Expansión, purificación y evaluación funcional de la sangre periférica humana células NK

Resumen

Aquí se describe un método para expandir de manera eficiente y purificar una gran cantidad de células NK humanos y evaluar su función.

Resumen

Asesinas naturales (NK) desempeñan un papel importante en la vigilancia inmune contra una variedad de microorganismos infecciosos y tumores. La limitada disponibilidad de las células NK y la capacidad de ampliar in vitro ha restringido el desarrollo de la inmunoterapia de las células NK. Aquí se describe un método para expandir de manera eficiente grandes cantidades de células NK funcionales ex vivo utilizando células que expresan K562 membrana IL21, como artificial célula presentadora de antígeno (AAPC).

Terapias de células NK adoptivos a la fecha han utilizado un producto de células obtenidas por el estado de equilibrio de la aféresis de donantes seguido por el agotamiento de las células T o de la selección positiva de las células NK. El producto se activa normalmente en IL-2 durante la noche y luego se administra el día siguiente ^1. Debido a la baja frecuencia de las células NK en sangre periférica, un número relativamente pequeño de las células NK se han entregado en los ensayos clínicos.

La incapacidad para propagar las células NK in vitro ha sido el factor limitante para la generación de un número suficiente de células para el resultado clínico óptimo. Algunos expansión de las células NK (50-10 veces más de 1-2 semanas) se logra a través de altas dosis de IL-2 sola ^2. La activación de células T autólogas puede mediar la expansión de células NK, probablemente también a través de la liberación de citoquinas local ^3. Apoyo con estroma mesenquimal o de células presentadoras de antígeno artificiales (aAPCs) puede apoyar la expansión de las células NK, tanto de sangre periférica y sangre de cordón umbilical ^4. Combinado NKp46 y la activación CD2 por anticuerpos revestida de piedras se comercializan actualmente para la expansión de las células NK (Miltenyi Biotec, Auburn CA), lo que resulta en la expansión de aproximadamente 100 veces en 21 días.

Los ensayos clínicos utilizando AAPC-expandido o activa las células NK están en marcha, uno con línea celular leucémica CTV-1 a las células NK y activar primer ⁵ sin una expansión significativa. Un segundo ensayo utiliza EBV-LCL para la expansión de las células NK, logrando una expansión media de 490 veces en 21 días ^6. La tercera utiliza un AAPC K562 basado transducidas con 4 1BBL (CD137L) y ⁷ de membrana IL-15 (MIL-15), que alcanzó una expansión media de NK 277 veces en 21 días. A pesar de que las células NK ampliado con K562-41BBL-mIL15 AAPC son altamente citotóxicos in vitro e in vivo frente a dilatar las células NK, y participar en la ADCC, su proliferación se ve limitada por la senescencia atribuido a acortamiento de los telómeros ^8. Más recientemente, una expansión de 350 veces de las células NK se informó mediante K562 expresan MICA, 4 y ⁹ 1BBL-IL15.

Nuestro método de expansión de las células NK se describe en este documento produce una rápida proliferación de las células NK, sin alcanzar la senescencia una expansión media de 21.000 veces en 21 días.

Protocolo

1. Aislamiento de PBMC de Buffy Coat

Las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) se obtienen por centrifugación densidad de flotación en Ficoll-Paque de las muestras de donantes sanos capa leucocitaria obtenidas por aféresis.

1. La centrifugación de Ficoll-Paque se hace como por el protocolo del fabricante con ligeras modificaciones.
2. Añadir PBS a un donante normal de bancos de sangre la capa leucocitaria a un volumen final de 140 ml (volumen típico de la capa leucocitaria es 40-70 mL).
3. Capa de 35 ml de muestra de la capa leucocitaria en 15 ml de Ficoll-Paque (4 tubos).
4. Centrifugar a 400 g durante 20 minutos sin freno.
5. Recuperar los PBMCs de la Ficoll-Paque: interfaz de plasma, no descartan los glóbulos rojos en la parte inferior de la Ficoll-Paque.
6. Lave PBMCs tres veces con PBS, centrifugando cada vez a 400 g durante 10 minutos.
7. PBMCs se puede utilizar directamente para la expansión de las células NK en esta etapa o células NK pueden ser aislados por RosetteSep (Sección 4)
8. PBMCs restantes pueden ser congelados en FBS que contiene DMSO al 10% en nitrógeno líquido.
9. Aspirar el Ficoll y recoger los glóbulos rojos a partir del paso 5 en dos tubo de centrífuga de 50 ml, lavar tres veces con PBS (añadido a la marca de 50 ml), cada vez que aspire el sobrenadante rozando la parte superior de la capa de glóbulos rojos para eliminar los granulocitos.
10. Los glóbulos rojos pueden ser utilizados inmediatamente para RosetteSep  purificación de las células NK (véase la Sección 4) o almacenado en un volumen igual de solución de Alsever a 4 ° C para su uso posterior (Los glóbulos rojos se puede almacenar por un máximo de 4 semanas).

2. La expansión de células NK

La expansión de las células NK puede iniciarse mediante PBMC o células NK purificadas. La cantidad de PBMCs utilizados para la expansión puede variar según la cantidad de las células NK deseado al final de una expansión de tres semanas, consulte al representante de la sección de resultados para más detalles. (Ver Nota 1)

ESTIMULACIÓN 1

Día 0

1. Para cada 5x10 ⁶ PBMCs ser ampliado, cuenta e irradiar 10x10 ⁶ K562 CL9 mIL21 con un irradiador gamma a 100 Gy.
2. Después de la irradiación, se lavan las células con PBS y resuspender las células NK en la expansión de medios (Nkem).
3. Semillas de 5x10 ⁶ PBMC irradiadas con 10x10 ⁶ K562 CL9 mIL21 (1:2) en 40 ml de Nkem en un matraz T75 y colóquelo en una incubadora a 37 ° C y CO ₂ al 5%.

Días 3 y 5

4. Recuperar las células por centrifugación a 400 g durante 5 minutos y vuelva a colocar la mitad de los medios de comunicación con Nkem fresca (la adición de IL-2 frescas para el volumen de los medios de comunicación todo) y al cultivo.

ESTIMULACIÓN 2

Día 7

1. Cuente el número de células en cultivo al final de una semana.
2. Ponga a un lado 5x10 ⁵ células de fenotipo por citometría de flujo (ver Nota 2)
3. Para cada uno de 5x10 ⁶ células se estimularon de nuevo, contar e irradiar 5x10 ⁶ K562 CL9 mIL21 con un irradiador gamma a 100 Gy.
4. Añadir un número igual de elementos combustibles irradiados K562 CL9 mIL21 (1:1 ratio) y resuspender en Nkem a 2.5x10 ⁵ el total de células / ml (Ver Nota 3).
5. Las células de las semillas en frascos T75 (un máximo de 50 ml por frasco).

Días 10 y 12

6. Cuente el número de células.
7. Cambiar los medios de comunicación con toda Nkem fresco basado en el número de células (Ver Nota 3).

El día 14

8. Al final de dos semanas de la expansión de contar el número de células en cultivo.
9. Ponga a un lado 5x10 ⁵ células de fenotipo por citometría de flujo (ver Nota 2)
10. Si la expansión se inició a partir de PBMC las células NK pueden ser purificados en esta etapa de expansión mediante el protocolo de purificación RosetteSep (véase la Sección IV). Si la expansión se inició a partir de las células NK purificadas proceder a la estimulación 3.
11. Después de la purificación de lado 5x10 ⁵ células de fenotipo por citometría de flujo para verificar la pureza de las células NK (como en el paso 8).
12. Continuar con la estimulación 3 con todas las células NK purificadas (Ver Nota 4).

ESTIMULACIÓN 3

1. Resuspender las células NK con irradiado K562 CL9 mIL21 (1:1) en Nkem basado en el número de células (Ver Nota 3).

Días 17 y 19

2. Cuente el número de células.
3. Cambiar los medios de comunicación con Nkem fresco basado en el número de células (Ver Nota 3).

El día 21

4. Al cabo de tres semanas de la expansión de contar el número de células en cultivo.
5. Recuperar 1x10 ⁶ células para el análisis de citometría de flujo para el panel completo de las células NK anticuerpos fenotipo (ver Tabla 1).
6. Congelar las células de FBS que contiene 10% de DMSO a una densidad máxima de 5x10 ⁷ células por frasco para su uso futuro.

3. Células NK Citotoxicidad de ensayo

1. Descongelar un vial de células NK y la semilla en Nkem, un día antes de performing ensayo de citotoxicidad para permitir la recuperación.
2. Para cada ensayo de células de la citotoxicidad NK utilizando una línea de células objetivo único, 6x10 ⁵ células NK y 3x10 ⁵ células diana se requieren (ver nota 5).
3. Prepare CAM-Media mediante la dilución de calceína-AM (stock 1 mg / ml en DMSO) en Nkem (Ver Nota 6).
4. Resuspender 10 ⁶ células diana en 1 ml de CAM-media (Ver Nota 7).
5. Incubar durante 1 hora a 37 ° C, con agitación ocasional.
6. Resuspender las células NK en 1x10 ⁶ células / ml y añadir 200uL de la suspensión de las células NK a cada uno de los tres pozos de fondo en U de 96 pocillos correspondientes a 10: 1 E: índice T se muestra en la Figura 1. (Ver Nota 8)
7. Añadir 100uL de los medios de comunicación completa a todos los pocillos restantes a excepción de "Máximo".
8. Añadir 100uL del 2% Triton X-100 a "Máximo".
9. Realizar diluciones seriadas de las células NK para la E 5 siguientes: Relaciones de T mediante la transferencia de 100uL de células cada vez, mezclar bien. Deseche 100uL de los últimos pozos (E: T proporción de 0.3125:1).
10. Después de 1 hora de carga calceína, lavar las células diana en Nkem dos veces, la centrifugación durante 5 min a 1200 rpm. (Ver Nota 9)
11. Recuento de las células diana y resuspender en 1x10 ⁵ células / ml.
12. Añadir 100 ml de las células diana a cada pocillo (1x10 ⁴ / y). Centrifugar durante 1 minuto a 100 g para iniciar el contacto de la célula.
13. Se incuba a 37 ° C y 5% de CO ₂ durante 4 horas.
14. Mezclar suavemente la cultura con la pipeta con una pipeta de 100 l con el fin de suspender de manera uniforme la calceína liberados, la desaceleración de placas a 100 g durante 5 minutos para que sedimenten las células y la transferencia de 100 L del sobrenadante a un nuevo plato con cuidado para evitar burbujas. Pop todas las burbujas que se forman con aguja fina.
15. Lea la placa con un lector de placas fluorescentes (excitación filtro de 485 nm, emisión de filtro de 530 nm). Lectura inferior es recomendable.
16. Calcular porcentaje de lisis específica de acuerdo a la fórmula [(versión de prueba de liberación espontánea) / (máximo liberación - la liberación espontánea)] x 100.

4. NK purificación de células por RosetteSep

1. Tener 100 veces el exceso de glóbulos rojos a la de PBMC o células expandidas, en un tubo de 50 ml (100:1 RBC: CMSP).
2. Si utiliza los glóbulos rojos frescos vaya directamente al paso siguiente o si los glóbulos rojos se almacenan en la solución de Alsever s, contar el número de glóbulos rojos y lavar apropiado (100 veces superior a) la cantidad de glóbulos rojos con PBS suplementado con FBS al 2% tres veces, centrifugando a 1200 rpm durante 10 minutos cada vez.
3. Los glóbulos rojos se combinan con PBMC a partir del paso 1.7 o células expandidas desde el paso en PBS 2,10 + 2% de SFB a un volumen final de 1 ml por 5x10 ⁷ de PBMC o células expandidas.
4. Añadir 1μL de RosetteSep  Células NK Cóctel de enriquecimiento por 1x10 ⁶ de PBMC o células expandidas.
5. Mezclar bien e incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos con agitación suave cada 5 minutos.
6. Añadir un volumen igual de PBS + 2% de SFB mezclar suavemente y la capa en la parte superior de Ficoll-Paque.
7. Repita los pasos de centrifugación Ficoll-Paque descrito para el aislamiento de PBMC (Sección I).
8. Contar las células NK se recuperó después de la purificación y dejar de lado 5x105 células de phenotpying por citometría de flujo para la pureza de las células NK (Paso 8).

5. Notas

NOTA 1. Las células NK se puede ampliar directamente de PBMCs, o de RosetteSep células NK purificadas . Hemos tomado nota de la eficiencia de expansión similar, pero algunos donantes pueden tener un número muy bajo de células NK que resulta en la purificación de dificultad RosetteSep antes de la expansión.

NOTA 2. Habitualmente usamos CD56-FITC, CD16-PE y CD3-PE-Cy5 para fenotipificación durante la expansión, la enumeración de las células NK como los que son CD3 negativo y CD16-CD56 o positiva.

NOTA 3. En cada cambio de los medios de comunicación o la estimulación, las células se resuspenden en 2,5 x 10 ⁵ / ml para mantener PBMC / NK número de células en o menos de 2 millones por ml en etapas pico de la expansión. Esto evitará el agotamiento de los nutrientes y ayudan a lograr la expansión máxima y la supervivencia.

NOTA 4. La tasa de expansión es NK dependientes de los donantes y al final de estímulos 1 y 2 parte de las células se pueden congelar y parte amplió aún más en función de la necesidad de experimentación. Hemos tenido buen éxito en el uso de las células congeladas para la expansión en un momento posterior.

NOTA 5. Con el fin de dejar espacio para el error se recomienda utilizar un mínimo de 7x10 ⁵ células NK se resuspendieron en 700 ULS de Nkem y 4x10 ⁵ calceína-AM células blanco manchado resuspendieron en 4 ml de Nkem para establecer el ensayo de citotoxicidad. Si se utiliza una pipeta multicanal para la siembra de las células diana mayor volumen de las células (hasta 6x10 ⁵ en 6 mL) puede ser necesaria en función del tamaño de la cuenca media que se utiliza. También el número recomendado de las células NK son específicamente para el E: T ratios muestran en el protocolo, para el uso de mayor E: T ratios aumentoel número de células NK por ml en consecuencia (por ejemplo, para una E 40:1: índice T 4x10 utilizar ⁶ células / ml)

NOTA 6. Se recomienda realizar un preliminar calceína-AM de carga de la valoración de la línea celular de destino de su elección, con las siguientes diluciones de 1:500, 1:400. 1:300, 1:200 y 1:100 para lograr la diferencia óptima entre la liberación máxima y espontánea.

NOTA 7. Cuando se utiliza una línea de células adherentes como objetivo, en primer lugar preparar la suspensión de células individuales usando no enzimática celular tampón de disociación. Si se realiza la ADCC, prepare un tubo de duplicados de las células diana en el CAM-medios de comunicación.

NOTA 8 Si se realiza la ADCC, añadir mismas células NK a tres pozos correspondientes a 10:1 E:. T para la ADCC. Repita este procedimiento para otros donantes. Repita el procedimiento para las células diana adicionales.

NOTA 9. Si se realiza un experimento ADCC, después de 45 minutos de carga calceína, añadir 10ug de anticuerpos específicos para inducir ADCC contra las células diana. Después de 15 minutos, lavar las células diana en medio completo dos veces, la centrifugación durante 5 min a 1200 rpm. Resuspender las células en el 1x10 ⁵ células / ml y proceder con el siguiente paso en el protocolo.

6. Los resultados representativos

Figura 2. Cuando la expansión se realiza según el esquema descrito anteriormente, utilizando 5x106 PBMC como material de partida, típica de las células NK gama rendimientos de 1x10 ⁹ al ¹⁰ 10 células (variabilidad dependientes de los donantes). La figura muestra la expansión de células NK veces (n = 19) en comparación con las células NK presentes en el producto original (media + / - cuartil).

Figura 3. La ampliación de las células NK expresan diferentes receptores de células NK que son comparables a los dilatar las células NK primaria, con algunas excepciones (CD11b, CD160 y CD244).

Figura 4. PBMCs recuperación de la capa leucocitaria es dependiente de los donantes y puede variar de ⁶ a 300x10 800x10 ^6. Las células NK pueden comprender un 2% - 18% de las PBMC. Para la purificación de las células RosetteSep ampliado, la recuperación de las células NK pura en el día 14 oscila entre 40-70%. Siguiendo el protocolo recomendado de la expansión y la purificación, la pureza de las células NK de 99% se puede esperar.

Figura 5. Ampliado las células NK han demostrado citotoxicidad frente a una serie de líneas de células tumorales, incluyendo neuroblastoma, AML, el osteosarcoma y el melanoma (representante de la matanza LMA muestra como la lisis por ciento específicas).

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
	Anticuerpo	Volumen por prueba	Empresa	Número de catálogo
Un tubo	FITC isotipo FITC isotipo FITC isotipo FITC isotipo Tampón FACS Volumen Total	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen	555748 555749 557224 340442
Tubo 2	CD56 FITC NKp30 PE NKp44 PE NKp46 PE CD3 PE-Cy5 CD16 Alexa 647 Tampón FACS Volumen Total	5 5 5 5 5 5 70 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen	340410 558407 558563 557991 555341 557710
Tubo 3	CD56 FITC KIR2DL1 PE KIR2DL2 / 3 PE KIR3DL1 PE CD3 PE-Cy5 NKG2D APC Tampón FACS Volumen Total	5 5 5 5 5 5 70 100	BD Pharmingen R & D Systems Miltenyi Biotec R & D Systems BD Pharmingen BD Pharmingen	340410 FAB1844P 130-092-618 FAB12251P 555341 558071
Tubo de 4	CD56 FITC CD11b PE CD3 PE-Cy5 APC CD27 Tampón FACS Volumen Total	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen	340410 555388 555341 558664
Tubo 5	CD56 FITC CD266 (DNAM-1) PE CD3 PE-Cy5 CD160 Alexa647 Tampón FACS Volumen Total	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences	340410 559789 555341 51-1609-42
Tubo de 6	CD56 FITC CD244 (2B4) PE CD3 PE-Cy5 CD197 (CCR7) APC Tampón FACS Volumen Total	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences	340410 550816 555341 17-1979-42