Cette recherche a été financée par les projets de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32172476, 32102275), du Programme d’innovation en sciences et technologies agricoles (CAAS-ZDRW202203, CAAS-ZDRW202108) et des Fonds centraux guidant le développement scientifique et technologique local (XZ202301YD0042C).

REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, instruments, logiciels et réactifs utilisés dans ce protocole.
1. Collecte et entretien de l’insecticulture
<ol><li>Coller un groupe de ~5 000 œufs de Corcyra cephalonica (Stainton) sur une carte de 9 cm sur 16 cm en utilisant une solution 1:5 (v/v) de gomme arabique en poudre et d’eau25,26. REMARQUE : Évitez d’attacher trop d’œufs hôtes à la carte, car le surpeuplement rend peu pratique les procédures de transfert et de dissection ultérieures.</li>
	<li>Pour éviter l’éclosion des œufs de l’hôte, soumettre les cartes des œufs de l’hôte à une irradiation ultraviolette (UV) de 30 minutes (figure 1-i). Ensuite, coupez le papier contenant les œufs inactivés en cartes d’œufs mesurant 1 cm d’épaisseur et 8 cm de diamètre, chacune contenant environ 300 à 500 œufs (Figure 1-ii)25,26,27.</li>
	<li>Introduire une cohorte de 80 à 120 guêpes T. denrolimi dans un tube de verre de 2 cm de diamètre et 8 cm de longueur. Scellez le tube avec du coton. REMARQUE : Maintenez les guêpes à une température de 25 ± 1 °C, avec un cycle lumière/obscurité de 16 h de lumière et 8 h d’obscurité et maintenez une humidité relative d’environ 75 %.</li>
	<li>Présentez une carte d’œuf hôte aux guêpes pour le parasitage (Figure 1-ii). Laissez les guêpes déposer leurs œufs dans les œufs de l’hôte pendant 6 heures, après quoi retirez rapidement les guêpes. REMARQUE : Évitez de prolonger excessivement la période de parasitage car cela peut entraîner une surpopulation de la progéniture de T. denrolimi dans un œuf hôte, entraînant une augmentation de la mortalité des guêpes de la progéniture28,29.</li>
</ol>2. Synthèse de l’ARNdb
<ol><li>Concevoir des ensembles d’amorces contenant un promoteur T7 pour la synthèse d’ARN double brin (ARNdb). Choisissez un segment de 300 à 400 pb du gène ciblé (Ferhch) pour la synthèse de l’ARNdb.</li>
	<li>Acquérir des ensembles d’amorces synthétisées commercialement pour la production d’ARNdb pour le gène ciblé et deGFP ds pour une utilisation comme contrôle négatif.</li>
	<li>Extraire la teneur en ARN de 100 guêpes T. denrolimi à l’aide du kit référencé en suivant le protocole9 du fabricant. Vérifier la qualité du contenu en ARN ; Continuez si la valeur de OD260/OD280 est comprise entre 1,8 et 2,09.</li>
	<li>Purifier le contenu en ARN avec 2 μL de tampon 5x (1 U/50 μL), 1 μL d’ADN (1 U/50 μL) et 6,5 μL d’ARN (~100 ng/μL), 0,5 μL de H2O à 42 °C pendant 2 min.</li>
	<li>Effectuer une réaction en chaîne par polymérase par transcriptase inverse (RT-PCR) pour générer une matrice d’ADNc avec 10 μL d’ARN purifié (~100 ng/μL), 4 μL de tampon 5x (1 U/50 μL), 1 μL de mélange d’enzymes I (1 U/50 μL) et 4 μL de H2O. Effectuer la RT-PCR en utilisant les paramètres suivants : 37 °C pendant 15 min, 85 °C pendant 5 s. Conservez le produit à ADNc à -4 °C jusqu’à utilisation.</li>
	<li>Effectuer une réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour amplifier les séquences d’ARNdb conformément au mélange maître référencé (10 μL de Taq II [1 U/50 μL], 0,8 μL d’amorce directe [0,4 μM], 0,8 μL d’amorce inverse [0,4 μM], 0,8 μL de matrice d’ADN [40 ng/μL] et 7,6 μL de H2O). Effectuez la PCR en utilisant les paramètres suivants : 94 °C pendant 2 min ; 35 cycles à 94 °C pendant 30 s, 60 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 30 ; 72 °C pendant 2 min.</li>
	<li>Évaluer la qualité des produits de PCR par électrophorèse sur un gel d’agarose à 2,0 % 5,9 et confirmer la séquence cible par séquençage de Sanger.</li>
	<li>Purifier le produit PCR à l’aide du kit d’extraction de gel conformément aux directives du fabricant 9,23.</li>
	<li>Utilisez un système ARNi pour synthétiser l’ARNdb pour le gène cible avec 10 μL de tampon 2x (0,02 U/μL), 8 μL de matrice d’ADN (75 ng/μL) et 2 μL de mélange d’enzymes (1 U/50 μL) avec les réglages suivants : 37 °C pendant 30 min, 70 °C pendant 10 min et 25 °C pendant 20 min. Éluer l’ARNdb synthétisé avec 30 μL d’eau sans nucléase.</li>
	<li>Évaluez la qualité du produit ARNdb en le visualisant sur un gel d’agarose à 1,0 % 5,9. Diluer l’ARNdb à 7 000 ng/μL. Vérifier la qualité du produit d’ARNdb ; Continuez si la valeur de OD260/OD280 est comprise entre 1,8 et 2,09. Conservez le produit à ARNdb à -20 °C jusqu’à utilisation.</li>
</ol>3. Transplantation de pupes de T. denrolimi
<ol><li>Cultiver les œufs de l’hôte parasité pendant environ 8 jours à 25 ± 1 °C, en maintenant un cycle de 16 h de lumière et 8 h d’obscurité et une humidité relative de ~75 %. Les œufs de l’hôte parasité noircissent après 5 jours30 (Figure 1-iv,v).</li>
	<li>Transférez la carte de l’œuf hôte dans un microscope à dissection. Utilisez une paire d’aiguilles en tungstène (figure 1-vi) pour retirer méticuleusement le chorion des œufs de l’hôte (figure 1-vii) et récupérer la nymphe de l’intérieur (figure 1-viii)5,17,18. REMARQUE : La pointe de l’aiguille de dissection doit être inférieure à 0,05 mm.</li>
	<li>Préparez une assiette propre pour le substrat. Verser 10 à 15 mL d’une solution de gélose à 15 g/L, en la laissant refroidir naturellement (figure 2-i). REMARQUE : Mélanger la solution de gélose avec 0,5 g de streptomycine pour inhiber la croissance des contaminants in vitro.</li>
	<li>Utiliser un séchoir désinfecté pour graver plusieurs rainures de 0,2 à 0,3 mm de profondeur et de 0,4 à 0,8 mm de largeur (figure 2-ii).</li>
	<li>À l’aide d’une petite brosse (figure 2-iii), transplanter une nymphe de l’œuf hôte disséqué dans l’une des rainures du substrat de gélose (figure 2-iv).</li>
	<li>Répéter les étapes 3.4 et 3.5, en transplantant 100 à 300 pupes individuellement dans les rainures une par une (figure 2-v).</li>
</ol>4. Micro-injection d’ARNdb dans la chrysalide de T. denrolimi
<ol><li>Utilisez un extracteur d’aiguille en verre pour tirer un capillaire en verre (Figure 3-i,ii). Réglez la chaleur sur 280, la vitesse sur 170, le délai sur 250 et la traction sur 30 sur un extracteur d’aiguille (Figure 3-iii). Préparez plusieurs aiguilles capillaires en verre pour la microinjection (Figure 3-iv,v).</li>
	<li>Biseauter la pointe de l’aiguille de verre à l’aide d’une plaque abrasive (Figure 3-vi). REMARQUE : Assurez-vous que la pointe de l’aiguille d’injection reste tranchante ; sinon, cela peut entraîner la mortalité des nymphes ou entraver l’écoulement du réactif à travers l’aiguille (figure 3-vii).</li>
	<li>Chargez environ 2 μL de la solution d’injection d’ARNdb avec 7 000 ng/μL dans l’aiguille d’injection préparée à l’aide d’une pompe à micro-injection (Figure 3-vii).</li>
	<li>Transférez le substrat de gélose contenant des centaines de pupes sur la plate-forme d’un microscope composé (Figure 3-viii).</li>
	<li>Insérez soigneusement l’aiguille d’injection dans l’abdomen d’une chrysalide de T. denrolimi à un angle de ~30° par rapport à l’abdomen sous le cristallin (figure 3-ix).</li>
	<li>Injecter progressivement ~5 nL de la solution injectable (étape 4.3) dans la nymphe de T. denrolimi aussi doucement que possible. REMARQUE : La nymphe de T. denrolimi peut légèrement gonfler lorsque la solution d’ARNdb est injectée. L’injection d’une quantité excessive de solution dans la nymphe ou l’utilisation d’aiguilles avec des ouvertures trop grandes peut entraîner la mort prématurée de la nymphe. Changez les aiguilles lorsqu’elles sont obstruées après avoir injecté plusieurs à dizaines de nymphes.</li>
	<li>Répétez les étapes 4.5 et 4.6, en injectant l’ARNdb dans 600 pupes une par une. REMARQUE : Pour une analyse RT-qPCR fiable, la teneur en ARN doit être isolée d’au moins 100 nymphes. Injecter au moins 600 pupes pour trois répétitions dans le traitement à ARNdb et trois répétitions dans le témoin négatif dsGFP 9.</li>
</ol>5. Incubation des pupes de T. denrolimi
<ol><li>Transférer le substrat contenant les pupes injectées dans un incubateur à 25 ± 1 °C avec un cycle lumière/obscurité de 16 h/8 h et ~75 % HR.</li>
	<li>Incuber environ 700 pupes de T. denrolimi par traitement pendant 24 h ou 48 h. Extraire le contenu en ARN d’un groupe de 100 pupes par répétition :9. REMARQUE : Retirer les pupes rétrécies (pupes mortes) des échantillons ; sinon, cela peut entraîner des erreurs dans la détection de l’expression des gènes.</li>
	<li>Incuber ~50 pupes de T. denrolimi par traitement jusqu’à l’émergence des guêpes (figure 3-x). Enregistrer le taux d’émergence et le taux de déformation.</li>
</ol>6. Détection de l’expression génique ciblée
<ol><li>Concevez l’ensemble d’amorces pour le gène cible et les gènes de référence pour la RT-qPCR à l’aide d’un outil de conception. REMARQUE : Assurez-vous que les séquences des amorces RT-qPCR ne chevauchent pas la région ciblée de l’ARNdb.</li>
	<li>Utiliser le gène forkhead box O (FoxO) comme gène de référence dans l’analyse RT-qPCR ; les amorces de FoxO ont été signalées précédemment9.</li>
	<li>Procurez-vous des ensembles d’amorces synthétisées dans le commerce. Effectuer la RT-qPCR avec 10 μL de Taq II (1 U/50 μL), 0,8 μL d’amorce directe (0,4 μM), 0,8 μL d’amorce inverse (0,4 μM), 0,8 μL de matrice (10 ng/μL) et 7,6 μL de H2O. Effectuer la RT-qPCR en utilisant les paramètres suivants : 95 °C pendant 30 s ; 35 cycles à 95 °C pendant 5 s, 57 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 30 ; 95 °C pendant 10 s ; 60 °C pendant 5 s et 95 °C pendant 5 s.</li>
	<li>Calculer la valeur d’expression du gène ciblé en utilisant la méthode 2-ΔΔCt 9,25.</li>
	<li>Utilisez le test de Kruskal-Wallis pour analyser l’expression du gène cible sous l’influence de différents traitements (dsFerhch, dsGFP, non-injection). REMARQUE : Évitez d’utiliser des tests paramétriques (p. ex., test t) pour les comparaisons a posteriori, car l’hétéroscédasticité et la non-normalité des données peuvent conduire à des conclusions erronées25.</li>
</ol>

Avancement des techniques ARNi chez Trichogramma dendrolimi pour l’analyse de la fonction des gènes

<ol>
	<li>Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+control+with+Trichogramma+in+China:+History,+present+status+and+perspectives.">Biological control with Trichogramma in China: History, present status and perspectives.</a> Annu Rev Entomol. 66, 463-484 (2020).</li><li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+clutch+size+for+quality+control+of+bisexual+and+Wolbachia-infected+thelytokous+lines+of+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+(Hymenoptera:+Trichogrammatidae)+mass+reared+on+eggs+of+a+substitutive+host,+Antheraea+pernyi+Gu&#233;rin-M&#233;neville+(Lepidoptera:+Saturniidae).">Optimal clutch size for quality control of bisexual and Wolbachia-infected thelytokous lines of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) mass reared on eggs of a substitutive host, Antheraea pernyi Gu&#233;rin-M&#233;neville (Lepidoptera: Saturniidae).</a> Pest Manag Sci. 76 (8), 2635-2644 (2020).</li><li>Li, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+the+biological+control+of+the+fall+armyworm+Spodoptera+frugiperda+by+egg+parasitoids.">Current status of the biological control of the fall armyworm Spodoptera frugiperda by egg parasitoids.</a> J Pest Sci. 96, 1345-1363 (2023).</li><li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+and+superparasitism+on+quality+and+characteristics+of+thelytokous+Wolbachia-infected+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+(Hymenoptera:+Trichogrammatidae)+during+mass+rearing.">Effects of temperature and superparasitism on quality and characteristics of thelytokous Wolbachia-infected Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) during mass rearing.</a> Sci Rep. 9 (1), 18114 (2019).</li><li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetrance+during+Wolbachia-mediated+parthenogenesis+of+Trichogramma+wasps+is+reduced+by+continuous+oviposition,+associated+with+exhaustion+of+Wolbachia+titers+in+ovary+and+offspring+eggs.">Penetrance during Wolbachia-mediated parthenogenesis of Trichogramma wasps is reduced by continuous oviposition, associated with exhaustion of Wolbachia titers in ovary and offspring eggs.</a> Pest Manag Sci. 78 (7), 3080-3089 (2022).</li><li>Huang, N. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+and+large-scale+releases+of+Trichogramma+promote+pesticide+decrease+in+maize+in+northeastern+China.">Long-term and large-scale releases of Trichogramma promote pesticide decrease in maize in northeastern China.</a> Entomol Gen. 40 (4), 331-335 (2020).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+Trichogramma+japonicum+as+a+vector+of+Beauveria+bassiana+for+parasitizing+eggs+of+rice+striped+stem+borer,+Chilo+suppressalis.">Performance of Trichogramma japonicum as a vector of Beauveria bassiana for parasitizing eggs of rice striped stem borer, Chilo suppressalis.</a> Entomol Gen. 41 (2), 147-155 (2021).</li><li>Ning, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+and+expression+pattern+of+the+sex+determination+genes+and+their+sex-specific+variants+in+the+egg+parasitoid+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+(Hymenoptera:+Trichogrammatidae).">The identification and expression pattern of the sex determination genes and their sex-specific variants in the egg parasitoid Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae).</a> Front Physiol. 14, 1243753 (2023).</li><li>Huo, L. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+evaluation+of+RT-qPCR+reference+genes+for+expression+analysis+in+the+tiny+egg+parasitoid+wasp,+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+(Hymenoptera:+Trichogrammatidae).">Selection and evaluation of RT-qPCR reference genes for expression analysis in the tiny egg parasitoid wasp, Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae).</a> J Asia Pac Entomol. 25 (2), 101883 (2022).</li><li>Leung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+biological+control:+the+need+for+integrating+genetics+and+genomics.">Next-generation biological control: the need for integrating genetics and genomics.</a> Biol Rev Camb Philos Soc. 95 (6), 1838-1854 (2020).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Leonard, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+symbionts+activate+honey+bee+immunity+and+limit+pathogens.">Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens.</a> Science. 367 (6477), 573-576 (2020).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+an+essential+gene+involved+in+infestation+and+digestion+in+grain+aphid+through+plant-mediated+RNA+interference+generates+aphid-resistant+wheat+plants.">Silencing an essential gene involved in infestation and digestion in grain aphid through plant-mediated RNA interference generates aphid-resistant wheat plants.</a> Plant Biotechnol J. 17 (5), 852-854 (2019).</li><li>Li, M., Bui, M., Akbari, O. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia-Driven+Memory+Loss+in+a+Parasitic+Wasp+Increases+Superparasitism+to+Enhance+Horizontal+Transmission.">Wolbachia-Driven Memory Loss in a Parasitic Wasp Increases Superparasitism to Enhance Horizontal Transmission.</a> mBio. 13 (6), e0236222 (2022).</li><li>Ning, S. F., Zhou, J. C., Liu, Q. Q., Zhao, Q., Dong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradual,+temperature-induced+change+of+secondary+sexual+characteristics+in+Trichogramma+pretiosum+infected+with+parthenogenesis-inducing+Wolbachia.">Gradual, temperature-induced change of secondary sexual characteristics in Trichogramma pretiosum infected with parthenogenesis-inducing Wolbachia.</a> PeerJ. 7, e7567 (2019).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+Wolbachia+titers+cause+gradual+change+in+masculinization+of+intersex+individuals+of+thelytokous+Trichogramma+dendrolimi.">Decreased Wolbachia titers cause gradual change in masculinization of intersex individuals of thelytokous Trichogramma dendrolimi.</a> Entomol Gen. 42 (5), 751-759 (2022).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-parasitism:+A+promising+approach+to+simultaneously+produce+Trichogramma+chilonis+and+T.+dendrolimi+on+eggs+of+Antheraea+pernyi.">Multi-parasitism: A promising approach to simultaneously produce Trichogramma chilonis and T. dendrolimi on eggs of Antheraea pernyi.</a> Entomol Gen. 41 (6), 627-636 (2021).</li><li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Thelytokous+parthenogenesis-inducing+Wolbachia+on+the+fitness+of+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+(Hymenoptera:+Trichogrammatidae)+in+superparasitised+and+single-parasitised+hosts.">Effects of Thelytokous parthenogenesis-inducing Wolbachia on the fitness of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) in superparasitised and single-parasitised hosts.</a> Front Ecol Evol. 9, 730664 (2021).</li><li>Flanders, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notes+on+the+life+history+and+anatomy+of+Trichogramma.">Notes on the life history and anatomy of Trichogramma.</a> Ann Entomol Soc Am. 30 (2), 304-308 (1937).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Les guêpes Trichogramma sont reconnues comme des agents de lutte biologique efficaces, ciblant spécifiquement une gamme de lépidoptères nuisibles dans l’agriculture et la foresterie1. Ces guêpes minuscules subissent leurs stades immatures dans l’œuf hôte, une caractéristique qui présente des défis dans la réalisation d’expériences ARNi 5,18. Cette étude offre un guide visuel complet pour la réalisation d’exp?...

Trichogramma spp. est un groupe de parasitoïdes d’œufs qui ont été largement utilisés comme agents de lutte biologique très efficaces contre un large éventail de lépidoptères nuisibles dans les écosystèmes agricoles et forestiers du monde entier 1,2,3,4. L’application de Trichogramma élevé en masse offre une approche respectueuse de l’environnement pour la gestion durable des ravageurs 5,6,7. La compréhension de la biologie moléculaire des guêpes Trichogramma fournit des informations précieuses pour améliorer l’efficacité de l’élevage de masse et les performances sur le terrain de ces agents de lutte biologique 8,9 en étudiant la méthodologie de régulation des gènes et d’édition du génome10.
Depuis la découverte de l’interférence génétique spécifique médiée par l’ARN double brin (ARNdb) chez Caenorhabditis elegans en 1998, la méthode d’interférence ARN (ARNi) est devenue une boîte à outils génétique vitale pour explorer les mécanismes de régulation des organismes en supprimant l’expression des gènes cibles11. Les expériences sur l’ARNi sont devenues une méthodologie standard largement appliquée pour étudier la fonction des gènes chez de nombreuses espèces d’insectes12,13. Néanmoins, la manipulation de l’ARNi présente un défi redoutable chez de nombreuses espèces de parasitoïdes, en particulier parmi celles appartenant à la famille endoparasite des Chalcidoidea 14,15,16. La méthode ARNi a été documentée chez au moins 13 espèces de parasitoïdes 14,15,16,17,18,19. Parmi celles-ci, l’approche ARNi a été menée de manière exhaustive chez les guêpes Nasonia et est applicable tout au long des stades de développement, y compris les embryons, les larves, les pupes et les adultes 14,15,16. Il est à noter que les guêpes Nasonia sont des ectoparasitoïdes, leur progéniture se développant dans l’espace interstitiel entre la chrysalide hôte et la nymphe hôte, ce qui permet leur culture in vitro et leur fait tolérer certains traitements, comme la micro-injection. Contrairement aux guêpes Nasonia, les individus de Trichogramma subissent tout leur développement embryonnaire, larvaire et nymphal à l’intérieur de l’œuf hôte. La couche aux stades embryon et larvaire (qui peut entraver la perméabilité de l’ARNdb), la vulnérabilité aux dommages et la difficulté de survivre in vitro constituent des obstacles redoutables 20,21,22. De plus, la petite taille des individus de Trichogramma, environ ~0,5 mm de longueur adulte ou nymphale, les rend extrêmement complexes à manipuler 20,21,22.
Dans la présente étude, nous décrivons une procédure complète pour mener des expériences d’interférence ARN (ARNi) chez Trichogramma denrolimi Matsumura. Cette procédure comprend les procédures suivantes : (1) la conception et la synthèse d’ARN double brin (ARNdb), (2) la micro-injection de pupes de T. denrolimi, (3) la transplantation et l’incubation in vitro de ces nymphes, et (4) la détection de l’inactivation du gène cible par analyse RT-qPCR. Le gène cible sélectionné pour l’expérience ARNi est l’homologie de la chaîne lourde de ferritine (Ferhch). FerHCH, une protéine liant le fer, contient un centre ferroxydase doté de capacités antioxydantes, facilitant l’oxydation de Fe2+ en Fe3+. Il joue un rôle indispensable dans la croissance et le développement de divers organismes en maintenant l’équilibre redox et l’homéostasie du fer. L’épuisement du FerHCH peut entraîner une suraccumulation de fer, entraînant des lésions tissulaires irréversibles et aboutissant souvent à des altérations phénotypiques importantes, notamment des défauts de croissance, des déformations et la mortalité 23,24. Cette étude offre un guide étape par étape pour la conduite de l’ARNi chez T. denrolimi, qui sera inestimable pour étudier les fonctions des gènes dans le contexte plus large des guêpes Trichogramma.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2x ES Taq MasterMix (Dye)</td>
			<td>Cowin Biotech, China</td>
			<td>CW0690H</td>
			<td>To amplify the dsRNA sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6)</td>
			<td>Sangon Biotech, China</td>
			<td>B540627-0500</td>
			<td>To dilute dsRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar strip</td>
			<td>Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, China</td>
			<td>n/a</td>
			<td>To make culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium</td>
			<td>Sangon Biotech, China</td>
			<td>A610028</td>
			<td>To make culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioer Constant temperature metal bath&#160;</td>
			<td>BIOER, China</td>
			<td>MB-102</td>
			<td>To synthesis dsRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary&#160;</td>
			<td>WPI, USA</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td>To pull capillary glass needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean bench&#160;</td>
			<td>Airtech, China</td>
			<td>SW-CJ-1FD</td>
			<td>To extract RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double distilled water</td>
			<td>Sangon Biotech, China</td>
			<td>A500197-0500</td>
			<td>To dilute cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental Testing chamber&#160;</td>
			<td>Panasonic, Japan</td>
			<td>MLR-352H-PC</td>
			<td>To culture T. denrolimi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendrof, Germany</td>
			<td>5418R</td>
			<td>To store RNA content</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf FemtoJet 4i</td>
			<td>Eppendrof, Germany</td>
			<td>FemtoJet 4i</td>
			<td>To inject T. denrolimi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Refrigerated Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendrof, Germany</td>
			<td>5810R</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol solution (75%, RNase-free)</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>M052131-500ml</td>
			<td>To extract RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Extraction Kit</td>
			<td>Omega, USA</td>
			<td>D25000-02</td>
			<td>To extract cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GUM Arabic</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>CG5991-500g</td>
			<td>To make egg card</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alchohol</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>80109218</td>
			<td>To extract RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-Based Micropipette Puller&#160;</td>
			<td>SUTTER, USA</td>
			<td>P-2000</td>
			<td>To pull capillary glass needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader&#160;</td>
			<td>Eppendrof, Germany</td>
			<td>20 &#181;L</td>
			<td>To load dsRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-sample tissue grinder&#160;</td>
			<td>LICHEN, China</td>
			<td>LC-TG-24</td>
			<td>To grind T. denrolimi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Grinder&#160;</td>
			<td>SUTTER, USA</td>
			<td>BV-10-E</td>
			<td>To grind capillary glass needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Sangon Biotech, China</td>
			<td></td>
			<td>To dilute RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLYMPUS Microscope</td>
			<td>OLYMPUS, Japan</td>
			<td>XZX16</td>
			<td>To observe T. denrolimi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine&#160;</td>
			<td>Bio-rad, USA</td>
			<td>S-1000</td>
			<td>For DNA amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic</td>
			<td>Bio-rad, USA</td>
			<td>PowerPacTM Basic</td>
			<td>To detect the quality of dsRNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer of dsGFP (Forward)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[TAATACGACTCACTATAGGG] 
			ACAAACCAAGGCAAGTAATA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer of dsGFP (Reverse)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[TAATACGACTCACTATAGGG] 
			CAGAGGCATCTTCAACG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer of Ferhch for qPCR (Forward)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer of Ferhch for qPCR (Reverse)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer of Ferhch for RNAi (Reverse)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[TAATACGACTCACTATAGGG]AG 
			TAGCCATCATCTTTCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer of Ferhch for RNAi(Forward)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[TAATACGACTCACTATAGGG] 
			ACACTGTCAATCGTCCTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer of FoxO for qPCR (Forward)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CTACGCCGATCTCATAACGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer of FoxO for qPCR (Reverse)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TGCTGTCGCCCTTGTCCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)</td>
			<td>TaKaRa, Japan</td>
			<td>RR047A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantitative Real-time PCR&#160;</td>
			<td>Bio-rad, USA</td>
			<td>CFX 96 Touch</td>
			<td>To perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RiBoMAX Express RNAi System</td>
			<td>Promega, USA</td>
			<td>P1700</td>
			<td>To synthesis dsRNA &#160;in vitro&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Premix Ex TaqTM <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66250/66250eq01.jpg" style="margin: auto;" /> (Til RnaseH Plus)</td>
			<td>TaKaRa, Japan</td>
			<td>RR820A</td>
			<td>To perform RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloromethane</td>
			<td>KESHI, China</td>
			<td>GB/T682-2002</td>
			<td>To extract RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Ambion, USA</td>
			<td>15596018</td>
			<td>To extract total RNA content from samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low Temperature Freezer&#160;</td>
			<td>Thermo, USA</td>
			<td>Forma 911</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna interference in the egg parasitoid, trichogramma dendrolimi matsumura

Les parasitoïdes des œufs, Trichogramma spp, sont reconnus comme des agents de lutte biologique efficaces contre divers lépidoptères nuisibles dans l’agriculture et les forêts. Les stades immatures de la progéniture de Trichogramma se développent dans l’œuf hôte, présentant une diminution remarquable (environ 0,5 mm de longueur adulte). La méthodologie d’interférence ARN (ARNi) est devenue un outil crucial pour élucider les fonctions des gènes dans de nombreux organismes. Cependant, la manipulation de l’ARNi chez certaines petites espèces de parasitoïdes, comme Trichogramma, a généralement posé des défis importants. Dans cette étude, nous présentons une méthode ARNi efficace chez Trichogramma denrolimi. La procédure décrite comprend l’acquisition et l’isolement de spécimens individuels de T. dendrolimi à partir d’œufs hôtes, la conception et la synthèse d’ARN double brin (ARNdb), la transplantation et la culture in vitro de pupes de T. dendrolimi , la micro-injection d’ARNdb et l’évaluation ultérieure de l’inactivation du gène cible par analyse RT-qPCR. Cette étude fournit une procédure complète et visuellement détaillée pour mener des expériences sur l’ARNi chez T. dendrolimi, permettant ainsi aux chercheurs d’étudier la régulation des gènes chez cette espèce. De plus, cette méthodologie est adaptable pour les études d’ARNi ou les micro-injections chez d’autres espèces de Trichogramma avec des ajustements mineurs, ce qui en fait une référence précieuse pour mener des expériences d’ARNi chez d’autres espèces endoparasitaires.

Trichogramma spp. are a group of egg parasitoids that have been extensively utilized as highly efficient biological control agents against a wide spectrum of lepidopteran pests in agricultural and forest ecosystems worldwide1,2,3,4. The application of mass-reared Trichogramma provides an environmentally friendly approach for the sustainable management of pests5,6,7. Understanding the molecular biology of Trichogramma wasps provides valuable insights into enhancing the mass-rearing efficiency and field performance of these biological control agents8,9by investigating the methodology of gene regulation and genome editing10.
Since the discovery of double-stranded RNA (dsRNA)-mediated specific genetic interference in Caenorhabditis elegans in 1998, the RNA-interference (RNAi) method has evolved into a vital genetic toolkit for exploring the regulatory mechanisms of organisms by suppressing the expression of target genes11. RNAi experiments have become a standard methodology widely applied to study gene function in numerous insect species12,13. Nevertheless, the manipulation of RNAi presents a formidable challenge in many parasitoid species, particularly among those belonging to the endoparasitic Chalcidoidea family14,15,16. The RNAi method has been documented in at least 13 parasitoid species14,15,16,17,18,19. Among these, the RNAi approach has been comprehensively conducted in Nasonia wasps and is applicable throughout the developmental stages, including embryos, larvae, pupae, and adults14,15,16. It is noteworthy that Nasonia wasps are ectoparasitoids, with their offspring developing in the interstitial space between the host pupa and the puparium, enabling their cultivation in vitro and making them tolerate certain treatments, such as micro-injection. Unlike Nasonia wasps, Trichogramma individuals undergo their entire embryonic, larval, and pupal development inner the host egg. The layer at embryo and larva stages (which may impede dsRNA permeability), vulnerability to damage, and the difficulty in surviving in vitro present formidable obstacles20,21,22. Additionally, the diminutive size of Trichogramma individuals, approximately ~0.5 mm in adult or pupal length, renders them exceedingly intricate to manipulate20,21,22.
In the present study, we outline a comprehensive procedure for conducting RNA interference (RNAi) experiments in Trichogramma denrolimi Matsumura. This procedure encompasses the following procedures: (1) the design and synthesis of double-stranded RNA (dsRNA), (2) microinjection of T. denrolimi pupae, (3) the transplantation and in vitro incubation of these pupae, and (4) the detection of target gene knockdown through RT-qPCR analysis. The target gene selected for the RNAi experiment is the ferritin heavy chain homology (Ferhch). FerHCH, an iron-binding protein, contains a ferroxidase center endowed with antioxidant capabilities, facilitating the oxidation of Fe2+ to Fe3+. It plays an indispensable role in the growth and development of various organisms by maintaining redox equilibrium and iron homeostasis. Depletion of FerHCH can result in the overaccumulation of iron, leading to irreversible tissue damage, and often culminating in significant phenotypic alterations, including growth defects, deformities, and mortality23,24. This study offers a step-by-step guide for conducting RNAi in T. denrolimi, which will be invaluable for investigating the gene functions within the broader context of Trichogramma wasps.

Pleins feux sur l’auteur : Étude de la parthénogenèse thélytokous induite par Wolbachia et du développement d’une boîte à outils génétique par interférence ARN

Interférence de l’ARN chez le parasitoïde de l’œuf, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Le taux d’émergence des pupes de T. denrolimi injectées avec dsFerhch était significativement inférieur à celui de celles injectées avec dsGFP ou de celles sans injection (tableau 1). Parmi les guêpes émergées, 51,85 % des guêpes T. denrolimi soumises au dsFerhch ont développé de petites ailes déformées. Les guêpes déformées n’ont pas été observées chez les guêpes injectées avec dsGFP ou sans aucune injection (tableau...

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La manipulation de l’interférence ARN (ARNi) présente un défi formidable chez de nombreuses espèces de parasitoïdes de petite taille, telles que les guêpes Trichogramma . Cette étude a permis de définir une méthode ARNi efficace chez Trichogramma denrolimi. La présente méthodologie fournit un modèle robuste pour étudier la régulation des gènes chez les guêpes Trichogramma .

The egg parasitoids, Trichogramma spp, are recognized as efficient biological control agents against various lepidopteran pests in agriculture and ...

Les guêpes trichogrammes sont un groupe de parasitoïdes d’œufs utilisés pour lutter contre les lépidoptères nuisibles en agriculture. La bactérie intracellulaire Wolbachia induit la parthénogenèse lytokous chez certaines guêpes Trichogramma. Nous essayons de répondre au mécanisme de Wolbachia et aux systèmes de détermination du sexe chez les guêpes Trichogramma.Nous avons développé la méthode d’interférence ARN chez les guêpes Trichogramma. Cette méthode est une boîte à outils génétique vitale pour étudier les fonctions des gènes de Trichogramma. Les stades immatures de la progéniture de Trichogramma se développent dans l’œuf hôte.La taille du corps de Trichogramma est extrêmement petite et mesure environ 0,5 millimètre de longueur adulte. La manipulation d’outils génétiques tels que l’interférence ARN et l’édition du génome représente un défi de taille pour ces minuscules guêpes parasitoïdes. Pendant des décennies, les fonctions des gènes au sein de l’ensemble du genre Trichogramma ont été rarement explorées.La présente méthodologie fournit un modèle robuste pour étudier la régulation des gènes au cours des activités développementales et physiologiques chez les guêpes Trichogramma.

rna-interference-egg-parasitoid-trichogramma-dendrolimi

Research

JoVE Journal

Biology

RNA Interference in the Egg Parasitoid, Trichogramma dendrolimi Matsumura

1.1K vues.  Shenyang Agricultural University. Les guêpes trichogrammes sont un groupe de parasitoïdes d’œufs utilisés pour lutter contre les lépidoptères nuisibles en agriculture. La bactérie intracellulaire Wolbachia induit la parthénogenèse lytokous chez certaines guêpes Trichogramma. Nous essayons de répondre au mécanisme de Wolbachia et aux systèmes de détermination du sexe chez les guêpes Trichogramma.Nous avons développé la méthode d’interférence ARN chez les guêpes Trichogramma. Cette méthode est un...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Étude de la parthénogenèse thélytokous induite par Wolbachia et du développement d’une boîte à outils génétique par interférence ARN

The egg parasitoids, Trichogramma spp, are recognized as efficient biological control agents against various lepidopteran pests in agriculture and forests. The immature stages of Trichogramma offspring develop within the host egg, exhibiting remarkable diminutiveness (approximately 0.5 mm in adult length). RNA-interference (RNAi) methodology has emerged as a crucial tool for elucidating gene functions in numerous organisms. However, manipulating RNAi in certain small parasitoid species, such as Trichogramma, has generally posed significant challenges. In this study, we present an efficient RNAi method in Trichogramma denrolimi. The outlined procedure encompasses the acquisition and isolation of individual T. dendrolimi specimens from host eggs, the design and synthesis of double-stranded RNA (dsRNA), the in vitro transplantation and cultivation of T. dendrolimi pupae, the micro-injection of dsRNA, and the subsequent assessment of target gene knockdown through RT-qPCR analysis. This study furnishes a comprehensive, visually detailed procedure for conducting RNAi experiments in T. dendrolimi, thereby enabling researchers to investigate the gene regulation in this species. Furthermore, this methodology is adaptable for RNAi studies or micro-injections in other Trichogramma species with minor adjustments, rendering it a valuable reference for conducting RNAi experiments in other endoparasitic species.

The manipulation of RNA interference (RNAi) presents a formidable challenge in many parasitoid species with diminutive size, such as Trichogramma wasps. This study delineated an efficient RNAi method in Trichogramma denrolimi. The present methodology provides a robust model for investigating gene regulation in Trichogramma wasps.