יציקה של כלי דם במוח העכבר למבוגרים הדמיה 3D ו ניתוח מורפולוגי

Summary

במאמר זה, אנו מציגים טכניקה פשוטה, מעשית ליציקת כלי דם במוח כי הוא קל לביצוע, יכול להיות מנוצל על התמונה עץ כלי דם של המוח עכבר מבוגר.

Abstract

דם הדמיה היא קריטית באבחון וניהול קליניים של מחלות כלי דם במוח, כגון מומים במוח arteriovenous (BAVMs). במודלים של בעלי חיים נחוצים לחקר טיפולים etiopathology ואת הפוטנציאל של מחלות כלי דם במוח. דימות vasculature בבעלי חיים גדולים יחסית קל. עם זאת, בפיתוח שיטות הדמיה של כלי מודלים המחלה Murine המוח רצוי בשל העלות והזמינות של גנטית שונה קווי העכבר. הדמיה העץ Murine כלי הדם המוחיים היא אתגר. בבני אדם ובבעלי חיים גדולים יותר, תקן הזהב להערכת angioarchitecture ב macrovascular (מוליכות) רמה רנטגן קטטר בניגוד מבוססי אנגיוגרפיה, שיטה לא מתאים מכרסמים קטנים.

במאמר זה, אנו מציגים שיטה של ​​יציקת מוחי שמייצר שלד עמיד המיטה כלי דם, כולל עורקים, ורידים, נימים, כי יכול להיות מנותח באמצעות d רביםifferent לאופנים. הליהוק השלם של microvessels cerebrovasculature של העכבר יכול להיות קשה, אך אתגרים אלה מופנים בפרוטוקול צעד אחר צעד זה. באמצעות זלוף intracardial החומר הליהוק כלי הדם, כלי כל הגוף הם casted. המוח לאחר מכן ניתן להסיר הבהיר באמצעות salicylate מתיל ממס אורגני. שלושה ממדי הדמיה של כלי הדם במוח ניתן דמיינו פשוט ובזול עם מיקרוסקופ כל brightfield קונבנציונלי או ביתור מיקרוסקופ. Cerebrovasculature casted יכול להיות גם צילמו לכמת באמצעות מיקרו טומוגרפיה ממוחשבת (CT מיקרו) ^1. בנוסף, לאחר הדמיה, המוח casted יכול להיות מוטבע פרפין לניתוח היסטולוגית.

היתרון של שיטה זו הליהוק וסקולרית לעומת טכניקות אחרות, הוא הסתגלות הרחב לכלים אנליטיים שונים, לרבות ניתוח brightfield מיקרוסקופיים, סריקת CT עקב המאפיינים radiopaqueteristic של החומר, כמו גם ניתוח היסטולוגית ו immunohistochemical. זה ניצול יעיל של רקמות יכול לחסוך את השימוש בבעלי חיים ולהפחית עלויות. הוכחנו לאחרונה יישום של שיטה זו כדי להמחיש את כלי הדם לא סדיר במודל של עכברים של BAVM מבוגר ברמה מיקרוסקופית ^2, ולספק תמונות נוספות של כלי פגום הדמיה על ידי מיקרו CT. אף על פי שיטה זו יש חסרונות ולא יכול להיות אידיאלי עבור כל סוגי הניתוחים, היא טכניקה פשוטה, מעשית זה ניתן ללמוד בקלות מיושמים באופן נרחב על הליהוק של כלי הדם של כלי הדם בכל הגוף.

Protocol

1. ניקוי דם מן vasculature

1. הרדימי עכבר בזריקה intraperitoneal של קטמין מ"ג / ק"ג עם 100 xylazine מ"ג / ק"ג 10 בדילול מלא מלוחים 0.25 מ"ל.
2. לאחר הרדמה אושרה על ידי תשובה לצבוט כף יד, שימוש במספריים לעשות חתך לרוחב החזה עם מספריים, ממש מתחת תהליך xyphoid, לחתוך דרך הסרעפת, ולחתוך בין קטע הגבי ו הגחון של בית החזה כדי לחשוף חלל בית החזה. לחשוף לב על ידי קיפול עד עצם החזה והחזה סמוך ובטוח עם hemostat. פתח את שק קרום הלב עם פינצטה כדי לחשוף את הלב.
3. הפעל את המשאבה זלוף (100mmHg לחץ) מחובר חם PBS בתוספת הפרין (5 יחידות / מ"ל) פתרון באמבט מים חמים על 37 מעלות צלזיוס, צינורות עם מחט 22 קהה מד על יצוא.
4. הכנס את המחט לתוך החדר השמאלי, קרוב לשיא של הלב. מיד לחתוך לפתוח את אטריום הזכות לאפשר יצוא דם מערכתית להמשיך שטיפה עד דם אניs הוסר מן המחזור.

2. זלוף של סוכן יציקה לתוך מערכת כלי הדם

1. הכן Microfil (תזרים טק, Inc קארבר, MA) פתרון הליהוק לכל פרוטוקול של היצרן: מערבבים 5 מ"ל של diluent MV עם 4 מ"ל של המתחם MV מסונן. הוסף 450μl (5%) של זרז (סוכן MV ריפוי). זמן הפתרון הוא עובד 20 דקות, אבל לערבב מיד לפני השימוש כדי להבטיח צמיגות תקין.
2. משיכה הליהוק פתרון סוכן לתוך מזרק 10 מ"ל, לצרף מחט קהה 20 לאמוד את המזרק ומלא מחט עם פתרון.
3. הכנס מחט לתוך החדר השמאלי דרך אותו חור המשמש הסמקה הדם. מחט Secure למקום עם מהדק hemostat על הלב.
4. הזרק סוכן פתרון הליהוק לאט לתוך החדר השמאלי על כ 3 מ"ל / דקה. לחץ עודף עלול להוביל זרימה נכונה של סוכן יציקה או קרע כלי פוטנציאליים.
5. תראה סימנים של זלוף מוצלח, כולל: ויזואליזציה של השחקניםing סוכן vasculature המעי והכבד, שינוי צבע האיבר הדיסטלי, ואת האף ושינויי צבע הלשון. להסתגל מחט ואם יש צורך להשיג זלוף תקין.

3. איסוף ועיבוד של רקמות

1. הסר את המוח ומכניסים paraformaldehyde 4% בין לילה ב 4 ° C.
2. מייבשים המוח על ידי הנחת מן paraformaldehyde ישירות EtOH מרוכז יותר ויותר בטמפרטורת החדר: 25% EtOH, 1 יום, 50% EtOH, 1 יום, 75% EtOH, 1 יום, 95% EtOH, 2 ימים, ו -100% EtOH, 2 ימים .
3. להבהיר את רקמת המוח סביב כלי הדם ידי טבילה המוח perfused ב salicylate מתיל עבור 2 ימים בטמפרטורת החדר.
4. בכלי הדם של המוח כולו הבהיר unsectioned ניתן הדמיה עם המוח שקוע salicylate מתיל תחת מיקרוסקופ לנתח (איור 1) (לייקה MZFL מיקרוסקופ השלישי, Leica Microsystems, Bannockburn, IL) או מיקרוסקופ brightfield (איור 2) (לייקה DM / LS, Leica Microsystems).
5. Reclarificationניתן לעשות זאת אם הרקמה לא מנוקה לחלוטין. מ סליצילט המוח מתיל העברה, כדי EtOH 95% 2 ימים, 100 EtOH% עבור 2 ימים, salicylate מתיל עבור 2 ימים.

4. Micro-CT או הדמיה הכנה היסטולוגית Application-רקמות

1. המוח יכול להיות צילמו באמצעות מיקרו-CT מיד לאחר הבהרה או לאחר הידרציה מחדש (איור 4).
2. כדי להכין את רקמת המוח לניתוח היסטולוגית, רעננותם המוח דרך EtOH בדילול סידורי: 100% EtOH, 1 יום, 95% EtOH, 1 יום, 75% EtOH, 1 יום, 50% EtOH, 2 ימים, 25% EtOH, 2 ימים וכן חנות PBS. המוח יכול להיות מוטבע פרפין באמצעות הליך רגיל.

5. נציג תוצאות

בעקבות הליהוק וסקולרית, cerebrovasculature ניתן לראות macroscopically על פני המוח (Fig.1A). העץ כלי דם בתוך parenchyma ניתן הבהרה בעקבות דמיינו (איור 1B). מבנה כלי הדם מפורטניתן הדמיה וניתח תחת מיקרוסקופ brightfield (איור 2), לנתח היקף (איור 3), ועם מיקרו סריקת CT (איור 4). באמצעות מיקרוסקופ brightfield, vasculature ניתן לראות מטוסים מוקד שונים ללא חתך את המוח (איור 2 א) וכן microvessels הפרט בהגדלה גבוהה יותר (איור 2 ב). תחת בהיקף לנתח, אפשר לראות את מבנה כלי הדם כולה במישור מיקוד אחת, דבר המאפשר הדמיה טובה יותר של מבנה תלת מימדי של cerebrovasculature (איור 3). תמונות שצולמו במיקרוסקופ יכול להראות לנתח מורפולוגיה כלי שיט גדולים vasculature המוח כולו, אבל חוסר הפרטים המוצגים בתמונות שצולמו במיקרוסקופ brightfield (איור 2 ב). טכניקה זו אפשרה לנו לזהות כלי סדיר במודל ניסיוני מבוגר שלנו עכבר BAVM ^2. איור 5 מציג דוגמה של כלי סדיר באותו זוהה על ידי מיקרו סריקת CT (איור 5 א) ו - מיקרוסקופ brightfield (איור 5 ב). יחד, נתונים אלה מראים כי אנו יכולים לנתח tהוא מדגם זהה עם כלי הדמיה מרובים לאחר הליהוק של כלי הדם.

באיור 1. במוח העכבר שלמים הבאים הליהוק כלי הדם. לפני (א) ולאחר בירור (ב ') על ידי salicylate מתיל ממס. כלי ניתן דמיינו בבירור על פני השטח המוח (א) ו בהליך בירור parenchyma הבאים (B).

2. איור מיקרוסקופ brightfield תמונות של המוח הבהיר casted וסקולרית. המוח ניתן הדמיה על מטוסים שונים ברמות הגדלה שונות. סולם בר 200μm (א) ו 50μm (B).

באיור 3. הביתור תמונת מיקרוסקופ על 1x מראה מבוגר כל עכבר cerebrovasculature המוח מתצוגה הגבי.

איור 4. Micro-CT סריקת תמונה של המוח המבוגר אותו כל עכבר שמוצג באיור 3 מתצוגה הגבי.

איור 5. היישום של שיטת הליהוק כלי הדם לזהות מום arteriovenous המוח. א) Micro-סריקת CT של המוח casted כלי הדם מראה מוגדל של האזור, AVM, כמו כלי סדירה האונה הימנית מתצוגה הגחון. תמונה מוגדלת של האזור (קופסה לבנה) מוצגת בצד ימין. ב) כלי סדיר דמיינו אותו תחת מיקרוסקופ brightfield בהגדלה 50x. סולם בר 50 מיקרומטר.

Discussion

אנו מדווחים כאן שיטה ליציקת cerebrovasculature של עכבר בוגר שעשויים להיות צילמו עם שיטות שונות. יישום של שיטה זו על BAVM המודל מאפשר ניתוח 3D מחלה של כלי סדיר. מחקרים עתידיים אפשריים כוללים כימות של מיקרו-CT תמונות, ניתוח היסטולוגית של רקמה, ואבחון של התקדמות מחלת כלי דם.

בעיות נפוצות נתקל והצעות

זלוף מלאה של כלי הדם במוח לא תמיד מושגת. לאחר לחץ מספיק כדי להגיע לכלי הדם דיסטלי ללא פקיעת אבי העורקים אטריום שמאלה או אתגר. כדי להתגבר על זה, להפעיל לחץ עקבי של כ 100mmHg. כמו כן, להתאים את מיקום המחט על מנת להבטיח יצוא מתאים הליהוק של סוכן אל תוך אבי העורקים. חשוב עורקי הראש אינן מוגבלות כל כך הסוכן הליהוק יכול להגיע כלי המוח. נהלים קריטי כי לתאם עם כלי קטן משופרת לכלהיתוך הם: (1) ניקוי נאות של הדם בכלי הדם מתוך: (2) סינון של הסוכן הליהוק; ו (3) מיקום המחט בזמן זריקה למלהק. יש להקפיד להימנע הזרקת הליהוק סוכן אל המבואה ריאה שמאל. חוקרים אחרים perfused בהצלחה העכבר ³ ו ^-4 cerebrovasculature עכברוש ללא שימוש נהלים נוספים. ניתוח ידניים כלי perfused Microfil counterstained עם hemotoxylin הראה 93 כלי% זלוף לומן ^5. תמיד להתעלם לחלוטין או לנקות כל כלי בא במגע עם סוכן הליהוק, כפי שיופיע לפלמר במהירות, וכלים לא יכולה לשמש בנושאים רבים. הבהרה של הרקמה הסובבת במוח העכבר יכול להיות מאתגר. לאחר טבילה salicylate מתיל, הרקמה עדיין עשויים להיראות אטום, מה שהופך הדמיה כלי הקשה. הבטחת התייבשות בירור ראוי וצריך לפתור את הבעיה הזו. הצבת ברקמת המוח על כיסא נדנדה במהלך אלכוהול מתיל sהטיפול יכול לשפר alicylate הבהרה רקמות.

החסרונות של טכניקת

המגבלות של טכניקה זו כוללים: (1) יש צורך להזריק את הפתרון למלהק מיד לאחר ערבוב זה כמו שזה יהיה לעבות במהירות לאחר זרז נוסף, (2) סוכן הליהוק ממלא כלי מוליכות גדולים בקלות, אבל זה לא למלא כלי אמין יותר, כגון arterioles (כלי התנגדות) נימים (כלי התזונתי); ו (3) זה לא בניגוד radiopaque הטוב ביותר עבור מיקרו CT הדמיה, למרות קבוצות שמעדיפים Microfil עבור מיקרו CT הדמיה ^1,6. עם זאת, בעקבות הצעות המוצע לעיל, כולל מיקום המחט תקין, עמדה הספינה ולחץ זלוף, יציקה מלאה של כלי קטן יכולה להיות מושגת. הסתגלות כלי ניתוח שונים עושה את זה סוכן כלי חשוב לניתוח מבנה מוחי, כולל במחזור עורקי וורידי, עם שונותפרספקטיבות.

יישומים של טכניקת

היתרון של שיטה זו הוא פוטנציאל היישום הרחב. צוות השחקנים ממלא את כל הכלים, כולל עורקים, ורידים, נימים של רקמה בתוך כל הגוף, כך מבנים כלי דם באיברים שונים של מינים שונים ניתן לנתח. בעבר, קבוצות אחרות השתמשו זלוף עבור ⁸ כלי גדול ⁷ וקטנים אדם, קוף ^{9, 10} כבשים, חולדה ^4,11,12, ועכבר ^3,13. אנו מציגים כעת עדות באמצעות טכניקה זו בניתוח מבנה microvessels במוח העכבר, במדינות שניהם בריאים וחולים ^2. בנוסף, ישנם פתרונות Microfil עם viscosities שונים זמינים perfuse כלי בגדלים שונים וצבעים שונים על מנת לשפר את ההדמיה של כלי לאיברים שונים. לדוגמה, אדום ניתן דמיינו בקלות parenchyma המוח חיוור, צהוב ניגודים היטב עםאדום כהה שריר הלב. יתר על כן, החומר הוא radiopaque, vasculature ניתן הדמיה עם מיקרו-CT סריקה כדי לקבל תמונה rotatable 3D. הרקמה יכול לשמש גם עבור חלקים פרפין וניתוח היסטולוגית לאחר הדמיה.

מסקנה

אנו מדגימים כאן פרוטוקול לעשות יצוק כלי הדם של כלי הדם של המוח עכבר מבוגר, אשר ניתן להתאים באמצעות מגוון של טכניקות ניתוח כדי ללמוד את המבנה המורפולוגי של cerebrovasculature. יש לנו גם סיפק עדויות ליישום שיטה זו מודל של המדינה המחלה BAVM, המיוצג על ידי כלי מוגדל צורה אסימטרית כי המחלף דם עורקי וורידי תפוצה. יש מגוון של שיטות הליהוק וסקולרית זמין. פרוטוקול פשוט אנו מספקים כאן בגבס כלי הדם עשויים לשמש ככלי לבחון את כלי הדם של המוח המבוגר העכבר באמצעות שיטות הדמיה שונות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם	חברה	מספר קטלוגי	הערות
Microfil	FlowTech, Inc	MV130	4 חודשים חיי מדף
מתיל Salicylate	פישר סיינטיפיק	O3695-500	כדי להבהיר רקמה