בידוד בעלי חיים הרחבת חינם סרום של טבורי האדם נגזר תאים סטרומה mesenchymal (MSCs) ו האנדותל יצירת המושבה ובתאים (ECFCs)

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והרחבת הבאות של תאים סטרומה mesenchymal ותאי האנדותל המושבה להרכיב ללא שימוש בבעלי חיים בסרום ליצור זוגות עצמיים למטרות השתלה ניסיונית.

Abstract

חבל הטבור הוא מקור עשיר עבור ובתאים עם פוטנציאל שגשוג גבוהה כולל תאים סטרומה mesenchymal (שמכונה גם בתאי גזע mesenchymal, MSCs) ו אנדותל להרכיב המושבה ובתאים (ECFCs). שני סוגי תאים הם שחקני מפתח בשמירה על שלמות רקמות הם כנראה מעורבים גם בתהליכי ההתחדשות היווצרות הגידול.

כדי ללמוד ביולוגיה שלהם לתפקד באופן השוואתי חשוב יש גם סוגי תאים זמין מתורם זהה. זה יכול להיות גם מועיל למטרות משובי להפיק MSCs ו ECFCs מרקמות זהה.

מאחר ותרופות הסלולר צריך בסופו של דבר מוצאים את דרכם מהספסל אל המיטה הקמנו שיטה חדשה לבודד להרחיב עוד יותר ובתאים ללא שימוש של חלבון מן החי. משולב lysate טסיות האנושי (pHPL) החליף בסרום שור העובר בכל השלבים של פרוטוקול שלנו לחלוטין להימנע ממגע של תאים וחלבונים xenogeneic.

וידאו זה מדגים מתודולוגיה בידוד והרחבת ובתאים מחוט one הטבור.

כל החומרים והנהלים יתוארו.

Protocol

חלק 1: הגדרת

1. הכנת תרבית תאים בינוני

לפני תחילת הכנת בינוני לאסוף את כל החומרים והכלים תצטרך.
הפשירי 2 x 56 aliquots מ"ל של lysate ונקווה טסיות האנושי (pHPL, מתוצרת עצמית: התייחסות 1 & יופיטר # 1523), 10 מ"ל של פניצילין 100x / פתרון סטרפטומיצין, 2 x 5 מ"ל של L-גלוטמין (הן סיגמא).

ההפשרה ציטוקינים ו - גורם גדילה aliquots (VEGF, bFGF, EGF, IGF, הידרוקורטיזון, חומצה אסקורבית, הפרין, amphotericin כאמור "quots יחיד ') מותאם משלים 1 בקבוק (500 מ"ל) של המדיום EGM-2 (Lonza).

מהמקרר לקחת אחד בקבוק 500 מ"ל כל אחד (i) אלפא שונה מדיום חיוני מינימלי (A-ממ) ו (ב) בינוני הבסיס האנדותל (EBM).

כל השלבים הבאים מתבצעים ברדס זרימה למינרית רקמה תרבות בתנאים סטריליים.

הכן הפרין ללא חומר משמר (למשל, Biochrom) על ידי המסת אבקת לריכוז סופי של 1000 IU / mL עם מים סטריליים.

MSC-בינונית:

השתמש ב 500 מ"ל של-ממ, להוסיף 56 מ"ל של pHPL מופשר (ראה גם התייחסות 1 לפרטים נוספים) ו 2 IU / mL (= 224 μl של פתרון המניות) של הפארין, חומר משמר בחינם (מונע קרישה של המדיום דרך ובהצטברויות פיברינוגן של פלזמה) להגיע הריכוז הסופי של pHPL 10%. בנוסף להוסיף פניצילין (100U/mL) / סטרפטומיצין (100μg/mL) פתרון של 2 מ"מ L-Glutamin (הן סיגמא).

סינון בינוני באמצעות מסנן 20 מיקרומטר, גודל הנקבוביות ואקום (Millipore). תווית הבקבוק כיאות (תאריך, תוכן).

ECFC-בינונית:

השתמש בקבוק אחד (500 מ"ל) של EBM, מוסיפים את ציטוקינים-aliquots, 56 מ"ל של pHPL, 10 IU / מ"ל ​​(= 1120μl של פתרון המניות) של הפארין, חומר משמר בחינם, פניצילין (100U/mL) / סטרפטומיצין (100 גר '/ מ"ל) פתרון של 2 מ"מ L-Glutamin עד בינוני המסנן הבסיס, עם 20 μl-נקבוביות ואקום גודל המסנן (Millipore). תווית הבקבוק כיאות (תאריך, תוכן).

2. עיקור של מכשירי ניתוח

מלקחיים, זוג מספריים חדות כירורגית מחזיק אזמל חייב להיות חום disposables עפרות מעוקר סטרילי.

3. הכנת צינורות לאיסוף חוט

הוספת 500 IU של משמר - הפרין חופשי 50 מ"ל צינורות פוליפרופילן (Falcon) ולהתאים את נפח סופי של 20 מ"ל עם PBS. העברת צינורות לחדר הלידה.

4. הסכמה מדעת (אושר על ידי הוועדה המקומית שלך IRB אתית או).

שאל את ההורים לפני הלידה אם הם רוצים לתרום חתיכת חוט והולם ליידע אותם על מטרות זה ישמש.

5. כבל תרומה

לאחר הלידה ובדיקה של השליה חוט לחתוך חתיכה 10 ס"מ ומיד להעביר אותו צינור שלך prefilled עם הפרין כדי למנוע קרישת הדם הנותר בתוך כלי חוט. ממשיכים עם בידוד תא בהקדם האפשרי.

חלק 2: בידוד נייד

1. הכן תזרים למינרית רקמות ברדס התרבות על ידי ניקוי משטחים עם Incidin EtOH או 70%. מקום סטרילי 150 ס"מ ² תאים תרבות צלחות, 75 צלוחיות תא ס"מ התרבות (הן קורנינג), PBS, מכשירי ניתוח עיקור, מגרדים תאים, בעל צינור, stripettes 25 מ"ל ו 5 מ"ל מצויד מזרקים ומחטים סוף בוטה כראוי ברדס ניקה שלך.
2. טרום חם שהוכן שלך α-EGM ממ ו-2 תרבית תאים בינוניים עד 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
3. תביאו את כבל מחדר הלידה למעבדה שלך מצויד למכסה המנוע תרבית תאים. לאחר העברת כבל לתוך הזרימה למינרית לשטוף אותו פעמיים PBS (על ידי העברת לצלחת חדש) להיפטר לזהם כדוריות הדם. שוטפים את וריד הטבור לאחר canulating אותו בצד אחד עם מזרק 5 מ"ל סטרילי מצויד במחט עם קצה קהה PBS עד הנוזל שיוצא את הקצה השני של החבל הופך שקוף לחלוטין (אדמדם מציין זיהום בדם).

ECFCs:

4. הכן 75 ² ס"מ צפחת (קורנינג), תווית ומלא 15-20 מ"ל של מדיום EGM-2 מראש התחמם.
5. הנח את הכבל לתוך צלחת חדש מלא PBS סטרילית.
   
   קחו את המספריים כירורגית לחתוך את חבל הטבור לשתי חתיכות של כ -5 ס"מ אורך (קטעים קצרים קל יותר בתהליך, כי כלי הטבור שזורות לאורך ציר שלהם).
6. נסו למצוא את הווריד הטבורי (כלי גדול), להוסיף אחת להב מספריים כירורגיות שלך לחתוך את הווריד longitudinally. בשלב זה יכול להיות מועיל אם כעוזר יכול להחזיק את הווריד לחתוך כבר עם שני מלקחיים בזמן שאתה לחתוך עוד.
7. מניחים את העוגה בחוטce עם הווריד לחתוך בצלחת חדשה ללא PBS, לקחת את מגרד לגרד תאים של פני השטח (אנדותל) הפנימי של וריד הטבור על ידי שפשוף מקצה אחד לקצה השני. העברת התאים בקבוק שהוכן על ידי ניקוי מגרד את קצה של המדיום. חזור על הליך זה לפחות 10 פעמים.
8. סגור את הבקבוק שלך ולשים אותו לתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2, 95% לחות).

MSCs:

4. הכן 150 ² ס"מ תרבות צלחת (קורנינג) ואת התווית אותה.
5. קחו את חתיכת חוט (לאחר מקרצפים את שכבת האנדותל) ו לחתוך את חבל הטבור כולו לחתיכות קטנות מאוד באמצעות מספריים סטרילית אזמל סטרילי. גודל מקסימלי של חתיכות חוט צריך להיות 1-2 מ"מ.
6. העברת חלקים כבל שלך עם מלקחיים סטרילי לתוך הצלחת שלך מראש שכותרתו תרבות. מאת עוזב צלחת הפתוח במשך 5 דקות לפני מתמלא בינוני, החיבור של החלקים למשטח פלסטיק מחוזק.
7. לאחר חתיכות חוט מחוברים כראוי הפלסטיק, בעדינות מוסיפים 30-35 מ"ל של אלפא טרום חימם שונה ממ. נסה להשתמש המהירות הנמוכה ביותר כדי לוודא כי כל החלקים נשארים מחוברים.
8. סגור את הצלחת להכניס אותו לתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2, 95% לחות).

חלק 3: הרחבת התא ואישור פנוטיפ-החיסונית על ידי זרימת cytometry

Cell Expansion

EFCFs:

1. בדוק את הקובץ המצורף של בתאי האנדותל למחרת על מיקרוסקופ חילופי הפוכה כל EGM-2 בינוני להיפטר כל הלא צמוד תאים וחלקיקים.
2. הרחב את התאים עד שליש מפגש וחילופי המדיום פעמיים בשבוע. כאשר המפגש הוא הגיע, לנתק את התאים עם 0.05% Trypsin/0.7 mM EDTA ולהעבירם כלי תרבות חדשה. בהתאם למספר התאים בתוך בקבוק שלך T75, אתה צריך לבחור את גודל ומספר צלוחיות החדש שלך כדי להבטיח את צפיפות זריעה נמוכה להתרחבות נוספת.
3. שערי שליש המדיום פעמיים בשבוע במהלך התרחבות של התאים.

MSCs:

1. תולדה של MSCs מחוט ייקח יותר זמן, כך שאתה יכול לחכות לפחות 3-4 ימים עד שאתה לבדוק מיקרוסקופ הפוכה להופעת תאים דמויי כישור בסביבה של חתיכות רקמה המצורפת. כאשר יש תא מספיק מחוץ צמיחה, חתיכות נוטים לנתק כי הם מאבדים את הקשר עם הפלסטיק.
2. לאחר 10-12 ימים להסיר את פיסות רקמה, לנתק את MSCs מפלסטיק עם 0.05% Trypsin/0.7 mM EDTA ולהעבירם כלי תרבות חדשה. בהתאם לכמות של תאים בתוך הצלחת שלך אתה צריך להחליט על גודל ומספר צלוחיות החדש שלך כדי להבטיח את צפיפות זריעה נמוכה להתרחבות נוספת.
3. שערי שליש המדיום פעמיים בשבוע במהלך התרחבות של התאים.

תזרים cytometry

ציוד נחוץ:

תזרים cytometer (BD FACSCalibur), micronic צינורות (קורנינג), בעל צינור, כבשים סרום (חסימת מגיב), Eppifuge (Eppendorf), נוגדנים חד שבטיים
MSCs: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD73, CD90, CD105, שולטת אלוטיפ
ECFCs: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD34, CD90, CD105, CD144, CD146, שולטת אלוטיפ

1. לאחר שהגיע למפגש, לנתק את התא עם 0.05% Trypsin/0.7 mM EDTA ו צנטריפוגות ב 300 גרם ב 7 דקות 4 ° C.
2. Resuspend את התאים בריכוז של 1x10 ⁶ תאים / מ"ל PBS שונה ומחייבת לחסום נוגדן נוקבים עם 10% v / v כבשים בסרום במשך 20 דקות ב 4 ° C.
3. לייבל צינורות micronic ולהוסיף את הריכוז המתאים של נוגדנים שכותרתו ניאון.
4. הוסף 50 μl של השעיה תא (חסום) כדי צינור כל דגירה למשך 30 דקות ב 4 ° C.
5. לשטוף את התאים על ידי הוספת שונה PBS להסיר בלתי מחייב נוגדנים.
6. לכי עם תא שכותרתו שלך cytometer את זרימת ולבצע את הניתוח.

חלק 4: המושבה ECFC צמיחה, קיבעון, מכתים וניתוח היררכיה

1. הזרע ECFCs שנקטפו טהור כמעט בצפיפות נמוכה מאוד של ציפוי 3 או 10 תאים לסנטימטר מרובע צלחות תרבית תאים, כדי לאפשר צמיחה מושבה אחת.
2. שערי שליש המדיום פעמיים בשבוע.
3. לאחר 14 ימים (סוף תרבות) להסיר בינוני, לשטוף פעמיים עם PBS ולתקן את מושבות עם פתרון קרים קיבעון (אצטון: מתנול = 3: 2) במשך 15 דקות במקרר.
4. מחק את הפתרון קיבעון ולהשאיר הצלחות לפתוח להתייבש במשך 10 דקות.
5. רעננותם התאים עם מים מזוקקים במשך 10 דקות.
6. הוסף פתרון האריס Hematoxylin ואת כתם המושבות קבוע במשך 12 דקות.
7. הסר פתרון H matoxylin ולשטוף את הצלחות עם מי ברז להיפטר הפתרון מכתים הנותרים.
8. צלמו תמונות של המושבה על ידי כלבאמצעות stereomicroscope ולייבא *. jpg או tif *. קבצים בפורמט למחשב.
9. פתח את התמונות באמצעות תוכנת ImageJ ולנתח את מספר הסלולרי מדויק של המושבה כל כמתואר האנימציה.
10. פתח את תוכנת ImageJ ולייבא תמונת המושבה באמצעות "קובץ \ פתיחה" לתפקד למשוך למטה בתפריט.
11. המשך באמצעות "תהליך \ רקע הפחת" פונקציה
12. השתמש בפונקציה "בחירה * * אליפטית או מברשת" בתפריט ImageJ לסמן את השוליים המושבה.
13. נקה את התמונה המקיפה באמצעות 'ערוך \ מחוץ נקה "פונקציה לחתוך את התמונה על ידי בחירת' Image יבול \ '.
14. התאם את הסף באופן ידני באמצעות "תמונה \ כוונון \ סף" לתפקד, כך שכל התאים נצבעים באדום לחלוטין.
15. ספירת תאים של המושבה על ידי בחירת "נתח \ נתח חלקיקים". בחר את ההגדרות המתאימות (אופטימיזציה עבור כל סוג התא) ובחר 'אישור'. תיבת התוצאות, כולל ספירת התאים תמונה חדשה המכילה את קווי המתאר המקביל התאים נספר יופיע.
    

Discussion

יש מגוון של מקורות שמהם לקבל MSCs או ECFCs כולל מח העצם, רקמת שומן, דם טבורי, וכו '

זה הכרחי כדי לקבל את שני הסוגים של אבות מאותו מקור כדי להשוות ישירות את מעורבותם של תאים מסוגים שונים בתהליכי התחדשות רקמות כמו כלי או תרומה התקדמות הג?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
alpha modified MEM	Sigma-Aldrich
L-GLutamin	Sigma-Aldrich
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich
EBM	Lonza Inc.
Single cytokine quots	Lonza Inc.
75 cm2 flasks	Corning
150 cm2 plates	Corning
Cell scraper	Corning
Trypsin/EDTA	Sigma-Aldrich
Monoclonal antibodies	BD Biosciences
PBS
50 ml tubes	Falcon BD
500 mL filter 20 μm pore size	EMD Millipore
Preservative free heparin	Biochrom AG