모스의 효율적인 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 중재 변환 Physcomitrella patens</em

요약

변환하는 간단하고 효율적인 방법 Physcomitrella pantens protoplasts이 설명되어 있습니다. 이 방법은을 위해 프로토콜에서 적응됩니다 Physocmitrella protonemal 원형질과 Arabidopsis mesophyll의 원형질 변환 ¹.

초록

프로토콜

1. Protoplasts 만들기

1. 페트리 접시에 mannitol 8퍼센트 9 ML을 추가합니다.
2. 주걱을 사용하여 5로부터 2-3 PPNH4 접시에서 칠일 오래된 이끼를 넣어 - 페트리 접시가 포함된 mannitol 인치
3. 페트리 접시에 2 % Driselase 3 ML (시그마 D9515 - 25G)을 추가합니다.
4. 1 시간 동안 부드러운 잡고 상온에서 페트리 접시를 품어.
5. 100 μm의 메쉬 (BD 팰컨 352350)를 통해 원형질의 현탁액을 필터링합니다.
6. 5 분 250g에서 필터링된 정지를 스핀. 뜨는을 제거합니다.
7. 8 % mannitol 500 μL 매우 부드럽게 protoplasts를 다시 일시 중지합니다.
8. 문화 튜브 9.5 ML 8 % mannitol을 추가합니다. protoplasts가 완전히 정지되어 있는지 확인하십시오.
9. 여과 다시 정지 단계 (1.6, 1.7 및 1.8) 두 번 더 반복합니다.
10. 원형질 솔루션 10 μL를 가지고 hemocytometer에서 protoplasts을 계산합니다.
11. (그림 1 참조) ML 당 protoplasts의 숫자를 얻기 위해 10,000의 16 광장 지역에 원형질의 수를 곱하면됩니다.

2. 변환

1. 5 분 250g의 원형질의 정지를 스핀. 뜨는을 제거합니다.
2. 1,600,000 protoplasts / ML의 농도에서 MMG 솔루션 protoplasts를 다시 일시 중지합니다.
3. 20 분 상온에서 원형질의 현탁액을 품어.
4. 60 μg의 DNA를 포함하는 문화 튜브에 원형질의 정지 600 μL를 추가합니다. 튜브 부드럽게 소용돌이.
5. 원형질 / DNA 혼합물에 PEG / CA 솔루션을 700 μL를 추가합니다. 소용돌이는 튜브가 부드럽게 전체 혼합물은 균질 때까지.
6. 30 분 상온에서 혼합을 품어.
7. 이 대기 기간 동안, 셀로판과 PRM - B 접시 (80mm 직경의 원을, AA 포장 제한, 영국) 커버, 적어도 5 분 플레이트 표면에 수화 셀로판하실 수 있습니다.
8. 주걱으로 셀로판와 플레이트 사이에 갇혀있는 공기 방울을 제거하십시오.
9. W5 솔루션 3 ML과 혼합물을 희석.
10. 5 분 250g의 혼합물을 스핀. 뜨는을 제거합니다.
11. PRM - T의 녹은이 ML에서 다시 중지 protoplasts (이 솔루션은 42 ° C에서 액체 유지 수있는 protoplasts에 추가하기 전에). 플레이트 셀로판으로 덮여 PRM - B 플레이트마다 다시 중단 protoplasts 1 ML. Micropore (3M, 의료)와 접시를 넣어. 성장 챔버에서 25 ° C에서 접시 보관하십시오.
12. 또는, protoplasts는 액체 도금 매체와 셀로판으로 덮여 PRM - B 접시에 도금 0.5 ML 1 ML에 다시 일시 중지하실 수 있습니다. 이것은 빠른 재생이 가능하지만, 재생 공장의 수가 낮습니다.
13. 성장 챔버는 16 시간에 대해 설정됩니다. 빛 8 시간. 어두운주기.
14. 사일 변환 후 신선한 선택 접시에에 셀로판를 이동합니다.

3. 대표 결과 :

변환의 예제는 그림 2에 표시됩니다. 이 예제에 사용되는 DNA는 hygromycin 모성 카세트를 들고 플라스미드 supercoiled 7.8 킬로바이트했다. 도금 protoplasts의 양은 사진을 50 %로 축소되었다. 사진은 식물이 선택 접시로 이동했다 2 주 후에 찍은. 변환 효율은 최대 60 μg에 DNA 농도의 영향을받지 않습니다. DNA의 높은 농도는 변화의 효율성에 해로운 있습니다. 데이터는이 방법 DNA 금액의 넓은 범위에서 일관된 결과를 제공하는 것으로 나타났다. 이 방법은 또한 효과적으로 표 1에 나타난 안정적인 transformants를 생성할 수 있으며, 우리는 이전에보고했던 ^14보다 훨씬 높은 선형 DNA의 마이크로 그램 당 4 안정적인 transformants에 대해받을 수 있습니다.

우리는 또한 마커로서 형광 단백질에 대한 유전자를 운반 supercoiled 플라스미드를 변환하여 변환 효율에 열 충격의 효과를 테스트. 열 충격을 3 분 동안 45 ° C 물 목욕에있는 혼합 잠복기하여 (단계 2.6 이내) 상온 보육 후 10 분 정도 진행되었습니다. 혼합물은 17 분에 대한 열 충격 후 즉시 상온의 물을 욕조에 incubated했다. 결과는 22시간 변환 이후에 기록되었다. 함께 취득 transformants 및 열 충격없이 비율은 (~ 25 %)과 매우 유사했지만 우리는 protoplasts (데이터가 표시되지 않음)의 생존 능력에 열 충격의 부정적인 효과를 관찰했다.

그림 1. hemocytometer에서 protoplasts의보기. 원형질의 계산에 필요한 부분이 빨간색 사각형으로 표시됩니다. protoplasts를 (1.11 참조) 계산에 필요한 16 사각형을 참고하고, 이미지는 24 protoplasts의 카운트 (240000 셀 / ML)를 보여줍니다.

그림 2. 십팔일 오래된 과도 transformants 사진. Protoplasts은 트랜스되었습니다supercoiled 플라스미드의 표시 양의 형성. A : 15μg, B : 30μg, C : 60μg, D : 120μg.

DNA (μg)의 금액	효율성 (tranformants / μg의 DNA)
15, 플라스미드 supercoiled	120 ± 24
30, 플라스미드 supercoiled	145 ± 54
60, 플라스미드 supercoiled	121 ± 60
120, 플라스미드 supercoiled	71 ± 38
60, 플라스미드 선형	4 ± 1

다양한 DNA 금액에 표 1. 변환 효율.

토론

여기서 제시하는 방법은 Physcomitrella patens의 protoplasts으로 간단하고 일관된 DNA 변환이 가능합니다. 이 방법은 원래 Arabidopsis ¹ 개발하지만, 여기는 Physcomitrella patens, 간단하고 다른 식물의 protoplasts 잘 수행하는 입증되었다. 따라서,이 방법은 약간의 수정을 다른 식물 수종에 적용할 수 있습니다. 최적화에 대한 가능성이 수정은 MMG의 원형질 농도, MMG와 PEG / 칼슘 용액에 배양 시간을 포함합니다. transformants의 숫자가이 시점 (표 1)까지 D​​NA 농도와 선형 증가하기 때문에 우리는 우리의 일상적인 실험 60 μg의 DNA를 사용하도록 선택할 수 있습니다. 우리는 식물의 대규모 인구의 추가 심사 및 분석을 위해 이용할 수있는 하나의 60 μg의 DNA 변환에 약 7,000 과도 transformants 또는 200 안정적인 transformants를 얻을 수 있습니다.

변형 protoplasts은 액체 도금 매체 또는 PRM - T와 함께 중 전염 수 있습니다. 재생 효율이 액체 도금 매체를 사용하는 경우 낮은이지만 protoplasts가 supercoiled plasmids로 변환했을 때, 우리는이 방법을 선택합니다. 마찬가지로 표 1에 보였다, supercoiled 플라스미드 DNA와 함께 한 변환은 더 많은 transformants를 생성하기 때문에, 우리는 여전히 액체 도금 매체와 식물의 큰 숫자를 얻을 수 있습니다. 또한, 액체 도금 매체와 protoplasts을 전파하는 것은 실험 ^9,15를 허물고 같은 RNAi과 같은 과도 phenotypes를 관련된 실험을위한 중요합니다 빠른 재생을 허용합니다. 또한 상단 한천의 부재는 immunostaining 및 RT - PCR ^9,15 쉽게 공장 절연을 허용합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	성분
PPNH 4	1.84 MM KH 2 PO 4 3.4 MM 칼슘 (NO 3) 2 1 ㎜ MgSO 4 2.72 MM의 Diammonium의 tartrate 54 μm의 FeSO 4 0.7 H 2 O 9.93 μm의 H 3 BO 3 1.97 μm의 MnCl 2 0.4 H 2 O 0.23 μm의 CoCl 2 0.6 H 2 O 0.19 μm의 ZnSO 4. 7H 2 O 0.22 μm의 CuSO 4. 5H 2 O 0.10 μm의 나 2 무 4 0.2 H 2 O 0.168 μm의의 KI 고체 매체에 0.7 %의 한천을 추가합니다.
PRM - B	6 % mannitol과 0.8 %의 한천과 함께 PPNH 4. 접시를 따르고 전에 10 ML 1M CaCl 2-1 패를 추가합니다.
PRM - T	6 % mannitol과 0.6 %의 한천과 함께 PPNH 4. 0.5 ML 1M CaCl 사용하기 전에 2-50 ML을 추가합니다.
액체 도금 매체	한천없이 8.5 %의 mannitol과 PPNH 4. 0.5 ML 1M CaCl 사용하기 전에 2-50 ML을 추가합니다.
2 % Driselase	Driselase 4 G (시그마 D9515 - 25G) 8 % mannitol 200 ML에 추가합니다. 30 분 부드럽게 저어. 상온에서 30 분 알을 품다. 4 ° C, 5 분 부드럽게 저어. 상온에서. 펠렛을 삭제, 10 분 2천5백그램를 스핀. 10 ML aliquots 얼어붙은 0.22 μm의, 그리고 저장과 필터. 사용하기 전에 실온의 물을 욕조에 녹여.
MMG	0.4 M mannitol 15 MM MgCl 2 4 MM MES (산도 5.7)
PEG / CA	4g PEG4000 3 ML H 2 O 2.5 ML 0.8 M mannitol 1 ML 1M CaCl 2
W5	154 MM NaCl 125 MM CaCl 2 5 MM KCl 이 MM MES (산도 5.7)