimeric antigen receptor T cells for clinical use, specifically using an automated cell processor capable of performing viral transduction and cultivation of T cells. We provide recommendations and describe pitfalls that should be considered during the process development and implementation of an early-phase clinical trial.

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Manufacturing Chimeric Antigen Receptor T-Cells Using an Automated Cell Processor

Begin by turning on the instrument and selecting the T-cell transduction process from the touchscreen interface. Click run to initiate the procedure and follow the onscreen instructions provided. On the perimeter input screen input the operator initials tubing set, lot number, and expiration date.Next, select full process on the process setup screen. Now, choose two vials of selection reagent for the CD4, CD8 selection method. Install the tubing set, ensuring that all lure connections are tightly set and complete the upper and lower integrity tests by following the instructions on the touchscreen.Now, attach the medium and processing buffer bags per the onscreen guidance and begin the automatic priming of the tubing set. Once the transfer cell product screen appears, transfer the thawed T-cell product to a 150 milliliter transfer bag and sterile weld it to the application bag of the tubing set. Next, use a quality control pouch to obtain a sample from the application bag and perform a cell count using a hematology analyzer.Connect the CD4 and CD8 reagent vials to the tubing set and start the selection process for T-cell enrichment. After enrichment, remove a sample of the selected cells from the reapplication bags quality control pouch. Enter the desired cell concentration and starting number.Now, attach a vial of the activation reagent according to onscreen instructions. Then, set the carbon dioxide concentration to 5%and the culture chamber temperature to 39 degrees Celsius. Establish the activity matrix using the enhanced feeding protocol as a starting point and modify individual steps to your specific optimized protocol.In this case, set the transduction activity time to 24 hours after seeding and the culture wash to 48 hours after transduction. Set the activate shaker time to begin 30 minutes after starting the culture wash. Delete any medium bag exchange and waste bag exchange activities as they are no longer required.Then, press okay on the screen to initiate cultivation. Allow the instrument to automatically pump the required volume from the reapplication bag into the culture chamber. Thaw and prepare the calculated vector volume in a 20 milliliter reagent bag with a cold medium to reach a final volume of 10 milliliters.Adjust the activity matrix to set the transduction time to two minutes into the future and press okay to initiate the transduction activity. Sterile weld the vector bag to the tubing set following the onscreen instructions. Modify the activity matrix according to the actual transduction start time with the culture wash scheduled 48 hours after transduction.Schedule the time of activate shaker to 30 minutes after the culture wash. Finally, ensure the media exchange occurs in the afternoon at 2:00 PM on day six. Press the sample button and follow the onscreen instructions to acquire a quality control sample from the active culture.Divide the sample into three one milliliter aliquots for various analyses. Prepare the final formulation buffer, saving a portion for the cryoprotectant preparation later. Next, adjust the activity matrix, setting the end of culture to two minutes in the future.Attach the final formulation buffer to the tubing set and begin harvest. Seal off and remove the target cell bag. This bag contains the CAR T-cells ready for infusion or cryo-preservation.RT runs of the clinical trial was 46%This indicates that the TCT process effectively promoted cell expansion. The cell viability of the final product was between 88 to 94%and the CD3 T-cell purity was 89 to 93%Endotoxin, mycoplasma, sterility, replication competent lentivirus, and residual leukemic cells were not detectable.