שימוש בתאי גזע לשחזור עצם Perivascular

Summary

אדם בתאי גזע perivascular (PSCs) הם גזע הרומן הסלולרי בכיתה לשחזור רקמות השלד דומה בתאי גזע mesenchymal (MSCs). PSCs יכול להיות מבודד על ידי FACS (תא הקרינה מיון פעיל) מרקמת השומן רכש במהלך הליכים סטנדרטיים שאיבת שומן, בשילוב מכן עם פיגום osteoinductive להשיג היווצרות העצם In vivo.

Abstract

אדם בתאי גזע perivascular (PSCs) ניתן לבודד בכמות מספקת של רקמות רבות לצורך הנדסת רקמות השלד ^1-3. PSCs הם אוכלוסייה FACS, מיון של "pericytes" (CD146 + CD34-CD45-) ו 'תאים adventitial "(CD146-CD34 + CD45-), שכל אחד מהם דיווחנו בעבר יש מאפיינים של בתאי גזע mesenchymal. PSCs, כמו MSCs, יכולים לעבור התמיינות osteogenic, וכן להפריש בעד osteogenic ^1,2 ציטוקינים. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מדגימים את osteogenicity של PSCs במודלים של בעלי חיים שונים, כולל השתלת שריר כיס ב SCID (קשות) בשילוב immunodeficient עכברים, פגם העכבר SCID calvarial ו פגם סגמנטלי הירך (FSD) בחולדות athymic. שריר הירך מודל כיס שנועדה לבחון היווצרות העצם חוץ רחמי. פגמים Calvarial מרוכזים על העצם הקודקודית והם standardly 4 מ"מ קוטר (בגודל אנוש) ^8. FSDs הם bicortical והם התייצבו עםבר פוליאתילן ^ו-K-4 חוטים. FSD תיאר גם פגם לגודל קריטי, אשר אינו משמעותי לרפא על ⁴ משלו. לעומת זאת, אם בתאי גזע או גורמי גדילה נוספים לאתר את הפגם, התחדשות העצם משמעותי יכול להיות מוערך. המטרה הכללית של xenografting PSC היא להפגין את היכולת osteogenic מסוג זה תא מודלים התחדשות הן מחוץ לרחם ו orthotopic העצם.

Protocol

1. גזע Perivascular תא בידוד

זה מתואר בפרטים על "טיהור גזע תאים Perivascular של רקמה אנושית השומן הלבן" סמוך המאמר, על ידי מ Corselli et al.

2. פיגום הבריאה

1. פיגומים הם מחוייט לפי הפרוטוקול שפורסם קודם לכן פולי (לקטית, חומצה גליקולית שותף) (PLGA, Burmingham פולימר) עם ציפוי hydroxyapatite ^4-6. אפטיט מצופים פיגומים PLGA מיוצרים מ 85/15 PLGA ידי יציקת ממס תהליך שטיפת חלקיקים. פיגומים נוצרים בצורה כדורית (2 מ"מ קוטר) להשתלה שריר כיס, צורה discoid (4 מ"מ קוטר) להשתלה calvarial, או גלילית (4 מ"מ קוטר, 6 מ"מ אורך) על פגמים המגזרי הירך.
2. בקצרה, PLGA / כלורופורם פתרונות מעורבב עם סוכרוז (פולימר / יחס סוכרוז 5/95, W / W) נוצקו לתוך התבנית 200-300 מיקרומטר, טפלון בקוטר ליצור את מחוייט חסרונותtruct. לאחר ההקפאה ייבוש לילה, פיגומים יוסרו עובש טפלון שקוע DDH ₂ O לפרק סוכרוז. פיגומים הם לחטא על ידי טבילה באתנול 70% למשך 30 דקות, ואחריה שלוש שטיפות של DDH ₂ א '
3. לציפוי אפטיט, פתרון מדומה נוזל (SBF) הגוף שהוכן על ידי המסת ברצף CaCl _2, MgCl2 • 6 שעות ₂ O, NaHCO _3, ו-K ₂ HPO ₄ • 3H ₂ O ב DDH ₂ א ' פתרון ה-pH יורדת ל 6 על ידי הוספת חומצת מלח 1M להגדיל את מסיסות. Na ₂ SO _4, KCl ו NaCl מתווספים ו pH הסופי מותאם 6.5 (SBF 1).
4. Mg2 + ו HCO ₃ - חינם SBF (SBF 2) מכינים על ידי הוספת CaCl ₂ ו - K ₂ HPO ₄ • 3H ₂ O ב DDH ₂ O ו-pH יורדת ל 6. KCl ו NaCl מתווספים ו pH הסופי מותאם 6.8. פתרונות כרגע סטרילי הסתנן membr 0.22 מיקרומטר PESane (Nalgene). בסמוך לפני תהליך הציפוי, פיגומים את מיובשים PLGA כפופים הפרשות זוהר ארגון פלזמה תחריט (Harrick מדעי) כדי לשפר את הרטבת ואחידות ציפוי.
5. פיגומים חרוט מודגרת מכן עבור 12 שעות ב SBF 1 ושינה את Mg2 + ו HCO ₃ - 2 SBF חינם עבור 12 שעות נוספת ב 37 מעלות צלזיוס מתחת ערבוב עדין. פיגומים מצופה נשטפים עם DDH ₂ O להסיר עודפי יונים ו lyophilized לקראת מחקרים נוספים.

3. פאוץ שריר דגם השרשה

1. 100 μl של השעיה PSC ב PBS (פוספט שנאגרו מלוחים) מושמטים בעדינות על גבי השתל PLGA מבוסס כדורי מיד לפני ההשתלה. התאים כבר מראש על ידי הכנסת שכותרתו lentiviral של גחלילית בלוציפראז, כדי לאפשר מעקב על השתלת vivo הודעה. צפיפות התאים הוא 2.5 x 10 ^-5 השתל.
2. SCID (חמור immunodeficient משולב) עכברים משמשים לאחר 6 שבועות של גיל. בעלי חיים הם anesthetized משאיפת isoflurane ו premedicated עם עצירות (בדפורד Labs). לאחר הכנת בבטאדין רגיל, חתכים הבילטרלי hindlimbs נעשות (האורך ו 2 מ"מ אורך).
3. כיסים נחתכים בשרירים femoris שרירי במקביל על ידי דיסקציה קהה לציר סיבי שריר ארוך. עבור כל עכבר, שתל PLGA מבוסס עם PSCs מוכנס, ו fascia שמעל השריר לצורך איחוי עם Vicryl 5-0 (Ethicon).
4. העור נסגר הבא עם 5-0 Vicryl בדפוס subcuticular. בעלי החיים מטופלים לאחר הניתוח למשך 48 שעות ו tmp / SMX (Trimethoprim / sulfamethoxazole, קווליטסט) עם עצירות במשך 10 ימים.

4. פגם Calvarial דגם השרשה

1. לאחר הרדמה isoflurane של עכברים SCID (12-14 שבועות), השיער נחתך העור וחיטוי בבטאדין לכל פרוטוקול.
2. החתך 8 מ"מ העור נעשה לאורך תפר באמצע sagittal calvarium של העכבר. לאחר מכן, calvArial periosteum מוסר בעדינות על ידי יישום Q-עצה.
3. לאחר מכן, באמצעות יהלום מצופים פיסות מקדחה בתרגיל במהירות גבוהה שיניים, 4 מ"מ עצם פגם הקודקודית נוצר. הפגם הוא בעובי מלא - אך הטיפול הוא נלקח לא לפגוע מאטר הבסיסית דורה.
4. מחוייט PLGA מבוסס השתל עם PSCs engrafted ממוקם מכן בעדינות באתר פגם. צפיפות התאים הוא 2.5 x 10 ^-5 השתל. בסופו של דבר, העור מאוחה על ידי תפירה עם Vicryl 6-0. בעלי החיים מטופלים לאחר הניתוח למשך 48 שעות ו TMP / SMX במשך 10 ימים עם עצירות.

5. דגם עצם הירך המגזרי פגם השרשה

1. חולדות Athymic (12-14 שבועות) מורדמים תחת שאיפת isoflurane. עצם הירך הוא מצוחצח ומוכן לכל פרוטוקול סטנדרטי בבטאדין (איור 1).
2. החתך 27-30 מ"מ אורך נעשה על היבט anterolateral של עצם הירך. פיר הירך נחשף אז על ידי הפרדת לאט vastuseralis ואת שרירי femoris השרירים (איור 2).
3. על מנת למקסם את העקביות של התחדשות העצם, periosteum המכסה את הפגם הירך נמחק לחלוטין עם קטע resected הירך.
4. הצלחת פוליאתילן (אורך, 23 מ"מ, רוחב, 4 מ"מ, גובה 4 מ"מ) ממוקמת על משטח anterolateral של עצם הירך. הצלחת מכילה שישה חורים שנקדחו מראש כדי להתאים בקוטר 0.9 מ"מ חוטים הליכי קירשנר (צימר). אם ניקח צלחת כתבנית, שישה חוטים הליכי קירשנר הם קדחו דרך צלחת ושני קליפת המוח (איור 3).
5. לאחר מכן, עם להב מסור קטן נדנוד (סטרייקר, MI), 6 מ"מ באמצע diaphyseal הפגם נוצר. פגמים המגזרי מטופלים מכן על ידי החדרה של שתלים PLGA מבוססי אשר היו עמוסות תאים לפי פרוטוקול (איור 4).
6. שרירים שמעליה ו fascia סגורות עם 4-0 התפרים נספגים Vicryl להבטיח את השתל במקום, ואת העור איחוי.

6. בהערכות ב vivo

1. הערכות רדיוגרפי מבוצעות באופן אורך על ידי שני XR ברזולוציה גבוהה ברזולוציה גבוהה μCT (מיקרו טומוגרפיה ממוחשבת) ניתוח. לניתוח μCT (Skyscan 1172F), תמונות נסרקים ברזולוציה של 19.73 מיקרומטר (100 kV ו 100 mA מקור קרינה, באמצעות 0.5 מ"מ אלומיניום מסנן). התמונות מנותחות באמצעות DataViewer, Recon, CTAn, ותוכנות CTVol.
2. הדמיה ביולומינציה נעשית גם באופן סדרתי על מנת להעריך engraftment התא, כדאיות, שגשוג לכלול הגירה מחוץ לאתר את השתל. הדמיה ביולומינציה מתבצע באמצעות לומינה IVIS המכשיר השני (Caliper מדעי החיים). יציאות קלות הם לכמת באמצעות תוכנה תמונה חיים (Xenogen). תפוקת האור סך הכל נרשם פוטונים / שנייה / מ"ר ס"מ / steradian.
3. ניתוח היסטולוגית ו histomorphometric מבוצעת הנתיחה שלאחר המוות. כתמים שגרתיות המועסקים כוללים trichrome מאסון של, אנילין כחול, עמ 'entachrome, ו Picrosirius אדום. ניתוח Histomorphometric מתבצע בקלות גם עם כחול אנילין או כתמים pentachrome, בו דמוי עצם נראה כחול כהה וצהוב, בהתאמה. פיקסלים לכל השדה מופעל גבוהה מחושבים באמצעות הכלי מטה קסמים ב-Adobe Photoshop.

7. נציג תוצאות

כמו גם את הפגמים calvarial ו הירך הם קריטיים בגודל, ריפוי לא משמעותי יש לצפות ללא טיפול עם גורמי גדילה או בתאי גזע חיצוניים.

מבחינת תמרונים כירורגיים, דיסקציה כיס שרירים צריכים להיות יחד מטוסים fascial ולכן הדימום מינימלית יש נתקלו. אף על פי מודל כיס השריר מתבצע באופן בילטרלי, העכבר צריך ללכת בקלות ביום לאחר הניתוח 1. לפגם calvarial, הדימום הוא נתקל אך ניתן ספוגה Q-עצה. במשנה זהירות יש לנקוט לא לפגוע מאטר הבסיסית דורה - כמו זה יפריעעם ריפוי תקין. עבור דגם FSD, טיפול נלקח לא לפגוע בכלי הדם הגדולים, כדי לא לגרום לדימום יתר או עצב הירך כדי למנוע נזק נוירולוגי. חוטי קירשנר הם קדחו עם לחץ עדין כדי לא לפגוע בעצמות קליפת המוח בתהליך.

באיור 1. הכנה לפני הניתוח לפגם המגזרי עצם הירך (FSD) בחולדות Athymic. חולדות זכרים (12-14 שבועות) מורדמים תחת שאיפת isoflurane. עצם הירך הוא מצוחצח הכינו לפי הפרוטוקול הסטנדרטי בבטאדין.

איור 2. חשיפה כירורגית של עצם הירך הבריאה המגזרי פגם (FSD). החתך 27-30 מ"מ אורך נעשה על היבט anterolateral של עצם הירך. בצד הלטרלי של הירך הפיר חשוף לאחר מכן על ידי הפרדת lateralis vastusוזרועותיו femoris השרירים.

איור 3. קיבוע של עצם הירך הבריאה המגזרי פגם (FSD). הצלחת פוליאתילן (אורך, 23 מ"מ, רוחב, 4 מ"מ, גובה 4 מ"מ) ממוקמת על משטח anterolateral של עצם הירך. הצלחת מכילה שישה חורים שנקדחו מראש כדי להתאים בקוטר 0.9 מ"מ חוטים הליכי קירשנר. אם ניקח צלחת כתבנית, שישה חוטים הליכי קירשנר הם קדחו דרך צלחת ושני קליפת המוח. לאחר מכן, 6 מ"מ פגם באמצע diaphyseal נוצר. כאשר זה מתבצע, מחוייט הפיגום מוחדר ישירות מה בדיוק מתאים לאתר פגם (לא מוצג).

באיור 4. דוגמה של פגם Calvarial לאחר הניתוח. 4, מ"מ פגם calvarial מעגלית נוצר בעצם הקודקודית הימנית בעכברים athymic. הדמיה כאן הוא אתר פגם מושתל עםPSCs אחרי 8 שבועות לאחר הניתוח. הערה נוכחותו של עצם חדשה בתוך אתר פגם.

Discussion

הבידוד של PSCs מתוארת היטב ^1-3 במקומות אחרים, לרבות פרסום יופיטר הגיש בנפרד באופן ספציפי לטיפול פרוטוקולים PSC בידוד ושיטות. התכלית הספציפית של מאמר זה היא לתאר ולהדגים 3 פרוטוקולים PSC ביישום vivo על עצם היווצרות / התחדשות. נרתיק SCID שרירים העכבר הוא מודל המתואר בדרך כלל להיווצרות חוץ רחמי עצמות אדם ^7. קיימים הבדלים חשובים בין (פגם) מודלים מחוץ לרחם ו orthotopic של העצם, כולל אינטראקציה עם עצם paracrine יוצרי תאים מארחים ^8, כמו גם שפע של osteogenic גורמים איתות הנמצאים microenvironment פגם השלד. שני פגמים מוצגים כאן, defect8 calvarial פגם סגמנטלי הירך ^4. שניהם מתועד היטב להיות קריטי בגודל (כלומר, לא ירפא לבד).

הבדלים מעניינים קיימים בין פגמים calvarial ו הירך. ראשית,תאים: תא אינטראקציה בין PSCs xenografted ותאי אנדוגניים שונה מאוד. במונחים של פגם calvarial, PSCs אינטראקציה עם דורה מאטר הבסיס (השכבה החיצונית ביותר של קרומי המוח את), כמו גם אלה osteoblasts ותאי periosteal circumscribing באתר פגם. חשוב לציין, את האינטראקציה בין התאים המושתלים לבין osteoblasts סביב ^8, או תאים מושתלים ודורא הבסיסית (לוי et al., In press) הן קריטיות עבור בתאי גזע נורמליים בתיווך osteogenesis כדי להמשיך. במונחים של פגם סגמנטלי הירך (FSD), PSCs xenografted נחשפים התא שונה מאוד לסביבה ציטוקינים. לדוגמה, אתר FSD מורכב של תאים במח וליווי גזע mesenchymal, כמו גם endosteum, periosteum ו ארוכת עצם osteoblasts. לכאורה, בכל תא יש תגובה משלו על פשע, וכל אחד יכול להיות נייד: אינטראקציות עם התא xenografts PSC.

הבדלים ברורים אחרים הקיימים בין calvarialופגמים הירך. עצמות calvarial בתחילה להקים את התאבנות intramembranous, תוך העצמות הארוכות ליצור דרך ביניים סחוס (התאבנות endochondral). יתר על כן, תהליך המתקן לאחר פגיעה גם מחקה את מקורות התפתחותיים. לאחר FSD, היווצרות יבלות הסחוס הוא ציין, והואיל ולא ביניים הסחוס נוצר תוך פגם עצם הקודקודית. לבסוף, את המקור העוברי של הגולגולת עשוי להיות שונה מזה של העצמות הארוכות. רוב הגולגולת (כולל תאים perivascular - pericytes - באזור כל הראש) נגזר לפסגה עצבית (mesectoderm), בעוד השלד appendicular היא גזרה והמזודרם הפרקסיאלית ^9. כל ההבדלים הללו עלול לגרום הבדלים משמעותיים במונחים של תיקון PSC בתיווך העצם.

השימוש PSCs יש מספר יתרונות על פני שומן שמקורם בתאי סטרומה מסורתיים (ASCs). PSCs אינם דורשים תרבות הם האוכלוסייה מטוהרים WHI התאפרק לא כולל תאים סטרומה אחרים שאינם משתתפים - והוא יכול גם לווסת באופן שלילי - בידול osteogenic, כגון לתאי אנדותל ^10. לעומת זאת, למשל, ניתוחים משובט של ASCs מראים כי רק subpopulation מסוגלים לעבור התמיינות osteogenic במבחנה ^11. בסופו של דבר, המאמצים רקמות השלד הנדסה צפויה לשלב בתאי גזע osteocompetent (כגון PSCs) עם גורמי גדילה אקסוגניים ו הפיגום osteoconductive (כגון HA-PLGA שימוש בשיטות הנוכחיות), כדי הטובה ביותר לרפא פגמים השלד.