השימוש במערכת משקל תליה על חסימת העורקים הכליליים של עכברים

Summary

מודל Murine עבור איסכמיה בשריר הלב נפשית מראש איסכמי הוא כלי מחקר חשוב מנגנוני הלב In vivo. כאן אנו מדווחים החלים קל באתרו מודל ה-IP לב באמצעות מערכת תלוי במשקל עבור חסימת העורקים הכליליים.

Abstract

מחקרים Murine של פגיעה חריפה על שטח של חקירה אינטנסיבית, כמו עכברים knockout עבור גנים שונים נעשים זמינים יותר ויותר ^1-38. Cardioprotection ידי נפשית מראש איסכמי (IP) נותר שטח של חקירה אינטנסיבית. כדי להמשיך להבהיר הבסיס המולקולרי שלו, השימוש מחקרים עכבר נוקאאוט חשוב במיוחד ^{7, 14, 30, 39.} למרות העובדה כי מחקרים קודמים כבר ביצעה בהצלחה reperfusion איסכמיה לב בעכברים, מודל זה הוא מאוד מאתגר מבחינה טכנית. במיוחד, זיהוי חזותי של העורק הכלילי, המיקום של תפר סביב כלי השיט ואת חסימה כלילית על ידי קשירת את הקשר עם כלי נתמך קשה מבחינה טכנית. בנוסף, פתיחה מחדש את הקשר עבור reperfusion לסירוגין של העורק הכלילי במהלך IP מבלי לגרום טראומה ניתוחית מוסיף אתגר נוסף. יתר על כן, אם הקשר אינו כבול reperfusion חזק, מספיק בשוגג עקב חסימה מושלמת של כלילית עשוי להשפיע על התוצאות. למעשה, זה יכול בקלות להתרחש עקב תנועה של הלב הפועם.

בהתבסס על בעיות פוטנציאליות הקשורות באמצעות מערכת קשרים חסימה כלילית, אימצנו מודל שפורסמו בעבר של קרדיומיופתיה כרונית המבוסס על מערכת משקל תלוי על חסימה לסירוגין לב כלילית במהלך ³⁹ IP. למעשה, חסימת עורקים כליליים יכולה אפוא להיות מושגת מבלי לחסום את העורקים הכליליים על ידי פקעת. יתר על כן, reperfusion של כלי השיט ניתן להשיג בקלות על ידי תמיכה משקולות תלוי אשר נמצאים לוקליזציה מרוחק מן הרקמות לב.

בדקנו את המערכת באופן שיטתי, כולל וריאציה של פעמים איסכמיה ו reperfusion, גדודי נפשית מראש, טמפרטורת הגוף ועל רקע גנטי ^39. בנוסף האוטם מכתים, בדקנו לב טרופונין I (cTnI) כסמן של אוטם שריר הלב במודל זה. למעשה, רמות הפלזמה של cTnI בקורלציה עם בגדלים האוטם (R2 = 0.8). לבסוף, אנחנו יכולים להראות במספר מחקרים כי טכניקה זו התשואות גדלים האוטם לשעתקו מאוד במהלך IP Murine לבין אוטם שריר הלב ^{6, 8, 30, 40, 41.} לכן, טכניקה זו עשויה לסייע לחוקרים מי לרדוף המנגנונים המולקולריים המעורבים cardioprotection על ידי ה-IP באמצעות גישה גנטיות בעכברים עם מחיקת הגן ממוקדות. מחקרים נוספים על ה-IP לב באמצעות העכברים הטרנסגניים לשקול את הטכניקה הזו.

Protocol

הערות כלליות:

כל הפעולות צריכות להתבצע תחת מיקרוסקופ לנתח זקוף (אולימפוס, SZX10 הודעה עם Z-Axis Crank עם מעמד STU2 StandBoom) ושימוש coagulator כירורגית. אוורור הוא קריטי עבור ההליך ועל כן סכום מסוים של זמן צריכים להיות מופנים בבחירת מאוורר וייעול הטכניקה אוורור. טמפרטורה, לחץ דם ההרדמה צריך להיות יציב לאורך כל הדרך.

1. הרדמה, אינטובציה ניטור

1. השתמש C57BL / 6 עכברים, כי הם לפחות 10 שבועות. להשרות הרדמה באמצעות נתרן pentobarbital ב 70 מנה ip מ"ג / ק"ג משקל גוף שמור הרדמה עם כ -10 ק"ג / מ"ג / h pentobarbital נתרן. היה זהיר עם מינון יתר שכן הדבר עלול להפחית באופן משמעותי את לחץ הדם. Re-המינון של pentobarbital - גם לאחר שעות, יכולה להוביל לעלייה ברמות קשות פלזמה. בהתבסס על ראיות מוצקות בדבר isoflurane כמתחם הלב אנו ממליצים על השימוש של "אינרטי", והקים גם pentobarbital במודל של איסכמיה בשריר הלב ^46-56.
2. המקום עכברים על השולחן בקרת טמפרטורה מחומם (RT, Effenberg, מינכן, גרמניה) עם בדיקה מדחום רקטלי המצורפת בקר משוב תרמי לשמירה על חום גופם על 37 ° C.
3. לאחר אינדוקציה עכברים הרדמה בטוחה בתנוחה אופקית, עם הגפיים העליונות והתחתונות המצורפת השולחן באמצעות סרט דביק, תפר מהודק עד הקרסוליים. לעשות את אותו הדבר עבור הראש באמצעות השיניים. הרחקה מספיק חשוב אינטובציה מוצלחת ניתוח מבוקר היטב. לפני הניתוח, לכסות את העכבר עם שמן מינרלי כדי להפחית את הסיכון לאלרגיה שיער העכבר.
4. לחשוף את קנה הנשימה בניתוח לבצע אינטובציה לקנה הנשימה באמצעות cannulae bluntpolyethylene (Insyte 22g, Beckton דיקינסון, ארה"ב). תצטרכו להקהות את המחט כדי להיות מסוגל להשתמש בו stylet.
5. משוך את הלשון החוצה באמצעות זוג מלקחיים ולאחר מכן דחף בעדינות בזווית 15 מעלות לכיוון הגוף. גם לאחר חשיפה של קנה הנשימה ושל באמצעות מיקרוסקופ, זה עלול לדרוש קצת אימון. שימו לב כי הנזק קטן של קנה הנשימה עלול להוביל לחוסר היכולת לאוורר את החיה לאורך תפר. לכן, אם אתה נתקל בבעיות בדרכי הנשימה לבדוק את קנה הנשימה עבור חורים קטנים.
6. אישור מיקום הצינור הנכון ידי להדמיה ישירה של הצינורית בתוך קנה הנשימה שנחשף בעבר מעל Carina.
7. חבר את צינור ההנשמה. אנו ממליצים על שיטה מבוקרת לחץ אוורור באמצעות C סרוו 900 מסימנס (DRE וטרינרית, ארה"ב). חיות מכן ניתן יהיה מאוורר באמצעות לחץ inspiratory שיא של 10 תדר, mbar של 110 נשימות / דקה לבין לחץ חיובי בסוף הנשיפה של 3-5 mbar עם FiO ₂ = 0.4. הגדרות אולי צריך קצת התאמות כי ניתן להשיג בקלות על ידי בדיקת הריאות במהלך ניתוח חזה פתוח. ודא כי הריאות אינן קרס או המעללים. למרות העובדה כי ה-C סרוו 900 בנוי כמו מאוורר לבני אדם, השימוש בו הגדרה ההנשמה נשלט הלחץ עובד מצוין אוורור של עכברים.
8. ביצוע ניתוח גז דם כדי לאשר את חילוף הגזים רגילה (הלחץ החלקי של החמצן, פאו ₂ של 115 ± 15 מ"מ כספית בלחץ החלקי של פחמן דו חמצני, פאקו ₂ של 38 ± 6 מ"מ כספית) לאחר 4 עד 6 שעות של זמן אוורור באמצעות i-STAT מערכת (אבוט, ארה"ב).
9. מוניטור קצב הלב עם א.ק.ג. (למשל Hewlett Packard, Boblingen, גרמניה). ודא כי קצב הלב לא לרדת מתחת 450. אם העכבר מתפתחת bradicardia לבדוק את הטמפרטורה ואת המינון הרדמה / ריכוז. Xylacin / Ketamin הרדמה מעוררת בלב ליבו של 250 / דקה ולכן אינו מומלץ.
10. החלת החלפת נוזלים תקין. עירוי תמיסת מלח רגיל עם 0.1 מ"ל / שעה באמצעות קטטר עורקי או ורידי יש לבצע לפני תחילת של איסכמיה. כמו כן, בולוס מלוחים של μl 500 יכול להינתן ip לפני הניתוח. Thoractomy יכול לגרום לירידה בלחץ הדם עשויה לדרוש boli מלוחים נוספים. לאחר איסכמיה, קצב העירוי עד 1 מ"ל / שעה עשוי להיות נחוץ כדי לשמור על לחץ דם עורקי ממוצע מעל 60 מ"מ כספית כדי להבטיח reperfusion די קריטי עבור מכתים האוטם באמצעות TTC.
11. מניחים העורק הראשי (PE10, עצה OD (מ"מ / "), Tapered> .024 mm/.011") עבור הקלטה רציפה של לחץ הדם. עורק הצוואר יהיו חשופים דרך לנתיחה בוטה של ​​שרירי paratracheal. בעקבות חשיפת נוסף והימנעות קפדנית של טראומה כל רקמות (במיוחד של העצב מחנק), קטטר מוכנס לתוך הכלי באמצעות שני התפרים ואת מהדק קטן. צרף את הזרוע לגוף לפני שאתה מתחיל לנתח את העורק. זה יחשוף עוד חתיכה של העורק. סוף קשר מאוד של החלק הפרוקסימלי של עורק הצוואר. צרף מהדק גדול לסוף תפר כדילהשיג מתח. מקום אחר תפר סביב העורק לנתח את העורק עד הסוף דיסטלי מאוד. כאן, במקום מהדק קטן. השתמש במספריים מיקרו לחתוך פתח אלכסוני קטן לתוך העורק. החזק את הפתיחה עם מלקחיים קנס (דומון, WPI) ולקדם את הקטטר בגודל תקין עם הידיים / מלקחיים. צור קשר עם תפר השני שלך ולהבטיח את העורק. שחרר את מהדק ולקדם את הקטטר יותר. Secure את הקטטר קשרים עם כמה קלטות.

2. טכניקה של חסימת העורקים הכליליים

1. מנתחים את העור ולחשוף את קיר בית החזה השמאלי בטכניקה דיסקציה קהה.
2. חותכים את שרירי pectorals מגמות וקטינים לחשוף את קיר בית החזה עם כויה. על ידי משיכת העיקריים שבית החזה, הריאות טיפות, ובכך מלקחיים מיחידת electrosurgical יכול להיות מוכנס, ו, 1-3 מ"מ מעל הריאות, קו אופקי חוצה את קורע צריך להיות קרוש.
3. באמצעות מספריים קהה, חתכו את קיר בית החזה. סיכות ביטחון השתנה, שם את הצלחת לתפוס יוסר סוף בוטה כפופה, משמשות לאחר מכן כדי לשמור על החזה פתוח.
4. כדי להקל את המיקום הסופי של תפר, להקריש וחתך את קיר בית החזה לאורך הסרעפת כלפי הצד השמאלי התחתון של החזה.
5. לחשוף את הלב על ידי בניתוח קרום הלב. כדי למנוע תנועות סרעפתי להסיר וחתך את עצב הסרעפת.
6. השתמש מקל קטן גפן רטוב עם מלקחיים ולהפוך את הלב כלפי הצד הימני. זהה את העורקים הכליליים שמאל (רע"א) וכן לוודא כי הריאות לא מנופח מדי. מטב את פתיחת בית החזה יש להחזיק מאובטח של הלב כאשר הנחת תפר. אם לחץ הדם נמוך מדי הזיהוי עלול להיות מסובך. Boli נוספים מלוחים עשוי לשפר את הזיהוי של רע"א. רע"א הוא כלי אדום בהיר חוצה את לב אופקית (בניגוד הוורידים חוזרים). לפעמים, הוא ראה רע"א הטובה ביותר ללא מיקרוסקופ. אין להשתמש יותר מדי אור. זה יכול להוביל לנתק השתקפויות קבלת ראיה בלתי אפשרי.
7. לאחר רע"א מזוהה מבחינה ויזואלית, המקום תפר 8.0 ניילון (Prolene, Ethicon, Notiefies, ארה"ב) סביב רע"א. לצורך לסירוגין רע"א חסימה, אימצנו מודל כרוני של קרדיומיופתיה ⁴² באמצעות מערכת משקל תלוי.
8. נושא תפר דרך חתיכה קטנה של צינור פלסטיק (PE-10 צינורות) עם קצוות בוטה לצרף שתי משקולות קטנות (1G, למשל להשתמש צינורות Eppendorf מלא מים) בסוף כל אחד. עם משקולות חופשיות תלוי על מוט, רע"א צריך מיד יוסתר. בנוסף, כאשר המשקל הוא חש הקלה, רע"א חסימה מסתיימת בבת אחת. רע"א חסימה מוצלחת חייבת להיות מאושרת על ידי שינוי צבע מיידי של כלי השיט מן האור אדום סגול כהה, שינוי צבע של שריר הלב המסופק על ידי כלי השיט (מאדום בהיר עד לבן) ואת הנוכחות של ST-הגבהים של א.ק.ג.. במהלך reperfusion, שינויי צבע מיידי להיעלם. שמור בלב רטוב עם 37 ° C, מלוחים חתיכת ספוג, כותנה סופג לאורך (ראה גם איור 1).
9. בחרו זמן איסכמיה שלך על פי האינטרס העיקרי שלך. למעשה, מחקרים על השפעות ה-IP של הלב, זה יהיה אידיאלי לשימוש בזמן איסכמיה הקשורים בגדלים האוטם של כ -30% עד 40 מתוך AAR. לפיכך, ניתן יהיה להדגים שינויים בשני הכיוונים, הגדלים האוטם למשל קטן עם ה-IP לב או אוטם בגדלים גדולים יותר עם טיפול ניסיוני או מחיקה גנים ספציפיים. בנוסף, העכברים עם גודל האוטם של פחות מ -50% בדרך כלל לשרוד את הניסוי, ואילו הגדלים האוטם של% 60-80 הם בדרך כלל לא שרדו ובעלי חיים מתים לפני הזמן reperfusion תושלם. באמצעות המודל שלנו 10 דקות של שריר הלב ואחריו 2 שעות התוצאה reperfusion בגודל האוטם של 3.5 ± 1.3% של AAR. לעומת זאת, זמן איסכמיה של 60 דקות התוצאות בגודל האוטם ממוצע של 42 ± 5.2% של AAR (p <0.01) ^39. לפיכך, אנו רואים 60 דקות של איסכמיה כאידיאל ללמוד שינויים בשני הכיוונים. עם זאת, ייתכן שיהיה עליך להתאים את זמן איסכמיה בעכברים גנים ממוקדות עם פנוטיפ לנתק.
10. בחרו את הזמן reperfusion הנכון. בפעם reperfusion חשוב מאוד מכתים TTC. צבע חסר צבע מצטמצם לזרז אדומות בצבע ידי dehydrogenases בנוכחות NADH שיתוף האנזים. תאים מתים מאבדים את יכולתם לשמור NADH, ולכן הם כמסומן אזורים חיוור בתוך שריר הלב אדום קיימא מוכתם. התיחום האוטם גודל על ידי TTC מחייב NADH כבר סחוט לגמרי מאזור נמקי. עם זאת, אם reperfusion אינו ארוך מספיק, התיחום גודל האוטם על ידי מכתים TTC עלול לגרום הערכה נמוכה מדי של גודל האוטם בפועל ^43. בידיים שלנו, אחרי זמן איסכמיה של 60 דקות, מדידת גודל האוטם עלה מ 11.5 ± 4.5% לאחר 30 דקות 42.2 ± 5.1%לאחר 120 דקות. לא להגדיל עוד יותר בגודל האוטם יכול להיות מזוהה עם פעמים reperfusion יותר (240 דקות) ^39. לפיכך, אנו ממליצים על תקופת reperfusion 2 שעה שנראה גם הגיוני בהקשר של determination.If אנזים לב אתה מחשיב איסכמיה נפשית מראש, אנו ממליצים 4 מחזורים של IP (איסכמיה 5 דקות, 5 דקות reperfusion), ואחריו בזמן איסכמיה של 60 דקות וזמן reperfusion של 2 שעות. בתנאים אלה, ה-IP נמצאה קשורה לירידה של פי 3.2 בגודל האוטם מ - 42.2 ± 5.1% ל 13.3 ± 3.3% של AAR ^39. עם זאת, בשל מערכת המשקל תלוי, גדודים שונים נפשית מראש יכול בקלות להיות מיושם.

3. קביעת שטח בסיכון (AAR) וגודל האוטם שריר הלב

לאחר גיוס של אוטם שריר הלב (עם או בלי ה-IP), האזור הוא perfused ידי רע"א (אזור בסיכון, AAR) וגודל האוטם עצמו ייקבע בטכניקה מכתים. לאחר מכן, האוטם לאחר מכן ניתן יהיה מחושב כאחוז אוטם שריר הלב בהשוואה AAR. כדי לעשות זאת, טכניקה שתואר לעיל מכתים כפול עם כלוריד כחול triphenyltetrazolium של אוון (TTC) משמש ^44.

1. קבע את AAR בזריקה מדרדר של צבע 1% של אוון כחול לתוך אבי העורקים, בעוד הוא רע"א occluded. לחילופין, אם קטטר carotis נמצא במקום, להשתמש בדרך זו להזרקה כחול אוונס. אוונס כחול לא כל כתם כחול רקמת שריר הלב, למעט AAR. זה קריטי עבור צעד זה כדי למנוע בועות אוויר בתוך הצנתר, כפי שהם היו להיות מוזרק למחזור הדם הכליליים ולמנוע כתמים כחולים של אוון. לפני מכתים את אוונס כחול מומלץ לאסוף דם למדידות אנזים לב. בנוסף, הסרת דם על ידי הזרקת 5 מ"ל של תמיסת מלח דרך אבי העורקים או קטטר carotis מומלץ.
2. לב והבלו ו להתרחץ מלוחים קרים 0.9%
3. הטמע את agarose 2%. אין להשתמש agarose חם מאז זה ימנע מכתים מוצלח.
4. לאחר 30 דקות 4 ° C (או 15 דקות -20 ° C), לחתוך את הלב לפרוסות של 1 מ"מ באמצעות מטריצה ​​לב או microtome. אם תמקם את הלב למקפיא למנוע הקפאה יבשה שתוביל לבבות הלא מוכתם.
5. דגירה את הפרוסות עם TTC 1% ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות באמצעות כובע 15 מ"ל כחול באמבט מים. זה יאפשר את אזור infarcted להיות התחום כאזור לבן, בעוד כתמים רקמות קיימא אדום.
6. לקבע את פרוסות מוכתם fomaldehyde 10% במשך הלילה. בעשותם כך, באזור infarcted היא בניגוד טוב יותר לשיפור איכות של תמונות.
7. קבע את שטח בסיכון (AAR) ואת גודל האוטם דרך planimetry באמצעות תמונה תוכנה NIH 1.0 ^45.
8. חישוב אחוזים של אוטם שריר הלב מאזור בסיכון.

4. אנזימים לב מדידה

בשל מגבלות הקשורות מכתים TTC אנו ממליצים readout נוספות כמו חומרת האוטם בשריר הלב קביעת לב טרופונין I (cTnI) רמות בסרום של עכברים. דם יהיה המתקבל הווריד הפורטל בסרום רמות cTnI נקבעים אז עם assay כמותי cTnI מהירה (אבחון החיים, Inc, במערב צ'סטר, פנסילבניה, ארה"ב).

5. נציג תוצאות:

איור 1.) A (דגם ה-IP של הלב באמצעות מערכת תלוי במשקל של חסימה כלילית. טכניקה זו אינה דורשת עבור הקשר חסימה כלילית. (B, C) כירורגי ההתקנה. (ד) תמונה של לב Murine עם העורק הכלילי השמאלי (רע"א, חיצים) לאחר חסימה. זיהוי חזותי של רע"א הכרחי קשירת ו נפשית מראש איסכמי בעכברים. תפר 8.0 ניילון ממוקם סביב 1-2 מ"מ רע"א מתחת אפרכסת שמאל. תפר הוא מושחל דרך צינור פלסטיק קטן (*). סופו של כל תפר מחובר משקל קטן (1G) ו תפר מושם על מוטות בשני הצדדים. (ה) קביעת AAR אחרי רע"א חסימה ו מדרדר הזרקה של צבע כחול של אוון לתוך האאורטה. AAR נותר בלא כתם בעוד שאר שריר הלב הוא כחול. לאחר דגירה של רקמת AAR עם TTC, המוכתם אזור infarcted לבן, בעוד האדומים קיימא רקמה צבעונית.

Discussion

המחקר הנוכחי מתאר טכניקה חדשנית של ביצוע IP במודל Murine שלם באמצעות מערכת תלוי במשקל ובכך להימנע מחסימה של העורקים הכליליים על ידי פקעת. למעשה, מחקר זה מדגים הגדלים האוטם לשעתקו מאוד והגנה לב על ידי ה-IP, ובכך לצמצם את השונות הקשורות בקשר מבוססי מודלים חסימה כלילית. חוקרים הרואים בלימוד cardioprotection על ידי ה-IP של עכברים עשויים להפיק תועלת ממודל זה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Pentobarbital (Fatal Plus)	Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd	V.P.L. 9372	4mg/mL in saline
TTC	Sigma-Aldrich	17779 Fluka	1.5 % in PBS
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129	10g in 1 L PBS
Insyte 22 G	BD Biosciences	n/a
Suture, silk 4.0	Harvard Apparatus	517698
Suture, Prolene 8.0	Ethicon Inc.	M8739	reusable
Heart Matrix	Zivic Instruments	# HSMS001
Siemens 900 C	DRE Veterinary	# 336	refurbished
dissecting microscope (SZX10 )	Olympus Corporation	n/a	consider generous working distance
Heating Table	Rt, Effenberger, Germany	n/a	only and single provider
Blood pressure device	Cyber Sense, Inc	BPM02
I STAT	Abbott Laboratories	n/a