אופטימיזציה של הפרדות כרומטוגרפיות היא קריטית להשגת הפרדות נקיות בזמן מינימלי. יש לבצע אופטימיזציה עבור מספר גורמים, כולל אפקטים קינטיים הקשורים להתרחבות פסגות, גובה לוחית, גורם קיבולת וגורם הפרדה.

התרחבות פסגות מתייחסת להתפשטות פסי המומסים בזמן נסיעתם בעמודה. התרחבות זו יכולה להשפיע על הרזולוציה. גובה לוחית (H) מייצג את האורך הנדרש עבור לוחית תיאורטית אחת. גובה לוחית נמוך יותר מתואם ליעילות גבוהה יותר ולרזולוציה טובה יותר. גורם הקיבולת (k) מודד את עוצמת השמירה של מומס על ידי הפאזה הנייחת. אופטימיזציה של ערכי k (בדרך כלל בין 1 ל-10) יכולה לשפר את הרזולוציה מבלי להגדיל משמעותית את זמן היציאה. גורם ההפרדה (α), הידוע גם כבררנות, תלוי בתכונות המומסים ובפאזות הניידת והנייחת.

הגישה הפשוטה ביותר לשיפור ההפרדה כוללת הארכת מספר הלוחות התיאורטיים (N) בעמודה. עם זאת, בעוד הגדלת מספר הלוחות בעמודה יכולה לשפר את הרזולוציה, היא בדרך כלל דורשת יותר זמן. לעומת זאת, הקטנת גובה הלוחית יכולה לשפר משמעותית את הרזולוציה מבלי להגדיל את הזמן. שיטה נוספת לאופטימיזציה של ההפרדה כוללת העלאת גורם הקיבולת עבור שני המומסים האיטיים ביותר על ידי התאמת הטמפרטורה של הפאזות הניידות בגז או הרכב הממס של הפאזות הניידות בנוזל. שיטה זו שימושית במיוחד כאשר ערך ה-k ההתחלתי נמוך, מכיוון שקיים גבול שמעבר לו עלייה ב-k משפרת את הרזולוציה רק במעט.

אופטימיזציה של N או של ערך ה-k של המומס האיטי יותר משפיעה מעט כאשר α מתקרב לערך המינימלי שלו, אחדות. כאשר α מתקרב לאחדות, ניתן ליישם שיטות שונות לאופטימיזציה, כולל שינוי טמפרטורת העמודה, שינוי ההרכב הכימי של הפאזות הנייחת והניידת, או שימוש באפקטים כימיים מיוחדים.