L’objectif principal de cette procédure est de mettre en œuvre un protocole complet pour la culture et la caractérisation des microphages sur différentes surfaces d’implants et la caractérisation des sous-types de microphages. Plusieurs méthodes sont utilisées dans le cadre de cette caractérisation, notamment qRT-PCR, EISA et CLSM, pour déterminer les profils d’expression génique, les protéines sécrétoires et les marqueurs de surface cellulaire. Les résultats montrent l’utilité et l’efficacité du protocole mis en œuvre pour polariser les microphages et les surfaces des implants, et les identifier avec précision en fonction de l’expression des gènes, des protéines sécrétées et des marqueurs de surface cellulaire.
De plus, les marqueurs décrivent des modèles d’expression spécifiques et cohérents qui peuvent être utilisés pour distinguer différents sous-types de MDM. Dans l’ensemble, l’étude contribuera au développement et à la conception de matériaux immunomodulateurs pour améliorer et promouvoir les processus de régénération tissulaire réussis, prévenir l’inflammation chronique associée aux implants et améliorer l’intégration réussie des implants. Pour commencer, mettez en suspension les cellules mononucléées isolées du sang périphérique humain dans 15 millilitres de milieu de fixation monocytaire préchauffé et transférez-les dans une fiole de culture cellulaire T-75.
Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 90 minutes pour l’adhérence. Après l’incubation, jetez le surnageant et lavez les cellules une fois avec un milieu RPMI 1640 préchauffé, complété par 10 % de FBS et 1 % de pénicilline et de streptomycine en inclinant doucement le ballon pour éliminer les cellules non adhérentes ou faiblement adhérentes. Ajoutez 15 millilitres de milieu complet contenant 10 nanogrammes par millilitre de facteur de stimulation des colonies de macrophages aux cellules adhérentes.
Et incuber pendant six jours pour favoriser la différenciation. Après la différenciation, retirez le milieu de culture du ballon et lavez les cellules avec 10 millilitres de PBS pendant cinq minutes. Pour détacher les cellules d’adhérence, ajoutez 10 millilitres de solution de détachement de cellules préchauffée et incubez pendant 30 minutes.
Ensuite, tapotez doucement le ballon pour libérer les cellules et transférez-les dans un tube de 50 millilitres. Pour détacher les cellules restantes, ajoutez 10 millilitres de PBS dans le ballon et mettez les cellules au rebut. Transférez les cellules détachées dans le tube de 50 millilitres.
Centrifugez la suspension cellulaire détachée à 300 g pendant 10 minutes et jetez le surnageant avant de remettre les cellules en suspension dans cinq millilitres de milieu complet préchauffé. À l’aide de la coloration au bleu de trypan, comptez les cellules sur un hémocytomètre pour déterminer le nombre et la viabilité des cellules. Préparez la suspension cellulaire en ajustant le nombre de cellules à 160 000 cellules par millilitre de milieu complet.
Ensuite, nettoyez les disques de biomatériau par ultrasons avec de l’éthanol à 70 % pendant cinq minutes, puis stérilisez avec de l’éthanol à 70 % pendant 30 minutes. Après avoir séché les disques de titane, placez-les dans une plaque non traitée à 24 puits et ajoutez un millilitre de suspension cellulaire préparée dans chaque puits. Incuber les cellules pendant 48 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pour obtenir des macrophages M0.
Pour obtenir des macrophages polarisés M1, ajoutez de l’interféron gamma et du lipopolysaccharide dans les puits d’une plaque de 24 puits. Pour la polarisation M2, ajoutez l’interleukine-4 et l’interleukine-13. Incuber les cellules pendant 48 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pour induire la polarisation.
Après avoir obtenu des macrophages polarisés dérivés de monocytes à partir de cellules mononucléées du sang périphérique humain, prélevez le surnageant cellulaire dans un tube de 1,5 millilitre. Transférez le disque en titane sur une nouvelle plaque à 24 puits. Centrifugez le surnageant cellulaire à 300 g pendant cinq minutes et transférez le surnageant dans un nouveau tube.
Mesurez les cytokines et les chimiokines à 450 nanomètres selon les instructions spécifiques fournies par le fabricant. Calculez la concentration de cytokines ou de chimiokines sécrétées à l’aide de la courbe standard. Mesurez la quantité totale de protéines à l’aide du kit de dosage des protéines d’acide bicinchoninique.
Normaliser la concentration de protéines sécrétées en milligrammes de protéines totales. Lavez les macrophages polarisés deux fois dans 800 microlitres de PBS. Incuber les disques dans 400 microlitres de tampon de fixation pendant 20 minutes à température ambiante.
Après avoir retiré le tampon de fixation, lavez les disques trois fois dans 400 microlitres de PBS. Maintenant, incubez les disques avec 400 microlitres de tampon de blocage pendant 30 minutes pour bloquer les sites de liaison non spécifiques. Jetez le tampon de blocage et incubez les disques pendant une heure avec des anticorps primaires dilués dans 400 microlitres de tampon de coloration.
Au bout d’une heure, retirez les anticorps primaires et lavez les disques trois fois avec 400 microlitres de tampon de lavage. Ajoutez du fluor pour les anticorps secondaires marqués dilués dans un tampon de coloration et incubez pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité. Après l’incubation, laver les échantillons trois fois dans le tampon de lavage pendant trois minutes chacune.
Ajoutez 10 millimolaires de DRAQ5 dans du PBS et incubez pendant 15 minutes dans l’obscurité. Ensuite, retirez le surnageant et lavez les disques une fois avec du PBS. Ajoutez une goutte de support de montage, et après cinq minutes, appliquez les verres de protection et laissez sécher les échantillons pendant une heure.
Après séchage, scellez les bords avec du vernis à ongles transparent. Pour obtenir une vue d’ensemble des cellules, imagez les échantillons sur un microscope confocal à balayage laser sous un grossissement de 25X. Modifiez le grossissement à 63X pour déterminer la structure et la localisation des marqueurs de surface.
Les macrophages primaires dérivés de monocytes ont été polarisés avec succès en macrophages M1 et M2 sur les surfaces en titane, le CCR7 étant plus fortement exprimé dans les macrophages M1 et CD209 dans les macrophages M2. L’analyse qRT-PCR a montré une polarisation réussie des macrophages primaires dérivés des monocytes sur les surfaces du titane et de la lamelle de recouvrement avec une expression élevée de CCR7 et TNF-alpha pour M1 et CD209 et CCL13 pour M2. Des niveaux élevés de cytokines inflammatoires TNF-alpha et de chimiokines CCL13 ont confirmé la polarisation M1 et M2 au niveau de la protéine.
