Le financement de la subvention du Conseil de recherche de l’Université d’État des Appalaches (URC) et de la bourse de voyage CAPES Print qui a soutenu la visite de la FAO à l’Université de São Paulo, Ribeirão Preto - São Paulo, Brésil, est vivement remercié. Cette étude a été financée en partie par le Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Finance Code 001. L’ECPDM est reconnaissant de la bourse CAPES Print Travel qui a soutenu sa visite à l’Appalachian State University. L’ECPDM est chercheur associé 2 au Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasil (CNPq).

1. Production de vin expérimentale
<ol><li>Obtenez des raisins Traminnette du vin Dynamis Estate à Jonesville, vignoble de Caroline du Nord, égrappez et écrasez pour libérer le moût dans deux fermenteurs ouverts séparés de 600 L et laissez sur les peaux pendant environ 4 jours avec les couvercles.</li>
	<li>Défoncez les bouchons une fois par jour pour garder la peau humide et limiter la production d’acides volatils (VA). NOTE : L’idée est qu’une grande partie des précurseurs aromatiques (monoterpènes) sont situés dans les peaux et laissent le jus en contact avec la peau pour augmenter le potentiel aromatique du vin.</li>
	<li>Au bout de 4 jours, lancer Saccharomyces cerevisiae var cerevisiae QA23 (Lallemand). Cette levure a été sélectionnée car elle est un fermenteur puissant et est associée à la mise en valeur du caractère variétal du vin à partir des raisins.</li>
	<li>Dans une cuve, Traminette R, ajoutez 20 g/hL de Fermaid O lorsque le brix est à 17,7 et 20 g/hL de Fermaid O et 12,5 g/hL de Fermaid K à 13,1 g/hL pour obtenir une sécurité de fermentation, tandis que dans l’autre cuve Traminette L, ajoutez 40 g/hL de Stimula Sauvignon blanc lorsque le brix est à 17,1. Ajoutez également 20 g/hL de Fermaid O lorsque le brix est à 13,4 pour renforcer le caractère variétal du vin.</li>
	<li>Prélever des échantillons en double de moût (jour 1), de levure ajoutée (jour 4), de moût fermenté (jour 15) et de vin fini (jour 30) et conserver à -20 °C avant l’extraction de l’ADN et l’analyse métagénomique.</li>
</ol>2. Extraction d’ADN pour la métagénomique
<ol><li>Conserver tous les échantillons en double obtenus ci-dessus sur de la glace jusqu’à la première centrifugation.</li>
	<li>Transvaser 20 mL de l’échantillon fermenté dans un tube stérile à bouchon à vis de 50 mL.</li>
	<li>Ajouter 10 mL d’eau froide et homogénéiser (vortex). Centrifuger pendant 1 min à 800 x g à 4 °C et transférer le surnageant dans un nouveau tube de 50 mL. REMARQUE : Cette étape éliminera les solides de l’échantillon.</li>
	<li>Répétez l’étape 2.3 deux fois et regroupez les surnageants dans le même tube.</li>
	<li>Centrifuger le surnageant à 3 000 x g à 4 °C pendant 20 min pour granuler les cellules. Jetez le surnageant.</li>
	<li>Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de PBS, transférer dans un tube à bouchon à vis de 2 mL et centrifuger à 14 000 x g pendant 2 min. Effectuez deux autres lavages à l’aide de PBS.</li>
	<li>À cette étape, congelez les granulés à -20°C ou suivez l’étape 2.8. Il est important que tous les échantillons soient traités de la même manière.</li>
	<li>Ajouter 978 μL de tampon de phosphate de sodium. Préparez le tampon de phosphate de sodium, ajoutez 3,1 g de NaH2PO4· H2O et 10,9 g de Na2HPO4 (anhydre) à H2O distillé pour obtenir un volume de 1 L et ajuster le pH à 7,4.</li>
	<li>Ajouter 122 μL de tampon d’ADN (kit de spin d’ADN) et vortex.</li>
	<li>Laissez reposer au réfrigérateur (4 °C) pendant 45 min-1 h. Vortex les échantillons toutes les 15 min. Cette étape peut être laissée toute la nuit (o/n) ou jusqu’à ce qu’elle soit prête à continuer à utiliser le kit de spin DNA.</li>
	<li>Transférez 1 mL d’échantillon dans un tube de solution de lyse 1 (trousse de centrifugation de l’ADN) et serrez le capuchon (écrivez le numéro de l’échantillon sur le côté du tube et non sur le bouchon ; les réactifs de la trousse enlèveront tout ce qui est écrit sur le bouchon).</li>
	<li>Homogénéiser l’échantillon dans un broyeur à billes (6,5 m/s, CY : 24 x 2) pendant 60 s trois fois. Si le broyeur à billes a l’appareil pour mettre de la glace, mettez 50 g de glace carbonique sous les tubes. Sinon, conserver les échantillons sur de la glace humide pendant 5 minutes entre chaque étape d’homogénéisation.</li>
	<li>Tubes E de matrice de lyse centrifugeuse (kit de spin ADN) pendant 1 min à 16800 x g (ou vitesse maximale).</li>
	<li>Transférez le surnageant dans un microtube propre. Par la suite, ajouter 250 μL de réactif de solution de précipitation des protéines (PPS) (kit de spin ADN) et mélanger en secouant le tube à la main 10 fois.</li>
	<li>Centrifuger pendant 5 min à 16800 x g pour granuler le précipité.</li>
	<li>Transférer le surnageant dans un tube stérile de 15 ml. Ajouter 1 mL de suspension de matrice de liaison (kit de spin ADN) au surnageant. REMARQUE : Remettre en suspension la suspension de la matrice de liaison avant utilisation jusqu’à ce qu’elle soit homogène.</li>
	<li>Retournez les tubes à la main pendant 2 min, puis laissez reposer les tubes dans une grille pendant 3 min (pour permettre la décantation de la matrice de silice).</li>
	<li>Retirer délicatement 1 mL de surnageant. Remettre la matrice en suspension dans le surnageant restant.</li>
	<li>Transférer 600 μL du mélange dans un tube filtrant à centrifugation (kit de centrifugation DNA) et centrifuger pendant 1 min à 14500 x g.</li>
	<li>Ajouter le reste du mélange et centrifuger.</li>
	<li>Décanter le flux et ajouter 500 μL de solution de lavage (kit d’essorage DNA) dans le tube filtrant et centrifuger pendant 1 min à 14500 x g (assurez-vous d’ajouter de l’EtOH à la solution de lavage ; voir le manuel du produit). Décanter le passage et répéter le lavage deux fois de plus (3 lavages au total).</li>
	<li>Décanter le flux et centrifuger pendant 2 minutes supplémentaires à 14 500 x g pour sécher la matrice de la solution de lavage résiduelle.</li>
	<li>Retirez le filtre d’essorage et placez-le dans un tube de récupération frais (kit d’essorage DNA). Faites sécher le filtre à l’air libre pendant 5 min à température ambiante (RT).</li>
	<li>Réchauffez l’eau sans DNAse (kit d’essorage DNA) à 55 °C pendant 5 min. Ajoutez 50 μL d’eau exempte d’ADN et remuez doucement la matrice sur la membrane filtrante avec une pointe de pipette pour une élution efficace de l’ADN. Laisser reposer les échantillons à RT pendant 1 min, puis centrifuger pendant 1 min à 14500 x g pour éluer l’ADN.</li>
	<li>Placez les échantillons sur de la glace. Chargez le mélange d’échantillons (2 μL d’échantillon + 2 μL d’eau + 1 μL de tampon de chargement) dans un gel. Mesurez la concentration d’ADN.</li>
	<li>Conservez les échantillons à -20 °C.</li>
	<li>Utilisez un spectrophotomètre pour quantifier l’ADN extrait. REMARQUE : Un volume d’ADN de 1 μL a été déposé et quantifié, et la qualité de l’ADN a été notée à un rapport A260/A280.</li>
</ol>3. Électrophorèse de l’ADN
<ol><li>Préparer un gel d’agarose à 1 % dans un tampon 0,5 Tris/Borate/EDTA (TBE) (20 mL pour un mini gel, 70-100 mL pour un gel moyen). Peser l’agarose + tampon, faire bouillir au micro-ondes pour faire fondre l’agarose, peser à nouveau et ajouter dH2O au poids d’origine. Refroidir la solution d’agarose à 55-60 °C et verser dans le gélifiant avec peigne. Laissez le gel se solidifier.</li>
	<li>Ajouter 1 μL de tampon de chargement de gel 10x à l’échantillon (10 μL) et charger sur le gel à côté d’un marqueur de poids moléculaire. Passez du négatif (noir) au positif (rouge) à 100-115 V (gros gel) ou 90 V (mini gel) jusqu’à ce que le colorant bleu soit près du fond.</li>
	<li>Teinturer le gel pendant 30 minutes dans 1 μL/mL de bromure d’éthidium ou de SYBR vert (gants et lunettes en nitrile nécessaires), rincer à l’eau et visualiser sous une source de lumière ultraviolette (UV). Parmi les échantillons en double, sélectionnez le rendement le plus élevé pour un traitement ultérieur.</li>
</ol>4. Séquençage à haut débit
<ol><li>Amplifier la région hypervariable V4 du gène de l’ARNr 16S à l’aide d’amorces spécifiques 515F (5' -GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3') et 806R (5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')22. Régler les conditions de réaction en chaîne par polymérase (PCR) à 94 °C pendant 2 min, 30 cycles de 94 °C pendant 20 s, 58 °C pendant 20 s, 65 °C pendant 1 min et 65 °C pendant 10 min (extension finale).</li>
	<li>Réalisez des réactions PCR avec un master mix PCR haute fidélité (Table of Materials).</li>
	<li>Générez des banques avec un kit de préparation de banques d’ADN, puis séquencez en utilisant le séquençage par paires sur une plateforme de séquençage. REMARQUE : Ici, les banques générées avec le kit de préparation de banques d’ADN NEBNext Ultra II ont été séquencées à l’aide d’un séquençage Illumina apparié (2 × 250 pb) sur la plate-forme novaseq6000.</li>
	<li>Suivez les étapes de séquençage :<ol><li>Étape 1 : Cisaillez l’ADN avec une enzyme, généralement par une méthode qui sélectionne pour une taille générale.<ol><li>Ajouter 3,5 μL de tampon de séquençage et 1,5 μL de mélange enzymatique à 25 μL d’ADN (environ 1 μg), mélanger 10 fois avec une pipette et tourner rapidement.</li>
			<li>Placer dans un thermocycleur dans les conditions suivantes : préchauffer le couvercle à 75 °C, (1) 30 min pour 20 °C (2) 30 min pour 65 °C (3) maintenir à 4 °C.</li>
		</ol></li>
		<li>Étape 2 : Ajouter des adaptateurs par ligature<ol><li>Ajoutez 15 μL de mélange maître de ligature, 1,25 μL d’adaptateur, 0,5 μL d’activateur de ligature et 30 μL de mélange d’ADN de préparation finale avec une pipette.</li>
			<li>Incuber à 20 °C pendant 15 min dans un thermocycleur, puis ajouter 1,5 μL d’enzyme réactif d’excision spécifique à l’uracile (USER) au mélange de ligature pour obtenir un total de 48,26 μL. Incuber 37 °C pendant 15 min.</li>
			<li>Ajouter 43,5 μL de billes magnétiques à l’ADN de ligature de l’adaptateur, mélanger 20 fois avec une pipette et incuber pendant 5 min à RT. Séparer les billes avec un support magnétique, puis incuber pendant 5 à 10 minutes et jeter le surnageant.</li>
			<li>Lavez le granulé avec 100 μL d’éthanol à 80 %, séchez-le pendant 30 s et lavez-le à nouveau. Éluer les billes et les granulés dans 8,5 μL de 10 mM de Tris HCl/0,1x Tris-EDTA(TE)/HPLCH 20, mélanger avec une pipette et incuber à RT pendant 2 min.</li>
			<li>Incuber dans le rack magnétique et prélever 7,5 μL d’ADN élué en tant que surnageant. Placez l’élu dans un nouveau tube et effectuez une étape de PCR.</li>
			<li>Tout d’abord, ajoutez 12,5 μL de mélange maître, 2,5 μL d’amorce d’index i7 et 2,5 μL d’amorce PCR universelle/amorce i5 à 7,5 μL d’ADN ligaturé par adaptateur pour obtenir 25 μL de mélange réactionnel PCR. Utilisez les conditions PCR suivantes : préchauffez le couvercle à 103 °C. 98 °C pendant 30 s, 98 °C pendant 10 s, 65 °C pendant 75 s, 65 °C pendant 5 min et maintenez à 4 °C après 10 cycles.</li>
			<li>Nettoyez l’ADN amplifié de 25 μL. Ajouter 22,5 μL de billes magnétiques et mélanger 20 fois. Incuber à RT pendant 5 min et retirer 50 μL de surnageant. Lavez les billes avec 100 μL d’éthanol à 80 % et retirez tout l’éthanol en séchant doucement les billes pendant 30 s.</li>
			<li>Remettre les billes brun foncé en suspension dans 16 μL d’eau, mélanger 20 fois avec une pipette et placer dans le support magnétique pendant 30 à 60 s. Transférez 15 μL dans un nouveau tube.</li>
			<li>Déterminez la concentration d’ADN à l’aide d’un fluorimètre. Mélanger 90 μL de tampon + 1 μL de colorant + 2 μL d’échantillon de banque d’ADN et lire la concentration. Diluez l’ADN à 2 nM, chargez 27-30 μL dans la cellule d’écoulement et placez-le dans le séquenceur.</li>
		</ol></li>
		<li>Étape 3 : Séquencez les adaptateurs, hybridez les banques générées ci-dessus à la matrice de la cellule d’écoulement à motifs et capturez l’ADN selon les instructions du fabricant. Utilisez-le comme modèle pour la deuxième synthèse.<ol><li>Ensuite, amplifiez le deuxième brin en un groupe clonal. Linéarisez le cluster et bloquez les sites actifs. Ajouter une amorce de séquençage pour fournir un site de séquençage par synthèse dans la séquence selon le protocole du fabricant. REMARQUE : Chimiquement, les nucléotides modifiés se lient au brin matrice d’ADN en utilisant une complémentarité naturelle. Chaque nucléotide a une étiquette fluorescente et une terminaison réversible qui bloque l’inclusion de la base suivante. Par conséquent, la présence d’un signal fluorescent indique quel nucléotide est inséré et la terminaison est clivée pour que la base suivante se lie.</li>
		</ol></li>
		<li>Étape 4 : Amplifier le brin à liaison unique pour obtenir des groupes de séquences qui sont séquencées en tandem par synthèse. REMARQUE : Les clusters donnent un signal plus lumineux qu’un seul brin grâce à un balayage bidirectionnel et à une chimie de séquençage à deux canaux. Le logiciel de séquençage transfère automatiquement les fichiers d’appel de base (*.cbcl) vers l’emplacement spécifié du dossier de sortie pour l’analyse des données.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Bioinformatique
<ol><li>Générez les données de séquence sous forme de fichiers FASTQ. Analysez pour inclure les parties suivantes.<ol><li>Partie I :<ol><li>Enregistrez les fichiers FASTQ obtenus à partir du séquenceur, cliquez pour ouvrir un fichier de feuille de calcul et créez des fichiers de mappage/métadonnées.</li>
			<li>Ouvrez le site Web de Nephele (https://nephele.niaid.nih.gov/), téléchargez les fichiers FASTQ, lisez QC, filtrage et découpage dans QIIME222. Dépôt des séquences brutes sous forme d’archive de lecture de séquence (SRA) et de GenBank dans NCBI BioProject (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/)</li>
		</ol></li>
		<li>Partie II : Allez sur le site Web de Nephele (https://nephele.niaid.nih.gov/), effectuez les lectures d’extrémités appariées démultiplexées, la substitution de filtres et les erreurs de chimère, et fusionnez à l’aide de DADA223. Utilisez le classificateur naïf bayésien entraîné sur la base de données Silva version 132 99% OTU pour effectuer une affectation taxonomique bactérienne à 97% de similarité24.</li>
		<li>Partie III : Ouvrez le site Web de MicrobiomeDB, cliquez pour télécharger des fichiers et générer des courbes OTU alpha-diversité, bêta-diversité, abondance relative et raréfaction (https://microbiomedb.org/mbio/app).</li>
		<li>Partie IV : Ouvrez une feuille de calcul et transférez des données pour créer des cartes thermiques, des diagrammes de Venn et une taille d’effet d’analyse discriminante linéaire (https://microbiomedb.org/mbio/app).</li>
	</ol></li>
</ol>6. Analyse statistique
<ol><li>Ouvrez QIIME222 et déterminez les différences significatives de diversité alpha entre les groupes à l’aide du script alpha-group-significat. Celui-ci effectuera également le test de Kruskal-Wallis.</li>
	<li>Déterminez les différences de diversité bêta entre les groupes à l’aide de PERMANOVA, y compris un test par paires25.</li>
	<li>Obtenez les différences significatives dans la structure de la communauté bactérienne entre les groupes à l’aide de MicrobiomeDB. Une valeur p ≤0,05 a été considérée comme statistiquement significative.</li>
</ol>

Profilage de la communauté bactérienne dans le raisin à l’aide de la métagénomique d’Amplicon

<ol>
	<li>Skinkis, P. A., Bordelon, B. P., Wood, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+monoterpene+constituents+in+traminette,+gew&#252;rztraminer,+and+riesling+winegrapes.">Comparison of monoterpene constituents in traminette, gew&#252;rztraminer, and riesling winegrapes.</a> American Journal of Enology and Viticulture. 59, 440-445 (2008).</li><li>Bordelon, B. P., Skinkis, P. A., Howard, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+training+system+on+vine+performance+and+fruit+composition+of+Traminette.">Impact of training system on vine performance and fruit composition of Traminette.</a> American Journal of Enology and Viticulture. 59, 39-46 (2008).</li><li>Reisch, B. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grapevine+microbiomics:+bacterial+diversity+on+grape+leaves+and+berries+revealed+by+high-throughput+sequence+analysis+of+16S+rRNA+amplicons.">Grapevine microbiomics: bacterial diversity on grape leaves and berries revealed by high-throughput sequence analysis of 16S rRNA amplicons.</a> International Symposium on Biological Control of Postharvest Diseases: Challenges and Opportunities. 905, 31-42 (2010).</li><li>Rubiola, S., Macori, G., Civera, T., Fanning, S., Mitchell, M., Chiesa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+full-length+16s+RNA+metabarcoding+and+whole+metagenome+sequencing+suggests+the+use+of+either+is+suitable+for+large-scale+microbiome+studies.">Comparison between full-length 16s RNA metabarcoding and whole metagenome sequencing suggests the use of either is suitable for large-scale microbiome studies.</a> Foodborne Pathogens and Disease. 19, 495-504 (2022).</li><li>Bokulich, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+among+wine+grape+microbiome,+metabolome,+and+fermentation+behavior+suggest+microbial+contribution+to+regional+wine+characteristics.">Associations among wine grape microbiome, metabolome, and fermentation behavior suggest microbial contribution to regional wine characteristics.</a> Mbio. 7 (3), e00631-e00716 (2016).</li><li>Siren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-omics+and+potential+applications+in+wine+production.">Multi-omics and potential applications in wine production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 56, 172-178 (2019).</li><li>Kidd, S. P., Bastian, S. E. P., Eisenhofer, R., Welsh, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+viable+grapevine+microbiome+to+enhance+the+quality+of+wild+wines.">Monitoring the viable grapevine microbiome to enhance the quality of wild wines.</a> Microbiology Australia. 44 (1), 13-17 (2023).</li><li>Lorenz, P., Eck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomics+and+industrial+applications.">Metagenomics and industrial applications.</a> Nature Reviews Microbiology. 3, 510-516 (2005).</li><li>Tosi, E., Azzolini, M., Guzzo, F., Zapparoli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+different+fermentation+behaviours+of+two+indigenous+strains+of+Saccharomyces+cerevisiae+and+Saccharomyces+uvarum+isolated+from+Amarone+wine.">Evidence of different fermentation behaviours of two indigenous strains of Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces uvarum isolated from Amarone wine.</a> Journal of Applied Microbiology. 107 (1), 210-218 (2009).</li><li>Stefanini, I., Cavalier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+approaches+to+investigate+the+contribution+of+the+vineyard+environment+to+the+quality+of+wine+fermentation:+potentials+and+difficulties.">Metagenomic approaches to investigate the contribution of the vineyard environment to the quality of wine fermentation: potentials and difficulties.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 991 (2018).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data.">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 5, 335-336 (2010).</li><li>Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DADA2:+High-resolution+sample+inference+from+Illumina+amplicon+data.">DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data.</a> Nature Methods. 13, 581-583 (2016).</li><li>Quast, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SILVA+ribosomal+RNA+gene+database+project:+improved+data+processing+and+web-based+tools.">The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools.</a> Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).</li><li>Anderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+non-parametric+multivariate+analysis+of+variance.">A new method for non-parametric multivariate analysis of variance.</a> Austral Ecology. 26 (1), 32-46 (2001).</li><li>Bolyen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=interactive,+scalable+and+extensible+microbiome+data+science+using+QIIME+2.">interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2.</a> Nature Biotechnology. 37, 852-857 (2019).</li><li>Fadiji, A. E., Babalola, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomics+methods+for+the+study+of+plant-associated+microbial+communities:+A+review.">Metagenomics methods for the study of plant-associated microbial communities: A review.</a> Journal of Microbiological Methods. 170, 105860 (2020).</li><li>van Hijum, S. A., Vaughan, E. E., Vogel, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+state-of-art+sequencing+technologies+to+indigenous+food+fermentations.">Application of state-of-art sequencing technologies to indigenous food fermentations.</a> Current Opinion in Biotechnology. 24, 178-186 (2013).</li><li>V&#237;quez-R, L., Fleischer, R., Wilhelm, K., Tschapka, M., Sommer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jumping+the+green+wall:+The+use+of+PNA-DNA+clamps+to+enhance+microbiome+sampling+depth+in+wildlife+microbiome+research.">Jumping the green wall: The use of PNA-DNA clamps to enhance microbiome sampling depth in wildlife microbiome research.</a> Ecology and Evolution. 10 (20), 11779-11786 (2020).</li><li>Bukin, Y. S., Galachyants, P., Yu, I. V., Morozov, S. V., Bukin, A. S., Zakharenko, T. I., Zemskaya, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+16S+rRNA+region+choice+on+bacterial+community+metabarcoding+results.">The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results.</a> Scientific Data. 6, 190007 (2019).</li></ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Le protocole de métagénomique commence par l’échantillonnage du moût de raisin, et lorsque la levure a été ajoutée au moût, le vin en fermentation et les échantillons de vin finaux. Cela a été suivi par une extraction d’ADN dupliqué qui a été extraite avec succès de ces échantillons. Les quantités obtenues variaient en concentration de 15 ng/μL à 87 ng/μL. Cela montre que le protocole d’extraction de l’ADN est efficace pour les études métagénomiques du vin. Bien que la qualité de l’ADN c...

Le raisin Traminette se caractérise par une production de vin de qualité supérieure, en plus d’un rendement appréciable et d’une résistance partielle à plusieurs infections fongiques 1,2,3. La fermentation naturelle du raisin repose sur les micro-organismes associés, l’environnement de production du vin et les cuves de fermentation 4,5. Souvent, de nombreux établissements vinicoles s’appuient sur des levures sauvages et des bactéries pour la fermentation, la production d’alcool, les esters, le développement des arômes et des saveurs6.
L’objectif de cette étude est d’examiner la composition bactérienne des raisins et de surveiller leur dynamique pendant la fermentation. Cependant, l’utilisation moderne de ferments lactiques tels que Saccharomyces cerevisiae pour la fermentation primaire, où l’alcool est produit, est commune à différents styles de vin7. De plus, la fermentation secondaire, où l’acide malique est décarboxylé par Oenococcus oeni en acide lactique, améliore le profil organoleptique et gustatif du vin et réduit l’acidité du vin 8,9. Avec les progrès récents dans l’utilisation de méthodes indépendantes de la culture, il est maintenant possible de déterminer différents microbes associés au raisin de cuve et aux espèces qui sont transférés au moût et participent à la fermentation à différents moments jusqu’au produit final10.
Les rôles et la dynamique des bactéries sauvages de différents raisins transférés au moût pendant la fermentation du vin sont mal compris. La taxonomie de bon nombre de ces bactéries n’est même pas connue, ou leurs propriétés phénotypiques ne sont pas caractérisées. Cela rend leur application en coculture encore peu utilisée. Cependant, une analyse microbiologique basée sur des cultures a été utilisée pour déterminer la population bactérienne associée au raisin et au vin10. Il est bien connu que le placage de culture sélective est fastidieux, sujet à la contamination, a une faible reproductibilité et le rendement peut être douteux ; il manque également des espèces bactériennes dont les besoins de croissance sont inconnus. Des études antérieures indiquent que les méthodologies basées sur le gène de l’ARNr 16S indépendantes de la culture offrent une approche plus fiable et plus rentable pour caractériser les communautés microbiennes complexes11. Par exemple, le séquençage des régions hypervariables du gène de l’ARNr 16S a été utilisé avec succès pour étudier les bactéries dans les feuilles de vigne, les baies et le vin 12,13,14. Des études ont montré que l’utilisation du métabarcodage de l’ARNr 16S ou du séquençage métagénomique entier convient aux études du microbiome15. Des informations émergentes sur le lien possible entre la diversité bactérienne et leurs attributs métaboliques pendant la production de vin, ce qui pourrait aider à déterminer les propriétés œnologiques et le terroir16.
La nécessité de maximiser les avantages des outils métagénomiques utilisant le séquençage de nouvelle génération (NGS) pour étudier l’écologie microbienne du raisin et du vin a été soulignée16,17. De plus, l’utilisation de méthodes indépendantes de la culture basées sur le séquençage à haut débit pour profiler la diversité microbienne de l’écosystème alimentaire et de fermentation est devenue très pertinente et précieuse pour de nombreux laboratoires et est recommandée pour un usage industriel18,19. Il offre un avantage de détection et de profilage taxonomique des populations microbiennes actuelles et de la contribution des microbes environnementaux, de leur abondance relative et de leur diversité alpha et bêta20. Le séquençage de la région variable de la région 16S est devenu un gène de choix important et a été utilisé lors de différentes études écologiques microbiennes.
Alors que de nombreuses études se concentrent sur les champignons, en particulier les levures, pendant la fermentation du vin21, cette étude a rapporté le séquençage d’amplicon 16S et les outils bioinformatiques utilisés pour étudier les bactéries pendant la fermentation des raisins Traminette pour la production de vin.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose gel&#160;</td>
			<td>Promega, Madison, WI USA</td>
			<td>V3121</td>
			<td>Electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep DNA spinKit for soil&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals, Solon, OH USA</td>
			<td>116560-200</td>
			<td>DNA extraction&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC software</td>
			<td>Babraham Institute, United Kingdom</td>
			<td></td>
			<td>Bioinformatics&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fermaid O</td>
			<td>Scott Laboratory, Petaluma, CA USA&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Fermentation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Fidelity PCR Master Mix&#160;</td>
			<td>New England Biolabs, USA</td>
			<td>F630S</td>
			<td>Polymerase chain reaction for sequencing&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra</td>
			<td>New England Biolabs, USA</td>
			<td>NEB #E7103</td>
			<td>DNA Library Prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit&#160;</td>
			<td>Illumina, San Diego, CA&#160; USA</td>
			<td></td>
			<td>DNA sequencing&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovaSeq Control Software (NVCS)</td>
			<td>Illumina, San Diego, CA&#160; USA</td>
			<td></td>
			<td>DNA sequencing&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novaseq6000 platform&#160;</td>
			<td>Illumina, San Diego, CA&#160; USA</td>
			<td></td>
			<td>DNA sequencing&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuiBit</td>
			<td>Thermoscientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>DNA quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quickdrop spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Molecular device, San Jose, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td>DNA quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>342483</td>
			<td>DNA extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimula Sauvignon Blanc</td>
			<td>Scott Laboratory, Petaluma, CA USA&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Fermentation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling the bacterial community of fermenting traminette grapes during wine production using metagenomic amplicon sequencing

Les progrès de la technologie de séquençage et l’accès relativement facile à l’utilisation d’outils bioinformatiques pour profiler les structures des communautés microbiennes ont facilité une meilleure compréhension des microbes cultivables et non cultivables dans le raisin et le vin. Au cours de la fermentation industrielle, les microbes, connus et inconnus, sont souvent responsables du développement et de la mauvaise saveur des produits. Par conséquent, le profilage des bactéries du raisin au vin peut permettre de comprendre facilement la dynamique microbienne in situ . Dans cette étude, les bactéries du moût de raisin Traminette en fermentation et le vin final ont été soumis à une extraction d’ADN qui a donné 15 ng/μL à 87 ng/μL. L’amplicon 16S de la région hypervariable de la région V4 a été séquencé, des bactéries relativement abondantes constituées des phylums Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota et suivies par Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcocto et Acidobacteriota. Une analyse du diagramme de Venn des unités taxonomiques opérationnelles uniques (OTU) partagées a révélé que 15 embranchements de bactéries étaient communs au moût de raisin, à l’étape de fermentation et au vin final. Des embranchements qui n’avaient pas été signalés auparavant ont été détectés à l’aide du séquençage d’amplicon 16S, ainsi que des genres tels que Enterobacteriaceae et Lactobacillaceae. La variation de l’utilisation des nutriments organiques dans le vin et son impact sur les bactéries ont été testés ; Cuve Traminette R contenant Fermaid O et Traminette L stimulée avec Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O. La diversité alpha à l’aide du test de Kruskal-Wallis a déterminé le degré de planéité. La diversité bêta indiquait un changement dans les bactéries au stade de la fermentation pour les deux traitements, et les bactéries du vin finales étaient similaires. L’étude a confirmé que le séquençage d’amplicon 16S peut être utilisé pour surveiller les changements bactériens pendant la production de vin afin de soutenir la qualité et une meilleure utilisation des bactéries du raisin pendant la production de vin.

Traminette grape is characterized by production of superior wine quality, in addition to appreciable yield and partial resistance to several fungal infections1,2,3. The natural fermentation of grapes relies on associated microorganisms, wine production environment, and fermentation vessels4,5. Oftentimes, many wineries rely on wild yeast and bacteria for fermentation, production of alcohol, esters, aroma, and flavor development6.
The goal of this study is to examine the bacterial composition of grapes and monitor their dynamics during fermentation. Although, the modern use of starter cultures such as Saccharomyces cerevisiae for primary fermentation, where alcohol is produced, is common to different wine styles7. In addition, secondary fermentation, where malic acid is decarboxylated by Oenococcus oeni to lactic acid, improves the organoleptic and taste profile of the wine and reduces the acidity of wine8,9. With the recent advances in the use of culture-independent methods, it is now possible to determine different microbes associated with the wine grape and the species that are transferred to must and participate in the fermentation at different times up to the final product10.
The roles and dynamics of wild bacteria from different grapes transferred to the must during wine fermentation are poorly understood. The taxonomy of many of these bacteria is not even known, or their phenotypic properties are uncharacterized. This makes their application in coculture fermentation still poorly underutilized. However, microbiological culture-based analysis has been used to determine the bacterial population associated with grapes and wine10. It is widely known that selective culture plating is tedious, prone to contamination, has a low reproducibility, and output can be doubtful; it also misses bacterial species whose growth requirements are unknown. Previous studies indicate that culture-independent, 16S rRNA gene-based methodologies offer a more dependable and cost-effective approach to characterizing complex microbial communities11. For example, sequencing the hypervariable regions of the 16S rRNA gene has been successfully employed to study bacteria in grapes leaves, berries, and wine12,13,14. Studies have shown that the use of either 16S rRNA metabarcoding or whole metagenomic sequencing is suitable for microbiome studies15. There is emerging information about the possible linkage of bacterial diversity to their metabolic attributes during wine production, which could help in the determination of oenological properties and terroir16.
The need to maximize the advantages of the metagenomic tools using next-generation sequencing (NGS) to study the grape and wine microbial ecology has been emphasized16,17. Also, the use of culture-independent methods based on high throughput sequencing to profile microbial diversity of the food and fermentation ecosystem has become very relevant and valuable to many laboratories and is recommended for industrial use18,19. It provides an advantage of detection and taxonomic profiling of the present microbial populations and the contribution of environmental microbes, their relative abundance, and alpha and beta diversity20. The sequencing of the variable region of the 16S region has become an important gene of choice and has been used during different microbial ecological studies.
While many studies focus on fungi, especially yeast, during wine fermentation21, this study reported the 16S amplicon sequencing and bioinformatic tools used to study the bacteria during Traminette grapes fermentation for wine production.

Pleins feux sur l’auteur : Explorer le microbiome de fermentation grâce au séquençage de nouvelle génération

Profilage de la communauté bactérienne des raisins Traminette en fermentation pendant la production de vin à l’aide du séquençage d’amplicons métagénomiques

Research scope focuses on the understanding of the fermentation microbiome. This is to answer questions such as how diverse microbes in natural fermentation are, and what gene coding for metabolite is necessary for flavor and safety. One of the latest advancement in our field involves understanding how the dynamics of the microbiome correlate with the metabolic profile observed in fermented foods and beverages.The next generation sequence stands out as a pivotal technology that is currently driving advancements in our research field

La quantité et la qualité de l’ADN extrait du moût de raisin, du vin en fermentation et du vin final ont d’abord été déterminées ; la valeur de la quantité varie de 15 à 87 ng/μL (tableau 1).
Séquençage et bioinformatique Le séquenceur à haut débit Illumina a généré un fichier FASTQ qui a été importé dans le Nephele et visualisé sur la plate-forme QIIME 226. Tout d’abord, le logiciel FastQ...

Watch this Scientific Journal Video about Profiling the Bacterial Community of Fermenting Traminette Grapes during Wine Production using Metagenomic Amplicon Sequencing at JoVE.com

Ici, nous présentons un protocole pour décrire la métagénomique des amplicons afin de déterminer la communauté bactérienne des raisins Traminette, des raisins en fermentation et du vin final.

Advances in sequencing technology and the relatively easy access to the use of bioinformatics tools to profile microbial community structures have ...

Le champ de recherche se concentre sur la compréhension du microbiome de la fermentation. Il s’agit de répondre à des questions telles que la diversité des microbes dans la fermentation naturelle et le gène codant pour le métabolite nécessaire à la saveur et à la sécurité. L’une des dernières avancées dans notre domaine consiste à comprendre comment la dynamique du microbiome est corrélée au profil métabolique observé dans les aliments et les boissons fermentés.La séquence de nouvelle génération se distingue comme une technologie essentielle qui fait actuellement progresser notre domaine de recherche

profiling-bacterial-community-fermenting-traminette-grapes-during

Research

JoVE Journal

Biology

Profiling the Bacterial Community of Fermenting Traminette Grapes during Wine Production using Metagenomic Amplicon Sequencing

501 vues.  Appalachian State University. Le champ de recherche se concentre sur la compréhension du microbiome de la fermentation. Il s’agit de répondre à des questions telles que la diversité des microbes dans la fermentation naturelle et le gène codant pour le métabolite nécessaire à la saveur et à la sécurité. L’une des dernières avancées dans notre domaine consiste à comprendre comment la dynamique du microbiome est corrélée au profil métabolique observé dans les aliments et les boissons fermentés.L...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Explorer le microbiome de fermentation grâce au séquençage de nouvelle génération

Advances in sequencing technology and the relatively easy access to the use of bioinformatics tools to profile microbial community structures have facilitated a better understanding of both culturable and non-culturable microbes in grapes and wine. During industrial fermentation, microbes, known and unknown, are often responsible for product development and off-flavor. Therefore, profiling the bacteria from grape to wine can enable an easy understanding of in situ microbial dynamics. In this study, the bacteria of Traminette grapes must undergoing fermentation, and the final wine were subjected to DNA extraction that yielded 15 ng/&#181;L to 87 ng/&#181;L. The 16S amplicon of the hypervariable region of the V4 region was sequenced, relatively abundant bacteria consisting of phyla Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota and followed by the Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota, and Acidobacteriota. A Venn diagram analysis of the shared unique operational taxonomic units (OTU) revealed that 15 bacteria phyla were common to both grape must, fermenting stage, and final wine. Phyla that were not previously reported were detected using the 16S amplicon sequencing, as well as genera such as Enterobacteriaceae and Lactobacillaceae. Variation in the organic nutrient use in wine and its impact on bacteria was tested; Traminette R tank containing Fermaid O and Traminette L stimulated with Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O. Alpha diversity using the Kruskal-Wallis test determined the degree of evenness. The beta diversity indicated a shift in the bacteria at the fermentation stage for the two treatments, and the final wine bacteria looked similar. The study confirmed that 16S amplicon sequencing can be used to monitor bacteria changes during wine production to support quality and better utilization of grape bacteria during wine production.

Here, we present a protocol to describe amplicon metagenomic for determining the bacterial community of Traminette grapes, fermenting grapes, and final wine.

Recherche

Biologie

DNA Extraction from Fermented Grape for Metagenomic Analysis

To begin, transfer 20 milliliters of the fermented grape sample into a sterile 50 milliliter screwed cap tube. Then add 10 milliliters of cold water into the tube and vortex for homogenization. Centrifuge the sample at 800 G for one minute at four degrees Celsius.Transfer the supernatant to a new 50 milliliter tube and centrifuge at 3000 G for 20 minutes at four degrees Celsius. After discarding the supernatant, resuspend the pellet in one milliliter of PBS. Transfer the cell suspension to a two milliliter screw cap tube and centrifuge at 14, 000 G for two minutes.Now resuspend the pellet in 978 microliters of sodium phosphate buffer of pH 7.4 and 122 microliters of DNA buffer. Vortex the tube and place it at four degrees Celsius for 45 minutes to one hour. Transfer one milliliter of the sample into a lysis solution one tube and tighten the cap.Homogenize the sample three times in a bead beating grinder for 60 seconds each. Then centrifuge the lysing matrix E tube for one minute at 16, 800 G.Transfer the supernannt into a clean microtube and add 250 microliters of protein precipitation solution to the tube. Shake the tube 10 times to mix the contents.Centrifuge the sample for five minutes at 16, 800 G and transfer the supernatant into a sterile 15 milliliter tube. Then add one milliliter of binding matrix suspension to the supernatant and mix by inverting the tubes for two minutes before placing them in rack for three minutes. After removing one milliliter of the supernatant, resuspend the matrix in the remaining supernatant.Transfer 600 microliters of the mixture into a spin filter tube and centrifuge. Then decant the flow through and add 500 microliters of wash solution into the spin filter tube. Remove the spin filter and place it in a fresh catch tube for five minutes.After drying, add 50 microliters of warm DNAse-free water on the filter membrane and gently stir the matrix with a pipette tip. Centrifuge at 14, 500 G for one minute to elute the DNA. Load the sample onto an agarose gel.Finally, measure the DNA concentration.

Extraction d’ADN de raisin fermenté pour l’analyse métagénomique

High-Throughput Sequencing and Bioinformatic Analysis in Grape Must and Wine for Microbial Diversity

To begin, use specific primers 515f and 806r to amplify the V4 hypervariable region of the 16S rNA gene. Perform PCR using the given conditions. Next, add 3.5 microliters of sequencing buffer and 1.5 microliters of enzyme mix to the tube.After mixing and spinning the sample, set up a thermocycler reaction. Now, add the adapter ligation mixture into the tube and incubate at 20 degrees Celsius for 15 minutes in a thermocycler. Add 1.5 microliters of uracil specific extension reagent enzyme to the ligation mix, and incubate at 37 degrees Celsius for 15 minutes.Now, add 43.5 microliters of magnetic beads to the adapter ligation DNA and mix 20 times. After five minutes, place the tube in a magnetic rack for five to 10 minutes for bead separation and discard the supernatant. Wash the pellet with 100 microliters of 80%ethanol and dry the beads for 30 seconds.To elute the beads in pellet, add 8.5 microliters of 10 millimolar Tris HCl into the tube and incubate for two minutes. Place the tube in a magnetic rack and remove 7.5 microliters of eluded DNA as supernatant into a new tube. Add PCR reagents to the adapter ligated DNA containing tube to set up a 25 microliter reaction.To clean amplified DNA, add 22.5 microliters of magnetic beads into the tube and mix 20 times. After five minutes, remove 50 microliters of supernatant and wash the beads with 100 microliters of 80%ethanol. Resuspend he dark brown beads in 16 microliters of water and mix 20 times.Place the tube in the magnetic rack for 30 to 60 seconds and transfer 15 microliters to a new tube. Mix 90 microliters of buffer, one microliter of dye, and two microliters of DNA library sample and read the DNA concentration on a fluorimeter. After diluting the DNA to two nanomolar, load 27 to 30 microliters of the flow cell and place it in the sequencer.Save the FASTQ files obtained from the sequencer. Click to open a spreadsheet file and create a mapping or metadata file. Open the Nephele website, upload the FASTQ files, and read QC End QIIME2, Perform Filtering and Trimming.Next, using DADA2, execute demultiplexed paired-end reads, filter substitution, chimera errors, and merging. Use the Naive Bayes classifier trained on the Silva version 132 99%operational taxonomic unit, or OTU database, to perform bacterial taxonomic assignment at 97%similarity. Open the MicrobiomeDB website.Click to upload the files, and generate OTU alpha diversity, beta diversity, relative abundance, and rarefaction curves. Finally, open a spreadsheet and transfer data to make heat maps, Venn diagrams, and linear discriminant analysis effect size. A heat map based on the relative abundance of bacteria at different stages of winemaking displayed the dominance of phyla such as Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, and Fusobacteriota.At the genus level, important genera like Enterobacteriaceae and Lactobacillaceae were identified. A Venn diagram analysis revealed 15 shared unique OTUs from the grape must to the final wine. The results of the amplicon sequencing based on the V4 variable region also indicated the alpha diversity in the two traminette R and L.Beta diversity analysis showed a shift in bacteria during fermentation, but the bacterial composition in the final wine was similar to that in the must and yeast added stages.