פוליאתילן גליקול יעיל (PEG) מתווכת טרנספורמציה של מוס Physcomitrella patens</em

Summary

שיטה פשוטה ויעילה להפוך Physcomitrella pantens Protoplasts מתואר. שיטה זו מותאמת פרוטוקולים Physocmitrella Protonemal protoplast ו ארבידופסיס Protoplast mesophyll שינוי ¹.

Abstract

Protocol

1. ביצוע Protoplasts

1. הוסף 9 מ"ל של 8% מניטול כדי בצלחת פטרי.
2. בעזרת מרית, את האזוב בן 7 יום 2-3 PPNH4 צלחות של 5 - ב mannitol את צלחת פטרי המכילה.
3. הוסף 3 מ"ל של Driselase 2% (Sigma D9515-25 גרם) כדי בצלחת פטרי.
4. דגירה צלחת פטרי בטמפרטורת החדר עם עדין רועדת במשך שעה 1.
5. סנן את ההשעיה protoplast באמצעות רשת של 100 מיקרומטר (BD פלקון 352,350).
6. ספין ההשעיה מסוננים על 250 גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant.
7. Re-להשעות את protoplasts בעדינות עם μL 500 mannitol של 8%.
8. הוסף 9.5 מ"ל mannitol 8% בצינור תרבות. ודא protoplasts תלויים לגמרי.
9. חזור על סינון מחדש ההשעיה צעדים (1.6, 1.7 ו -1.8) פעמיים נוספות.
10. קח 10 μL הפתרון protoplast ולספור את protoplasts ב hemocytometer.
11. הכפל את מספר protoplast באזור 16 מרובע על ידי 10,000 להשיג את מספר protoplasts לכל מ"ל (ראו תרשים 1).

2. טרנספורמציה

1. ספין ההשעיה protoplast ב 250 גר 'במשך 5 דקות. הסר את supernatant.
2. Re-להשעות protoplasts בפתרון MMg בריכוז של 1.6 מיליון protoplasts / mL.
3. לדגור על השעיית protoplast בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
4. הוספת 600 μL ההשעיה protoplast לתוך צינור תרבות המכיל 60 מיקרוגרם DNA. מערבולת הצינור בעדינות.
5. הוספת 700 μL של פתרון PEG / Ca לתוך תערובת protoplast / הדנ"א. מערבולת הצינור בעדינות עד לקבלת תערובת הומוגנית כולה.
6. דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
7. במהלך תקופה זו המתנה, לכסות פ.ר.מ.-B צלחות עם צלופן (80 עיגולים בקוטר מ"מ, א.א. אריזות בע"מ, בריטניה); לאפשר צלופן כדי מימה על פני צלחת דקות לפחות 5.
8. בעזרת מרית, להסיר בועות אוויר שנלכדו בין צלופן ואת צלחת.
9. לדלל את התערובת עם 3 מ"ל של תמיסת W5.
10. ספין את התערובת על 250 גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant.
11. Re-להשעות protoplasts ב 2 מ"ל נמס של פ.ר.מ.-T (לפני הוספתו protoplasts הפתרון הזה אפשר לשמור נוזלי 42 ° C). צלחת של 1 מ"ל מחדש להשעות protoplasts לכל צלחת פ.ר.מ.-B מכוסה בצלופן. לעטוף את הצלחות עם micropore (3M, בריאות). שמור על צלחות של 25 מעלות צלזיוס בתא הגידול.
12. לחלופין, ניתן protoplasts מחדש תלויה מ"ל 1 של המדיום ציפוי נוזלי מ"ל מצופה 0.5 בצלחת פ.ר.מ.-B מכוסה בצלופן. זה מאפשר התחדשות מהירה, אך מספר צמחים התחדשות נמוך.
13. תא צמיחה מוגדר עבור 16 שעות. אור 8 שעות. מחזור כהה.
14. הזז את הצלופן על הצלחת מבחר טרי 4 ימים לאחר השינוי.

3. נציג תוצאות:

דוגמה לשינוי מוצג באיור 2. ה-DNA נעשה שימוש בדוגמה זו היתה supercoiled 7.8 kb פלסמיד שנשא קלטת עמידים hygromycin. כמות protoplasts מצופה הופחת ל -50% עבור הצילום. התמונות צולמו כשבועיים לאחר הצמחים הועברו צלחות הבחירה. יעילות השינוי אינו מושפע ריכוז ה-DNA של עד 60 מיקרוגרם. ריכוזים גבוהים יותר של ה-DNA משפיעים לרעה על יעילות הטרנספורמציה. הנתונים הראו כי שיטה זו מספקת תוצאה עקבית לאורך טווח רחב של כמות ה-DNA. שיטה זו יכולה גם ליצור transformants יציב ביעילות כפי שמוצג בטבלה 1, אנו יכולים לקבל על 4 transformants יציב לכל מיקרוגרם של ה-DNA לינארית, אשר הוא הרבה יותר גבוה ממה שדווח קודם לכן ^14.

כמו כן, אנו נבחן את ההשפעה של הלם החום על יעילות הטרנספורמציה ידי הפיכת פלסמיד supercoiled נושאת גן חלבון פלואורסצנטי כסמן. הלם החום בוצע 10 דקות לאחר הדגרה בטמפרטורת החדר (בתוך שלב 2.6) על ידי דוגרים את התערובת באמבט מים C ° 45 במשך 3 דקות. התערובת הודגר בתוך אמבט מים בטמפרטורת החדר מיד לאחר הלם החום 17 דקות. תוצאות נרשמו 22 שעות לאחר השינוי. יחס transformants שהושגו עם או בלי הלם החום היו דומים מאוד (~ 25%), אך ראינו השפעה שלילית של הלם החום על הכדאיות של protoplasts (מידע לא מוצג).

באיור 1. מבט protoplasts ב hemocytometer. החלק הדרוש ספירת protoplast הוא הצביע על ידי ריבוע אדום. הערה 16 ​​ריבועים נדרש לספור protoplasts (ראה 1.11); התמונה מראה ספירה של 24 protoplasts (240,000 תאים / מ"ל).

איור 2. תמונות של 18 יום transformants בן חלוף. Protoplasts היו טרנסנוצר עם כמות המצוין של פלסמיד supercoiled. ת: 15μg; B: 30μg: C: 60μg; D: 120μg.

כמות ה-DNA (מיקרוגרם)	יעילות (tranformants / DNA מיקרוגרם)
15, supercoiled פלסמיד	120 ± 24
30, supercoiled פלסמיד	145 ± 54
60, supercoiled פלסמיד	121 ± 60
120, supercoiled פלסמיד	71 ± 38
60, לינארית פלסמיד	4 ± 1

1. טבלת טרנספורמציה יעילות בסכומים DNA שונים.

Discussion

השיטה המוצגת כאן מאפשרת שינוי ה-DNA פשוטה ועקבית לתוך protoplasts Physcomitrella patens. שיטה זו פותחה במקור עבור ארבידופסיס ^1, אבל כאן הוכיחה כי היא מבצעת היטב עם protoplasts של Physcomitrella patens, צמח פשוט שונה. לכן, בשיטה זו ניתן להחיל על מיני צמחים אחרים עם שינויים קלים. שינויים אפשריים אופטימיזציה כוללים ריכוז protoplast ב MMg, זמן הדגירה בפתרון MMg PEG ו / Ca. אנו בוחרים להשתמש DNA 60 מיקרוגרם בניסויים שגרתית שלנו, כי מספר transformants מגדילה באופן ליניארי עם ריכוז ה-DNA עד לנקודה זו (טבלה 1). אנחנו יכולים לקבל כ 7000 transformants חולף או 200 transformants יציב על מהפך 60 מיקרוגרם אחד DNA, המאפשר הקרנת ניתוח נוסף של אוכלוסייה גדולה של צמחים.

Protoplasts טרנספורמציה יכול להיות או להפיץ בינוני עם ציפוי נוזלי או פ.ר.מ.-T. למרות היעילות התחדשות נמוך כאשר בינוני ציפוי נוזלי משמש, אנו בוחרים בשיטה זו כאשר protoplasts הפכו עם פלסמידים supercoiled. ככל הראה בטבלה 1, טרנספורמציות לעשות עם ה-DNA פלסמיד supercoiled ליצור transformants רבים יותר וכך, אנחנו עדיין יכולים להשיג מספר גדול של צמחים עם בינוני ציפוי נוזלי. יתר על כן, הפצת protoplasts בינוני עם ציפוי נוזלי מאפשר התחדשות מהירה, וזה חשוב עבור ניסויים הקשורים פנוטיפים חולף, כמו RNAi להפיל ניסויים ^9,15. בנוסף העדר אגר העליון מאפשר בידוד צמח קל immunostaining ו RT-PCR ^9,15.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	מרכיב
PPNH 4	1.84 mM KH 2 PO 4 3.4 mM Ca (NO 3) 2 1 mM MgSO 4 2.72 Diammonium mM tartrate 54 מיקרומטר FeSO 4 0.7 H 2 O 9.93 מיקרומטר H 3 BO 3 1.97 מיקרומטר MnCl 0.4 2 H 2 O 0.23 מיקרומטר CoCl 0.6 2 H 2 O 0.19 מיקרומטר ZnSO 4. 7H 2 O 0.22 מיקרומטר CuSO 4. 5H 2 O 0.10 מיקרומטר Na 2 מו 4 .2 H 2 O 0.168 מיקרומטר KI הוסף אגר 0.7% עבור בינוני מוצק.
פ.ר.מ.-B	PPNH 4 עם mannitol 6% ו 0.8% אגר. הוסף 10 מ"ל 1M CaCl 2-1 L לפני שמזג צלחות.
פ.ר.מ.-T	PPNH 4 עם mannitol 6% ו -0.6% אגר. הוסף 0.5 מ"ל 1M CaCl 2-50 מ"ל לפני השימוש.
ציפוי נוזלי בינוני	PPNH 4 עם mannitol 8.5% ללא אגר. הוסף 0.5 מ"ל 1M CaCl 2-50 מ"ל לפני השימוש.
2% Driselase	הוסף 4 גרם של Driselase (Sigma D9515-25 גרם) עד 200 מ"ל של מניטול 8%. מערבבים בעדינות למשך 30 דקות. בטמפרטורת החדר, דגירה 30 דקות. ב 4 ° C, ומערבבים בעדינות במשך 5 דקות. בטמפרטורת החדר. ספין 2,500 גרם ל 10 דקות, להשליך גלולה. מסנן עם 0.22 מיקרומטר, ולאחסן קפוא כמו aliquots 10 מ"ל. להפשיר בתוך אמבט מים בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
MMg	0.4 מ 'mannitol 15 מ"מ MgCl 2 4 מ"מ MES (pH 5.7)
PEG / Ca	4 גרם PEG4000 3 מ"ל H 2 O 2.5 מ"ל 0.8 M mannitol 1 מ"ל 1M CaCl 2
W5	154 mM NaCl 125 mM CaCl 2 5 מ"מ KCl 2 מ"מ MES (pH 5.7)