O principal objetivo deste procedimento é implementar um protocolo abrangente para a cultura e caracterização de micrófagos em diferentes superfícies de implantes e caracterização dos subtipos de micrófagos. Vários métodos são empregados como parte dessa caracterização, incluindo qRT-PCR, EISA e CLSM, para determinar os perfis de expressão gênica, proteínas secretoras e marcadores de superfície celular. Os resultados mostram a utilidade e eficácia do protocolo implementado na polarização de micrófagos e superfícies de implantes, e na identificação precisa deles com base na expressão gênica, proteínas secretadas e marcadores de superfície celular.
Além disso, os marcadores descrevem padrões de expressão consistentes e específicos de revolta que podem ser usados para distinguir diferentes subtipos de MDMs. No geral, o estudo contribuirá para o desenvolvimento e design de materiais imunomoduladores para melhorar e promover processos de regeneração tecidual bem-sucedidos, prevenir a inflamação crônica associada ao implante e melhorar a integração bem-sucedida do implante. Para começar, ressuspenda as células mononucleares isoladas do sangue periférico humano em 15 mililitros de meio de ligação de monócitos pré-aquecidos e transfira-as para um frasco de cultura de células T-75.
Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 90 minutos para adesão. Após a incubação, descarte o sobrenadante e lave as células uma vez com um meio RPMI 1640 pré-aquecido, suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina e estreptomicina, inclinando suavemente o frasco para remover as células não aderentes ou frouxamente aderidas. Adicione 15 mililitros de meio completo contendo 10 nanogramas por mililitro de fator estimulador de colônias de macrófagos às células aderentes.
E incubar por seis dias para promover a diferenciação. Após a diferenciação, retirar o meio de cultura do balão e lavar as células com 10 mililitros de PBS durante cinco minutos. Para separar as células de aderência, adicione 10 mililitros de solução de descolamento de células pré-aquecida e incube por 30 minutos.
Em seguida, bata suavemente no frasco para liberar as células e transferi-las para um tubo de 50 mililitros. Para separar as células restantes, adicione 10 mililitros de PBS no frasco e descarte as células. Transfira as células separadas para o tubo de 50 mililitros.
Centrifugar a suspensão de células destacadas a 300 g durante 10 minutos e rejeitar o sobrenadante antes de ressuspender as células em cinco mililitros de meio completo pré-aquecido. Usando a coloração com azul de tripano, conte as células em um hemocitômetro para determinar o número e a viabilidade das células. Preparar a suspensão celular ajustando o número de células para 160 000 células por mililitro de meio completo.
Em seguida, limpe os discos de biomaterial por ultrassom em etanol a 70% por cinco minutos, seguido de esterilização em etanol a 70% por 30 minutos. Depois de secar os discos de titânio, coloque-os em uma placa de 24 poços não tratada e adicione um mililitro de suspensão celular preparada a cada poço. Incubar as células por 48 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para obter macrófagos M0.
Para obter macrófagos polarizados M1, adicione interferon gama e lipopolissacarídeo nos poços de uma placa de 24 poços. Para polarização M2, adicione interleucina-4 e interleucina-13. Incube as células por 48 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para induzir a polarização.
Depois de obter macrófagos derivados de monócitos polarizados de células mononucleares do sangue periférico humano, colete o sobrenadante celular em um tubo de 1,5 mililitro. Transfira o disco de titânio para uma nova placa de 24 poços. Centrifugar o sobrenadante celular a 300 g durante cinco minutos e transferir o sobrenadante para um novo tubo.
Meça as citocinas e quimiocinas a 450 nanômetros de acordo com as instruções específicas fornecidas pelo fabricante. Calcular a concentração de citocinas ou quimiocinas secretadas utilizando a curva padrão. Meça a quantidade total de proteína usando o kit de ensaio de proteína de ácido bicinconínico.
Normalize a concentração de proteínas secretadas em miligramas de proteína total. Lave os macrófagos polarizados duas vezes em 800 microlitros de PBS. Incubar os discos em 400 microlitros de tampão de fixação por 20 minutos em temperatura ambiente.
Após remover o tampão de fixação, lave os discos três vezes em 400 microlitros de PBS. Agora, incube os discos com 400 microlitros de tampão de bloqueio por 30 minutos para bloquear os locais de ligação inespecíficos. Descarte o tampão de bloqueio e incube os discos por uma hora com anticorpos primários diluídos em 400 microlitros de tampão de coloração.
Após uma hora, remova os anticorpos primários e lave os discos três vezes com 400 microlitros de tampão de lavagem. Adicione flúor para anticorpos secundários marcados diluídos em tampão de coloração e incube por uma hora em temperatura ambiente no escuro. Após a incubação, lave as amostras três vezes no tampão de lavagem por três minutos cada.
Adicione 10 milimolares de DRAQ5 em PBS e incube por 15 minutos no escuro. Em seguida, remova o sobrenadante e lave os discos uma vez com PBS. Adicione uma gota de meio de montagem e, após cinco minutos, aplique as lamínulas e deixe as amostras secarem por uma hora.
Após a secagem, sele as bordas com esmalte transparente. Para obter uma visão geral das células, obtenha imagens das amostras em um microscópio confocal de varredura a laser com ampliação de 25X. Altere a ampliação para 63X para determinar a estrutura e a localização dos marcadores de superfície.
Macrófagos primários derivados de monócitos foram polarizados com sucesso em macrófagos M1 e M2 em superfícies de titânio, com CCR7 mais fortemente expresso em macrófagos M1 e CD209 em macrófagos M2. A análise de qRT-PCR mostrou polarização bem-sucedida de macrófagos derivados de monócitos primários em superfícies de titânio e lamínula com alta expressão de CCR7 e TNF-alfa para M1 e CD209 e CCL13 para M2. Altos níveis de citocina inflamatória TNF-alfa e quimiocina CCL13 confirmaram a polarização de M1 e M2 no nível da proteína.
