הרחבה, טיהור, והערכה תפקודית של האדם תאים דם היקפיים NK

Summary

כאן אנו מתארים שיטה יעילה להרחיב ולטהר מספר גדול של תאים NK האדם להעריך את תפקידם.

Abstract

טבעיים (NK) תאים הרוצח לשחק תפקיד חשוב במעקב החיסונית כנגד מגוון רחב של מיקרואורגניזמים גידולים זיהומיות. זמינות מוגבלת של תאים NK ואת היכולת להרחיב את במבחנה הגביל התפתחות של תא חיסוני NK. כאן אנו מתארים שיטה יעילה להרחיב את כמויות עצומות של תפקודי vivo לשעבר בתאי NK באמצעות K562 תאים להביע קרום הנכנס IL21, כתא אנטיגן הצגת מלאכותי (aAPC).

טיפולים NK תא המאמצת עד כה נוצלו מוצר תא מתקבל על ידי leukapheresis היציב של התורם ואחריו דלדול בתאי T או סלקציה חיובית של תאים NK. המוצר מופעל בדרך כלל IL-2 לילה ומנוהלים אז למחרת ^1. בשל שכיחות נמוכה של תאים NK בדם ההיקפי, מספר קטן יחסית של תאים NK הועברו בניסויים קליניים.

חוסר היכולת להפיץ בתאי NK במבחנה כבר את הגורם המגביל להפקת מספרים תא מספקת תוצאה קלינית אופטימלית. יש הרחבה של תאים נ"ח (פי 5-10 על 1-2 שבועות) יש להיות מושגת באמצעות מינון גבוה של IL-2 בלבד ^2. הפעלה של תאים T עצמיים יכולים לתווך הרחבת התא NK, ככל הנראה גם באמצעות שחרור ציטוקין המקומי ^3. תמיכה עם stroma mesenchymal או תאים מלאכותיים הצגת אנטיגן (aAPCs) יכול לתמוך את התפשטות תאים NK מדם הן פריפריה דם טבורי ^4. NKp46 משולב והפעלה CD2 ידי נוגדן חרוזים מצופים משווק כיום להרחבת התא NK (Miltenyi BIOTEC, אובורן CA), וכתוצאה מכך כ -100 הרחבה של פי 21 ימים.

ניסויים קליניים תוך שימוש aAPC-מורחבת או המופעל בתאי NK נמצאים בעיצומם, אחד באמצעות שורת תאים leukemic CTV-1 אל התאים הממשלה להפעיל NK ⁵ ללא הרחבה משמעותית. במשפטו השני מנצל EBV-LCL להרחבת התא NK, השגת הרחבה 490 פי פירוש ב 21 ימים ^6. השלישי מנצל aAPC K562 מבוססי transduced עם 4-1BBL (CD137L) ואת קרום הנכנס IL-15 (MIL-15) ^7, אשר השיגה הרחבה נ"ק ממוצע 277 של פי 21 ימים. אמנם, התאים נ"ח הרחיבה באמצעות K562-41BBL-mIL15 aAPC הם ציטוטוקסיים מאוד במבחנה in vivo בהשוואה לתאי NK מורחבת, ולהשתתף ADCC, התרבות שלהם מוגבל על ידי ההזדקנות המיוחסת התקצרות הטלומרים ^8. לאחרונה התרחבות של פי 350 של תאים NK נמסר באמצעות K562 מיקה להביע, 4-1BBL ו IL15 ^9.

השיטה שלנו הרחבת התא NK המתוארים כאן מייצר התפשטות מהירה של תאים NK ללא הזדקנות השגת הרחבה 21,000 פי חציון 21 ימים.

Protocol

1. בידוד של PBMCs מן באפי Coat

כדוריות דם היקפיים mononuclear (PBMC) מתקבלים על ידי צנטריפוגה צפיפות קליל על Ficoll-Paque מן בריא התורם באפי דגימות מעיל שהפיק leukapheresis.

1. צנטריפוגה Ficoll-Paque נעשה כפרוטוקול יצרן לכל עם שינויים קלים.
2. הוסף PBS לתורם נורמלי הדם הבנק מעיל באפי לנפח סופי של 140 מ"ל (אופייני נפח באפי המעיל הוא 40-70 מ"ל).
3. שכבה 35 מ"ל של המדגם מעיל באפי על 15 מ"ל של Ficoll-Paque (4 צינורות).
4. צנטריפוגה ב 400 במשך 20 דקות ללא בלם.
5. שחזור PBMCs מן Ficoll-Paque: ממשק פלזמה, אין להשליך את RBCs בתחתית Ficoll-Paque.
6. לשטוף PBMCs שלוש פעמים עם PBS, centrifuging כל פעם 400 גרם במשך 10 דקות.
7. PBMCs ניתן להשתמש ישירות להרחבת התא NK בשלב זה או תאים NK יכול להיות מבודד על ידי RosetteSep (סעיף 4)
8. PBMCs נותרת יכול להיות קפוא FBS DMSO המכיל 10% חנקן נוזלי.
9. לשאוב Ficoll לאסוף את RBCs מן שלב 5 לשני שפופרת 50 מ"ל צנטריפוגות, לשטוף שלוש פעמים עם PBS (להוסיף 50 מ"ל סימן), בכל פעם לשאוב ברפרוף supernatant העליון של שכבת RBC להסיר גרנולוציטים.
10. RBCs ניתן להשתמש מיד לטיהור  RosetteSep בתאי NK (ראה סעיף 4) או לאחסן נפח שווה של הפתרון של Alsever ב 4 ° C לשימוש מאוחר יותר (RBCs ניתן לאחסן לכל היותר 4 שבועות).

2. NK הרחבת Cell

הרחבת התא NK יכול להיות יזם באמצעות PBMCs או מטוהרים בתאי NK. כמות PBMCs המשמש להרחבת יכולים להיות מגוונים בהתאם לכמות התאים נ"ח הרצוי בסוף הרחבה שלוש בשבוע, עיין בסעיף נציג תוצאות לקבלת פרטים. (ראה הערה 1)

גירוי 1

יום 0

1. עבור כל ⁶ PBMCs 5x10 יורחב, לספור מקרינים 10x10 ⁶ K562 Cl9 mIL21 באמצעות irradiator גמא ב -100 Gy.
2. הקרנה פוסט, לשטוף את התאים עם PBS ו resuspend בהרחבת NK תא התקשורת (NKEM).
3. 5x10 Seed ⁶ PBMCs 10x10 עם ⁶ מוקרן K562 Cl9 mIL21 (יחס 01:02) ב 40 מ"ל של NKEM בבקבוק T75 ולמקם אותו זקוף באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO _2.

ימים 3 ו 5

4. שחזור תאים על ידי צנטריפוגה ב 400 דקות 5 ולהחליף חצי התקשורת עם NKEM טרי (הוספת IL2 טרי נפח התקשורת כולו) ולהמשיך תרבות.

גירוי 2

יום 7

1. ספירת התאים בתרבית בסוף שבוע אחד.
2. מניחים בצד 5x10 ⁵ תאים phenotyping ידי cytometry זרימה (ראו הערה 2)
3. עבור כל ⁶ תאים 5x10 להיות restimulated, לספור מקרינים 5x10 ⁶ K562 Cl9 mIL21 באמצעות irradiator גמא ב -100 Gy.
4. הוסף מספר שווה של מוקרן K562 Cl9 mIL21 (1:1 יחס) ו resuspend ב NKEM ב 2.5x10 ⁵ תאים בסך הכל / מ"ל (ראו הערה 3).
5. זרעים תאים T75 צלוחיות (מקסימום 50 מ"ל לכל בקבוק).

יום 10 ו -12

6. ספירת התאים.
7. שנה שלמה התקשורת עם NKEM טרי המבוססים על המספרים תא (ראה הערה 3).

יום 14

8. בתום שבועיים של הרחבה לספור את מספר התאים בתרבית.
9. מניחים בצד 5x10 ⁵ תאים phenotyping ידי cytometry זרימה (ראו הערה 2)
10. אם ההרחבה הייתה החל מ PBMCs התאים נ"ח יכול להיות מטוהרים בשלב זה של התרחבות באמצעות פרוטוקול טיהור RosetteSep (עיין סעיף IV). אם הרחבה החלה מטוהרים מן התאים נ"ח להמשיך גירוי 3.
11. לאחר טיהור להפריש 5x10 ⁵ תאים phenotyping ידי cytometry זרימה לאמת טוהר של תאים נ"ח (כמו שלב 8).
12. המשך גירוי 3 באמצעות כל התאים מטוהרים NK (ראה הערה 4).

גירוי 3

1. Resuspend נ"ח תאים עם מוקרן K562 Cl9 mIL21 (1:1 יחס) ב NKEM מבוסס על מספרים סלולריים (ראו הערה 3).

17 ימים ו - 19

2. ספירת התאים.
3. שינוי בתקשורת עם NKEM טרי המבוססים על המספרים תא (ראה הערה 3).

יום 21

4. בתום שלושה שבועות של הרחבה לספור את מספר התאים בתרבית.
5. שחזור 1x10 ⁶ תאים לניתוח cytometry זרימה מלאה עבור פאנל NK phenotyping תא נוגדן (ראו טבלה 1).
6. הקפאת תאים FBS המכילה DMSO 10% בצפיפות מירבית של 5x10 ⁷ תאים לכל בקבוקון לשימוש עתידי.

3. Cytotoxicity NK Cell Assay

1. הפשירי בקבוקון של תאים NK ואת הזרע NKEM, יום אחד לפני performing assay cytotoxicity כדי לאפשר התאוששות.
2. עבור כל assay cytotoxicity NK לתא המטרה באמצעות תא יחיד קו, 6x10 ⁵ תאים NK ו 3x10 ⁵ תאים היעד נדרשים (ראו הערה 5).
3. הכן CAM-Media ידי דילול Calcein-AM (מניות 1 מ"ג / מ"ל ​​ב DMSO) ב NKEM (ראה הערה 6).
4. Resuspend 10 ⁶ תאים היעד של 1 מ"ל CAM מדיה (ראה הערה 7).
5. דגירה עבור h 1 ב 37 ° C, עם רועד מדי פעם.
6. Resuspend בתאי NK ב 1x10 ⁶ תאים / mL ולהוסיף 200uL ההשעיה תא NK לכל אחד 3 הבארות של bottom-U-96 גם צלחת to10 המתאים: 1 E: היחס T שמוצג באיור 1. (ראה הערה 8)
7. הוסף 100uL של מדיה מלאה על כל בארות הנותרים מלבד "מקסימום".
8. הוסף 100uL של 2% Triton X-100 של "מקסימום".
9. ביצוע דילולים סדרתי של תאים NK עבור ה 5 הבאים: יחסי T על ידי העברת 100uL של תאים בכל פעם, ומערבבים היטב. בטל 100uL מבארות האחרון (ה ': יחס של 0.3125:1 T).
10. אחרי שעה 1 של טעינה calcein, לשטוף את התאים היעד NKEM פעמיים, centrifuging במשך 5 דקות ב 1200 סל"ד. (ראה הערה 9)
11. לספור מחדש את התאים היעד resuspend ב 1x10 ⁵ תאים / מ"ל.
12. הוספת 100 μL של תאים היעד היטב כל (1x10 ⁴ / טוב). צנטריפוגה 1 דקות ב 100 גרם ליזום קשר עם התא.
13. לדגור על 37 ° C ו 5% CO ₂ למשך 4 שעות.
14. מערבבים בעדינות את התרבות על ידי pipetting עם pipetter 100 μL מנת אחיד להשעות את calcein שוחררו, התפנית כלפי מטה על צלחת 100 גרם במשך 5 דקות עד גלולה התאים והעברת 100 μL של supernatant כדי בצלחת חדש בטיפול, כדי למנוע בועות. פופ כל בועות כי עלול להיווצר באמצעות מחט דקה.
15. קרא את הצלחת באמצעות קורא צלחת ניאון (מסנן עירור 485 ננומטר, פליטת לסנן 530 ננומטר). מומלץ לקרוא התחתונה.
16. חישוב תמוגה אחוז מסוים לפי הנוסחה [(שחרור-ספונטנית מבחן שחרור) / (שחרור מרבי - שחרור ספונטני)] x 100.

4. NK טיהור Cell ידי RosetteSep

1. קח 100 של פי עודף של RBCs לזה של PBMCs או תאים מורחבת, לתוך שפופרת 50 מ"ל (100:1 RBC: PBMC).
2. אם RBCs טריים באמצעות להמשיך ישירות לשלב הבא או אם RBCs אוחסנו פתרון של Alsever, לספור את מספר RBCs ולשטוף המתאים (100 עודף לקפל) כמות RBCs עם PBS בתוספת 2% FBS שלוש פעמים, centrifuging בסל"ד 1200 במשך 10 דקות בכל פעם.
3. שלב RBCs עם PBMCs משלב 1.7 או תאים מורחבת משלב 2.10 ב PBS + 2% FBS לנפח סופי של 1 מ"ל לכל 5x10 ⁷ של PBMCs או תאים מורחבת.
4. הוסף 1μL של RosetteSep  האדם העשרה NK תא קוקטייל לכל 1x10 ⁶ של PBMCs או תאים מורחבת.
5. מערבבים היטב דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות עם ערבוב עדין כל 5 דקות.
6. מוסיפים נפח שווה של תערובת PBS FBS + 2% בעדינות שכבה על גבי Ficoll-Paque.
7. חזור על השלבים של צנטריפוגה Ficoll-Paque תיאר לבידוד PBMC (סעיף I).
8. ספירת התאים נ"ח התאושש לאחר טיהור להפריש 5x105 תאים phenotpying ידי cytometry זרימה על טוהר תא NK (שלב 8).

5. הערות

הערה 1. בתאי NK ניתן להרחיב ישירות PBMCs, או RosetteSep  תאים מטוהרים NK. רשמנו לפנינו את יעילות הרחבה דומה, אך תורמים כמה יכול להיות נמוך מאוד מספרים תא NK וכתוצאה מכך טיהור קושי על ידי RosetteSep לפני התרחבות.

הערה 2. אנו משתמשים באופן שגרתי CD56-FITC, CD16-PE, ו-PE-CD3 Cy5 עבור phenotyping במהלך התרחבות, מונה תאים NK לאלה אשר CD3-שלילי CD16-CD56 או חיובי.

הערה 3. כל שינוי התקשורת או גירוי, תאים resuspend ב 2.5 x מ"ל 10 / ⁵ לשמור PBMC / NK מספרים התא או מתחת 2 מיליון דולר מ"ל בשלבי השיא של התרחבות. זה ימנע דלדול של חומרים מזינים לסייע בהשגת הרחבה הישרדות מירבית.

הערה 4. שיעור ההתרחבות NK הוא התורם תלויה בסופו של גירויים 1 או 2 חלק מהתאים אפשר להקפיא חלק התרחב עוד יותר, בהתאם לצורך הניסוי. יש לנו הצלחה טובה באמצעות תאים קפואים הרחבות במועד מאוחר יותר.

הערה 5. על מנת לאפשר מקום לטעויות אנו ממליצים להשתמש מינימום של 7x10 ⁵ תאים NK resuspended ב 700 ULS של NKEM ו ⁵ 4x10 Calcein-AM מוכתם היעד תאים resuspended ב 4 מ"ל של NKEM עבור הקמת assay cytotoxicity. אם באמצעות פיפטה רב עבור זריעת התאים היעד כמויות גבוהות יותר של תאים (עד 6x10 ⁵ מ"ל 6) עשויים להידרש מבוסס על גודל מדיה אגן בשימוש. גם המספרים מומלץ תא NK הם במיוחד עבור E: יחסי T להראות בפרוטוקול, לשימוש E גבוה: יחסי T להגדילהתא NK מספרים לכל מ"ל בהתאם (למשל עבור דואר 40:1: השימוש T יחס 4x10 ⁶ תאים / מ"ל)

הערה 6. אנו ממליצים לבצע טיטרציה ראשונית Calcein-AM טעינת לקו היעד תא של בחירה, באמצעות דילולים הבאות של 1:500, 1:400. 1:300, 1:200 ו - 1:100 להשיג אופטימלי ההבדל בין שחרור מקסימלי ספונטנית.

הערה 7. כשמשתמשים קו תא חסיד כמטרה, תחילה להכין ההשעיה תא בודד באמצעות אי - האנזימטית חיץ ניתוק התא. אם ביצוע ADCC, להכין צינור כפולות של תאים היעד CAM מדיה.

הערה 8 אם ביצוע ADCC, להוסיף לתאי NK אותו 3 בארות המתאים E 10:01:. T עבור ADCC. חזור לתורמים נוספים. חזור עבור תאים יעד נוספים.

הערה 9. אם ביצוע ניסוי ADCC, לאחר 45 דקות של טעינה calcein, להוסיף 10ug של נוגדנים ספציפיים עבור גרימת ADCC נגד התאים היעד. לאחר 15 דקות, לשטוף תאים היעד בינוני מלא פעמיים, centrifuging 5 דקות ב 1200 סל"ד. תאים Resuspend ב ⁵ תאים 1x10 / mL ולהמשיך לשלב הבא בפרוטוקול.

6. נציג תוצאות

איור 2. כאשר הרחבת מבוצע לפי התוכנית שתוארה לעיל, באמצעות 5x106 PBMCs כחומר מוצא, אופייני התא NK התשואות נעות בין 1x10 ^{אוקטובר 09-10} תאים (השתנות התורם תלויה). האיור מציג הרחבת התא NK לקפל (n = 19) בהשוואה לתאי NK נוכח המוצר המקורי (חציון + / - ברבעון).

איור 3. התאים מורחבת NK מבטאים שונים קולטני התא NK כי הם דומים לתאי NK מורחבת ראשוני עם כמה יוצאים מן הכלל (CD11b, CD160 ו CD244).

איור 4. ההתאוששות PBMCs מן באפי המעיל הוא התורם תלויה יכול לנוע בין ⁶ ל 300x10 800x10 ^6. התאים עשויים NK מהווים 2% - 18% PBMCs. עבור טיהור RosetteSep של תאים מורחבת, התאוששות של תאים NK טהור ביום 14 נע בין 40-70%. על ידי ביצוע הפרוטוקול המומלץ של התרחבות וטיהור, טוהר תא NK של 99% ניתן לצפות.

איור 5. בתאי NK מורחבת הוכיחו cytotoxicity נגד מגוון של שורות תאים סרטניים ובהם נוירובלסטומה, AML, אוסטאוסרקומה ומלנומה (רצח נציג AML כפי שמוצג תמוגה אחוז מסוים).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
	נוגדן	נפח לכל מבחן	חברה	מספר קטלוגי
Tube 1	אלוטיפ FITC אלוטיפ FITC אלוטיפ FITC אלוטיפ FITC FACS הצפת סך נפח	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen	555748 555749 557224 340442
Tube 2	CD56 FITC NKp30 PE NKp44 PE NKp46 PE CD3 PE-Cy5 CD16 אלכסה 647 FACS הצפת סך נפח	5 5 5 5 5 5 70 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen	340410 558407 558563 557991 555341 557710
Tube 3	CD56 FITC KIR2DL1 PE KIR2DL2 / 3 PE KIR3DL1 PE CD3 PE-Cy5 NKG2D APC FACS הצפת סך נפח	5 5 5 5 5 5 70 100	BD Pharmingen R & D מערכות Miltenyi BIOTEC R & D מערכות BD Pharmingen BD Pharmingen	340410 FAB1844P 130-092-618 FAB12251P 555341 558071
Tube 4	CD56 FITC CD11b PE CD3 PE-Cy5 CD27 APC FACS הצפת סך נפח	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen	340410 555388 555341 558664
Tube 5	CD56 FITC CD266 (DNAM-1) PE CD3 PE-Cy5 CD160 Alexa647 FACS הצפת סך נפח	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences	340410 559789 555341 51-1609-42
Tube 6	CD56 FITC CD244 (2B4) PE CD3 PE-Cy5 CD197 (CCR7) APC FACS הצפת סך נפח	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences	340410 550816 555341 17-1979-42