Isolamento e di espansione degli animali siero gratuito di cordone ombelicale umano derivato cellule stromali mesenchimali (MSC) e cellule endoteliali progenitrici formanti colonia (ECFCs)

Riepilogo

Questo protocollo descrive l'isolamento e la successiva espansione delle cellule stromali mesenchimali e le cellule endoteliali che formano colonie senza l'uso di siero animale per generare le coppie a fini di trapianto autologo sperimentali.

Abstract

Il cordone ombelicale è una ricca fonte di cellule progenitrici con alto potenziale proliferativo delle cellule stromali mesenchimali compreso (designato anche le cellule staminali mesenchimali, MSC) e cellule progenitrici endoteliali formanti colonia (ECFCs). Entrambi i tipi di cellule hanno un ruolo chiave nel mantenere l'integrità dei tessuti e sono probabilmente coinvolti nei processi di rigenerazione e formazione di tumori.

Per studiare la loro biologia e la funzione in termini comparativi, è importante avere entrambi i tipi di cellule a disposizione dallo stesso donatore. Può anche essere utile per scopi rigenerativi per derivare cellule staminali mesenchimali e ECFCs dal tessuto stesso.

Poiché la terapia cellulare dovrebbe finalmente trovare la loro strada dal laboratorio al letto abbiamo stabilito un nuovo metodo per isolare ed espandere ulteriormente le cellule progenitrici senza l'uso di proteine ​​animali. Pool di lisato piastrinico umano (pHPL) sostituito siero fetale bovino in tutte le fasi del nostro protocollo al fine di evitare completamente il contatto delle cellule alle proteine ​​xenogene.

Questo video dimostra una metodologia per l'isolamento e l'espansione delle cellule progenitrici da un cordone ombelicale.

Tutti i materiali e le procedure saranno descritte.

Protocollo

Parte 1: Installazione

1. Preparazione del terreno di coltura

Prima di iniziare la preparazione media di raccogliere tutti i materiali e gli strumenti di cui avrete bisogno.
Scongelare 2 x 56 ml di lisato pool delle piastrine umane (pHPL, self-made: riferimento 1 & JOVE # 1523), 10 ml di una penicillina 100x / soluzione di streptomicina, 2 x 5 mL di L-Glutammina (entrambi Sigma).

Scongelare la citochina e aliquote fattore di crescita (VEGF, bFGF, EGF, IGF, idrocortisone, acido ascorbico, eparina, Amfotericina forniti come 'quots singolo'), rettificato per integrare 1 bottiglia (500 ml) di EGM-2 medio (Lonza).

Dal frigo fare un flacone da 500 ml ciascuna (i) alfa-modificato minima quantità di terreno essenziale (a-MEM) e (ii) media endoteliale basale (EBM).

Tutte le seguenti operazioni vengono eseguite in una cappa flusso laminare cultura dei tessuti in condizioni sterili.

Preparare eparina senza conservanti (ad esempio, Biochrom), sciogliendo la polvere ad una concentrazione finale di 1000 UI / mL con acqua sterile.

MSC-media:

Utilizzare 500 ml di a-MEM, aggiungere 56 ml di scongelato pHPL (vedi anche riferimento 1 per ulteriori dettagli) e 2 IU / mL (= ml di soluzione madre 224) senza conservanti di eparina (evita la coagulazione del mezzo attraverso aggregazione di il fibrinogeno nel plasma) per raggiungere una concentrazione finale del 10% pHPL. Inoltre aggiungere penicillina (100U/mL) / streptomicina (100μg/mL) soluzione e 2mM di L-Glutamin (entrambi Sigma).

Filtrare il medium attraverso un poro 20 micron filtro dimensioni del vuoto (Millipore). Etichetta della bottiglia appropriato (contenuto, data).

ECFC-media:

Utilizzare una bottiglia (500 ml) di EBM, aggiungere il citochine aliquote, 56 ml di pHPL, 10 UI / ml (= 1120μl di soluzione madre) di conservanti eparina, penicillina (100U/mL) / Streptomicina (100 g / mL) e 2mM soluzione di L-Glutamin al mezzo basale e il filtro con 20 l poro vuoto dimensione del filtro (Millipore). Etichetta della bottiglia appropriato (contenuto, data).

2. Sterilizzazione degli strumenti chirurgici

Pinze, paio di forbici affilate e titolare bisturi chirurgico deve essere caldo e getta minerale sterilizzati sterile.

3. Preparazione di tubi per la raccolta del midollo

Aggiungere 500 UI di conservante - eparina libera a 50 tubi in polipropilene ml (Falcon) e regolare di un volume finale di 20 ml con PBS. Trasferire i tubi in sala parto.

4. Il consenso informato (confermate dal comitato etico locale o IRB).

Chiedere ai genitori prima della consegna se volesse donare un pezzo di corda e adeguatamente li informa delle finalità servirà.

5. Donazione del midollo

Dopo la consegna e l'ispezione di placenta e cordone tagliare un pezzo di 10 cm e immediatamente trasferire al tubo preriempita con eparina per evitare la coagulazione del sangue all'interno dei vasi rimanenti cavo. Continuare con isolamento delle cellule il più presto possibile.

Parte 2: isolamento delle cellule

1. Preparare cappa a flusso laminare tessuti cultura pulizia delle superfici con Incidin o 70% EtOH. Luogo sterile 150 centimetri ² piastre di coltura cellulare, 75 cm fiasche di coltura cellulare (entrambi Corning), PBS, strumenti chirurgici sterilizzati, raschietti cellulare, titolare del tubo, 25 stripettes ml e 5 ml siringhe dotate di aghi senza punta giustamente in vostro cappuccio pulito.
2. Preriscaldare il vostro preparato α-MEM e EGM-2 terreno di coltura cellulare a 37 ° C in un bagno d'acqua.
3. Portare il cavo dalla sala parto al laboratorio dotato di cappuccio colture cellulari. Dopo aver trasferito il cavo nel flusso laminare lavarlo due volte in PBS (attraverso il trasferimento di una nuova piastra) per sbarazzarsi di contaminazione cellule del sangue. Sciacquare la vena ombelicale dopo canulating su un lato con una siringa da 5 ml sterili con ago senza punta con PBS fino a quando il liquido che esce l'altra estremità del cavo diventa completamente trasparente (rossastro indica la contaminazione del sangue).

ECFCs:

4. Preparare un centimetro 75 ² pallone (Corning), si etichetta e compilare 15-20 ml di pre-riscaldato EGM-2 di media.
5. Posizionare il cavo in una nuova piastra piena di PBS sterile.
   
   Prendete le forbici chirurgiche e tagliare il cordone ombelicale in due pezzi di circa 5 cm di lunghezza (brevi pezzi sono più facili da lavorare, perché i vasi ombelicali sono intrecciati lungo il loro asse).
6. Prova a trovare la vena ombelicale (recipiente di grandi dimensioni), inserire un filo d'tuo forbici chirurgiche e tagliare la vena longitudinalmente. A questo punto potrebbe essere utile se un assistente può contenere la vena già tagliato con due pinze, mentre si taglia ulteriormente.
7. Posizionare il cavo di tortace con la vena tagliata in un piatto nuovo senza PBS, prendere il raschietto cellulare e di raschiare l'interno (endotelio) della superficie della vena ombelicale da sfregamenti da un capo all'altro. Trasferire le cellule al fiasco preparato da pulire la punta del raschietto nel mezzo. Ripetere questa procedura almeno 10 volte.
8. Chiudere il pallone e metterlo in un incubatore (37 ° C, 5% CO _2, 95% di umidità).

MSC:

4. Preparare un centimetro 150 ² piastra di coltura (Corning) ed etichettarlo.
5. Prendete il pezzo di corda (dopo raschiando via lo strato endoteliale) e tagliare il cordone tutto in pezzi molto piccoli, utilizzando forbici sterili e bisturi sterile. Dimensione massima dei pezzi cavo devono essere 1-2 mm.
6. Trasferite i vostri pezzi di cavo con la pinza sterile nel pre-etichettati piastra di coltura. Lasciando aperta la piastra per 5 minuti prima riempiendo di media, l'attaccamento dei pezzi per la superficie in plastica si rafforza.
7. Una volta che i pezzi di cavo sono collegati opportunamente alla plastica, aggiungere delicatamente in 30-35 ml di pre-riscaldato alfa modificato MEM. Cercate di usare la velocità minima per essere sicuri che tutti i pezzi rimangono attaccati.
8. Chiudere la piastra e metterla in un incubatore (37 ° C, 5% CO _2, 95% di umidità).

Parte 3: l'espansione cellulare e la conferma di immuno-fenotipo mediante citometria di flusso

Cellula di espansione

EFCF:

1. Controllare il fissaggio delle cellule endoteliali del giorno successivo su un microscopio invertito e lo scambio di tutto EGM-2 di media per sbarazzarsi di tutti i non iscritti cellule e particelle.
2. Espandere le cellule fino a confluenza e di scambio un terzo della media due volte alla settimana. Quando confluenza viene raggiunto, staccare le cellule con 0,05% Trypsin/0.7 mM EDTA e trasferirli alle navi nuova cultura. A seconda del numero di cellule all'interno del vostro T75 fiasco, si consiglia di scegliere le dimensioni e il numero dei tuoi fiaschi nuovo per garantire bassa densità di semina per un'ulteriore espansione.
3. Scambio un terzo della media due volte alla settimana durante l'espansione delle cellule.

MSC:

1. La conseguenza di cellule staminali mesenchimali dal midollo ci vorrà più tempo, in modo da poter attendere almeno 3-4 giorni fino a che controllare su un microscopio invertito per la comparsa di cellule fusiformi nei dintorni dei pezzi di tessuto attaccato. Quando c'è di cellule sufficiente out-crescita, i pezzi tendono a staccarsi, perché perdere il contatto con la plastica.
2. Dopo 10-12 giorni rimuovere i pezzi di tessuto, staccare le cellule staminali mesenchimali dalla plastica con 0,05% Trypsin/0.7 mM EDTA e trasferirli alle navi nuova cultura. A seconda della quantità di cellule all'interno del vostro piatto si dovrebbe decidere le dimensioni e il numero dei tuoi fiaschi nuovo per garantire bassa densità di semina per un'ulteriore espansione.
3. Scambio un terzo della media due volte alla settimana durante l'espansione delle cellule.

Citometria a flusso

Attrezzatura necessaria:

Citometro a flusso (BD FACSCalibur), micronici tubi (Corning), titolare del tubo, pecore siero (il blocco dei reagenti), Eppifuge (Eppendorf), gli anticorpi monoclonali
MSC: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD73, CD90, CD105, controlli isotipo
ECFCs: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD34, CD90, CD105, CD144, CD146, controlli isotipo

1. Dopo aver raggiunto confluenza, staccare il cellulare con il 0,05% Trypsin/0.7 mM EDTA e centrifugare a 300g per 7 minuti a 4 ° C.
2. Risospendere le cellule ad una concentrazione di 1x10 ⁶ cellule / ml in PBS e modificato legame degli anticorpi aspecifici blocco con il 10% v / v pecore siero per 20 minuti a 4 ° C.
3. Etichettare le provette micronici e aggiungere la giusta concentrazione di anticorpi marcati fluorescenti.
4. Aggiungere 50 ml di sospensione cellulare (bloccato) a ciascuna provetta ed incubare per 30 minuti a 4 ° C.
5. Lavare le cellule modificate con l'aggiunta di PBS per rimuovere gli anticorpi non vincolante.
6. Vai con il tuo cellulare etichettati al citofluorimetro ed eseguire l'analisi.

Parte 4: ECFC crescita colonia, fissazione, colorazione e analisi gerarchia

1. Il seme ECFCs praticamente puro raccolte a densità molto bassa placcatura di 3 o 10 cellule per centimetro quadrato in piastre di coltura cellulare per consentire la crescita singola colonia.
2. Scambio un terzo della media due volte alla settimana.
3. Dopo 14 giorni (fine della cultura) rimuovere media, lavare due volte con PBS e fissare le colonie con una soluzione di fissaggio ghiacciata (Acetone: Metanolo = 3: 2) per 15 minuti in frigorifero.
4. Scartare la soluzione di fissaggio e lasciare le piastre aperto ad asciugare per 10 minuti.
5. Reidratare le cellule con acqua distillata per 10 minuti.
6. Aggiungi Harris soluzione ematossilina e macchia le colonie fisso per 12 minuti.
7. Rimuovere H matoxylin soluzione e sciacquare i piatti con acqua di rubinetto per eliminare la soluzione colorante rimanente.
8. Scatta foto di ogni colonia diutilizzando uno stereomicroscopio e importare *. jpg o *. tif file in formato sul computer.
9. Aprire la foto con il software ImageJ ed analizzare il numero preciso delle cellule di ogni colonia, come descritto nella animazione.
10. Aprire il software ImageJ e importare un'immagine colonia utilizzando il 'File \ Apri' la funzione nel menu a discesa.
11. Procedere utilizzando il 'Processo \ Background Sottrarre' funzione
12. Utilizzare la funzione 'selezione ellittica * * o pennello' nel menu ImageJ per segnare il margine di colonia.
13. Chiaro che circonda l'immagine utilizzando il 'Modifica \ Fuori Clear' funzione e ritagliare l'immagine, selezionando 'Immagine Crop \'.
14. Regolare la soglia manualmente con 'Image \ Regolare la soglia \' funzione, in modo che tutte le cellule sono completamente colorati in rosso.
15. Contare il numero di cellule della colonia, selezionando 'Analizza \ analizzare particelle'. Scegliere le impostazioni appropriate (ottimizzate per ogni tipo di cellula) e selezionare 'OK'. La casella di risultati, tra cui numero di celle e una nuova immagine contenente i contorni corrispondente delle cellule contate apparirà.
    

Discussione

C'è una varietà di fonti da cui ottenere cellule staminali mesenchimali o ECFCs compreso il midollo osseo, tessuto adiposo, sangue del cordone ombelicale, ecc

E 'necessario per ottenere entrambi i tipi di progenitori dalla stessa fonte di confrontare direttamente il coinvolgimento dei diversi tipi di cellule in processi come tessuti e la rigenerazione nave o contributo alla progressione del tumore.

La facilità con cui isolare e successivamente studiare...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
alpha modified MEM	Sigma-Aldrich
L-GLutamin	Sigma-Aldrich
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich
EBM	Lonza Inc.
Single cytokine quots	Lonza Inc.
75 cm2 flasks	Corning
150 cm2 plates	Corning
Cell scraper	Corning
Trypsin/EDTA	Sigma-Aldrich
Monoclonal antibodies	BD Biosciences
PBS
50 ml tubes	Falcon BD
500 mL filter 20 μm pore size	EMD Millipore
Preservative free heparin	Biochrom AG