אינדוקציה של Hypophysitis אוטואימוניות הניסויי עכברים SJL

Summary

וידאו זה מראה כיצד לגרום hypophysitis אוטואימוניות בעכברים SJL וכיצד להעריך חומרתה ידי histopathology.

Abstract

Hypophysitis אוטואימוניות ניתן לשחזר בניסוי ידי הזרקה של חלבונים יותרת המוח מעורב עם adjuvant לעכברים רגישים ^1. מודלים עכבר מאפשרים לנו ללמוד כיצד להתפתח מחלות, לעתים קרובות מתן העתק טוב של אותם תהליכים המתרחשים בבני אדם. עבור כמה מחלות אוטואימוניות, כמו סוכרת מסוג 1A, יש מודלים (העכבר NOD) כי באופן ספונטני לפתח מחלה דומה מקבילו האנושי. עבור רבים מחלות אוטואימוניות אחרות, לעומת זאת, המודל צריך להיות המושרה בניסוי. הגישה הנפוצה בהקשר זה היא להזריק את העכבר עם אנטיגן דומיננטי נגזר איבר הנלמד. לדוגמה, החוקרים מעוניינים השימוטו אוטואימוניות להזריק עכברים עם thyroglobulin ^2, למעוניינים מיאסטניה גרביס להזריק אותם עם קולטן האצטילכולין ^3. אם autoantigen למחלה אוטואימונית מסוימת אינה ידועה, החוקרים להזריק תמצית חלבון גולמי של איבר המטרה מהתגובה אוטואימוניות. עבור hypophysitis אוטואימוניות, autoantigen פתוגניים (ים) להישאר להיות מזוהה ^4, ובכך הכנה גולמי חלבון יותרת המוח משמש. במאמר זה אנו וידאו להדגים כיצד לגרום hypophysitis אוטואימוניות הניסוי בעכברים SJL.

Protocol

ניסיוני פרוטוקול

לאחר immunogen יותרת המוח מוכן (ראה מאמר נלווה), הוא מוזרק תת עורי לעכברים SJL (מעבדות ג'קסון, 000,686 מניות). הזרקת זהה השני הוא חזר 7 ימים לאחר מכן. עכברים משמשים כדי לאסוף in vivo ו שלאחר המוות התוצאות.

שלב 1. תת עורי הזרקת immunogen יותרת המוח לעכברים SJL

עכברים מורדמים לראשונה על ידי הזרקת 0.5 מ"ל של 20 Tribromoethanol-2,2,2 מ"ג / מ"ל ​​(Avertin, TCI אמריקה, T-1420) intraperitoneally. עכברים מוזרקים תת עורית אז עם 100 μl של אמולסיה יותרת המוח כי, כפי שצוין המלווה יופיטר 2181 מאמר זה, מכיל 1 מ"ג של תמצית בלוטת יותרת המוח ו 0.25 מ"ג של פרוינד משלים של שלמה. התחליב מוזרק באזור הגב רגל שמאל האחורית ((50 μL) ובאזור המפשעה ימין (50 μL). אמולסיה יותרת המוח מוזרק שוב אל מול אתרי (50 μl באזור הגב רגל ימין האחוריות וביום 7 50 μl באזור מפשעתי משמאל). עכברים מנוטרים יומי במשך 3 הימים הראשונים בשבוע אז עד יום של הקרבה, שהוא בדרך כלל 28 ימים לאחר החיסון הראשון.

שלב 2. איסוף בתוצאות vivo: מבחני דם

הרקמה הנפוצה ביותר להעריך את תוצאות הניסוי תוך העכברים עדיין בחיים הוא דם. הדם הוא נמשך באופן שגרתי 14 ימים לאחר החיסון הראשון כדי למדוד את רמות נוגדנים יותרת המוח או סמנים אחרים כמו ציטוקינים chemokines.

הדם נאסף עכברים חיים כדלקמן. עכברים מוחזקים היטב בעורפו של הצוואר והחלק האחורי של עצם הלסת ממוקמת. לאחר האחורי של עצם הלסת ממוקמת, 4 אזמלי מ"מ המשמשים לנקב את צרור וסקולרית submandibular. אחרי הדם נאסף, לחץ על מקום באזור באמצעות ספוגית אלכוהול כדי למנוע שטף דם. הדם שנאסף centrifuged ב 2000 גרם במשך 20 דקות, ומאוחסנים ב -80 ° C עד בשימוש.

שלב 3. איסוף שלאחר המוות התוצאות: יותרת המוח histopathology

עכברים הם הקריבו בדרך כלל 28 ימים לאחר החיסון הראשון. התכונה הקרדינל צורך לקבוע את האבחנה של EAH היא חדירה של בלוטת יותרת המוח על ידי תאים mononuclear hematopoietic.

עכברים מומתים על ידי הצבת אותם בתא פלסטיק אטום כי הוא perfused עם CO _2. עכברים מוחזקים בחדר עבור סכום כולל של 8 דקות. לאחר המתת חסד, בלוטת יותרת המוח נאסף כמתואר במאמר נלווה. בלוטת יותרת המוח הפגוע נראה נפוח יותר חסיד היטב מאטר הדורה שמסביב. מלקחיים שארפ משמשים כדי לשחרר את קרומי המוח המקיף את המוח. לאחר מהלכים יותרת המוח בחופשיות על העצם יתדי, קצה אחד של בלוטת יותרת המוח נתפסת עם מלקחיים את בלוטת יותרת המוח הוא הרים בזהירות. הבלוטה ממוקמת אז צינור microcentrifuge המכיל ⁵ מקבע של Beckstead. בלוטת יותרת המוח היא קבועה לילה, עטוף בנייר העדשה, והושמו קלטת. בלוטות מעובדים מכן באמצעות פרוטוקול הבאים:

20

תחנה מספר	מגיב	הזמן בדקות	טמפרטורה (צלזיוס)
1	70% אלכוהול	5	25
2	70% אלכוהול	15	25
3	95% אלכוהול	15	25
4	95% אלכוהול	15	25
5	100% אלכוהול	15	25
6	100% אלכוהול	7.5	25
7	100% אלכוהול	7.5	25
8	קסילן	20	25
9	קסילן	20	25
10	קסילן	25
11	פרפין	30	58
12	פרפין	5	58
13	פרפין	5	58

לאחר עיבוד, בלוטות יותרת המוח המוטבעים פרפין לפחות 5 סעיפים nonconsecutive (5-מיקרומטר עבה) נחתכים מבלוטת כל אחד. לאחר חתך, בלוטות הם מוכתמים hematoxylin ו eosin, וניתח לכמת את חדירת mononuclear. קטע עם חדירה החמור ביותר נבחרה מניה. חומרת הוא הבקיע מבוסס על אומדן סובייקטיבית של מידת החלפת הרס בלוטת יותרת המוח הקדמית או על ידי תאים חיסוניים: ציון 0, לא מחלה, כיתה 1, 2% -20% מעורבות, כיתה 2, 20% -30%; בדרגה 3, 30% -50%; כיתה 4, 50% -90%; ציון 5, יותר מ 90%. סעיפים כל הבקיע על ידי שני אנשים מסונוורים למקור הסעיפים.

Discussion

ארבע טכניקות דווחו לגרום hypophysitis בחיות מעבדה. השיטה המתוארת במאמר זה, כי הוא הזרקה של חלבונים יותרת המוח מעורב עם משלים של פרוינד, הוא אחד העתיקים, שראשיתה 1967 ^6, שופרה לאחרונה ^1. טכניקות אחרות הן הזרקה של גליקופרוטאינים וירוס מסיסים אדמת בשנת 1992 ^7, הזרקת...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SJL mice (The Jackson Laboratories)		stock 000686
2,2,2-Tribrom–thanol (Avertin)	TCI America	T-1420
Beckstead’s fixative