Casting cerebrovascolare del topo adulto per l'imaging 3D e analisi morfologica

Riepilogo

In questo articolo vi presentiamo una semplice tecnica pratica per la fusione cerebrovascolari che è facile da eseguire e possono essere utilizzati per l'immagine dell'albero vascolare del cervello di topo adulto.

Abstract

Di imaging vascolare è di fondamentale importanza nella diagnosi clinica e la gestione delle malattie cerebrovascolari, come malformazioni artero-venose cerebrali (BAVMs). Modelli animali sono necessari per lo studio delle terapie eziopatologia e le potenzialità di malattie cerebrovascolari. Imaging del sistema vascolare in animali di grandi dimensioni è relativamente facile. Tuttavia, lo sviluppo di metodi di imaging vaso di modelli murini della malattia del cervello è auspicabile a causa del costo e la disponibilità di organismi geneticamente modificati linee del mouse. Imaging del murino albero vascolare cerebrale è una sfida. Negli esseri umani e animali più grandi, il gold standard per la valutazione della angioarchitecture al macrovascolari (conduttanza) di livello è x-ray catetere contrasto a base di angiografia, un metodo non adatto per piccoli roditori.

In questo articolo, presentiamo un metodo di fusione cerebrovascolari che produce uno scheletro durevole del letto vascolare intero, comprese le arterie, vene e capillari che possono essere analizzati utilizzando molti dmodalità ifferent. Fusione completa dei microvasi della cerebrovasculature mouse può essere difficile, tuttavia, queste sfide vengono affrontate in questo step-by-step del protocollo. Attraverso la perfusione intracardial del materiale di colata vascolare, tutte le navi del corpo sono fuso. Il cervello può quindi essere rimosso e chiarito utilizzando il salicilato di metile, solventi organici. Tre immagini tridimensionali dei vasi sanguigni del cervello possono essere visualizzati e getta con qualsiasi microscopio brightfield convenzionali o microscopio da dissezione. Il cerebrovasculature fuso può essere ripreso e quantificati utilizzando micro-tomografia computerizzata (micro-CT) ^1. Inoltre, dopo essere stato fotografato, il cervello fuso possono essere inclusi in paraffina per l'analisi istologica.

Il vantaggio di questo metodo di fusione vascolare rispetto ad altre tecniche è il suo adattamento ampio per vari strumenti analitici, tra cui l'analisi microscopica campo chiaro, la TC a causa delle caratteristiche radiopacoteristic del materiale, nonché l'analisi istologica ed immunoistochimica. Questo uso efficiente di tessuto può salvare l'utilizzo degli animali e ridurre i costi. Abbiamo recentemente dimostrato applicazione di questo metodo per visualizzare i vasi sanguigni irregolari in un modello murino di BAVM adulti a livello microscopico ^2, e fornire altre immagini dei vasi malformati ripreso da micro-TC. Anche se questo metodo ha inconvenienti e non possono essere l'ideale per tutti i tipi di analisi, si tratta di una semplice tecnica pratica che può essere facilmente appreso ed ampiamente applicata al casting vascolari dei vasi sanguigni in tutto il corpo.

Protocollo

1. Compensazione del sangue da vasi

1. Anestetizzare topo mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg / kg di ketamina con 10 mg / kg xylazina diluiti in soluzione salina 0,25 ml.
2. Una volta che l'anestesia è stata confermata da alcuna risposta a un pizzico zampa, usare le forbici per fare un'incisione sul petto con le forbici appena sotto il processo xifoideo, tagliare diaframma, e tagliare tra il segmento dorsale e ventrale della gabbia toracica per esporre cavità toracica. Esporre cuore piegando fino allo sterno e della parete toracica adiacente e sicuro con hemostat. Aprire il sacco pericardico con le pinzette per esporre il cuore.
3. Accendere la pompa perfusione (100 mmHg di pressione) collegato al caldo PBS addizionato con eparina (5 unità / ml), soluzione in bagno di acqua calda a 37 ° C e il tubo con un brusco 22 gauge sul deflusso.
4. Inserire l'ago nel ventricolo sinistro, vicino all'apice del cuore. Immediatamente taglio aperto l'atrio destro per permettere deflusso arteriosa sistemica e continuare a sciacquare fino a sangue is ritirate dalla circolazione.

2. Perfusione di Casting Agent nel sistema vascolare

1. Preparare Microfil (flusso Tech, Inc. Carver, MA), soluzione di fusione per protocollo del produttore: Mescolare 5 ml di diluente MV con 4 ml di composto MV filtrata. Aggiungere 450μl (5%) di catalizzatore (induritore MV). Tempo di soluzione di lavoro è di 20 minuti, ma miscelare al momento dell'uso per garantire la corretta viscosità.
2. Prelevare fusione soluzione agente in una siringa da 10 ml, allegare un brusco ago di calibro 20 alla siringa e riempire l'ago con soluzione.
3. Inserire l'ago nel ventricolo sinistro attraverso il foro stesso usato per il lavaggio del sangue. Fissare l'ago in posizione con pinza emostatica sul cuore.
4. Iniettare agente soluzione di colata lentamente nel ventricolo sinistro di circa 3 ml / min. Pressione in eccesso può portare a errate flusso di agente di casting o di rottura serbatoio potenziale.
5. Cercare i segni di perfusione di successo, tra cui: la visualizzazione del castcomunemente in commercio, vasi intestino e fegato, scolorimento distali degli arti, e il naso e scolorimento della lingua. Regolare di nuovo l'ago, se necessario, per raggiungere la perfusione corretta.

3. Raccolta ed elaborazione del tessuto

1. Togliere il cervello e mettere in paraformaldeide 4% durante la notte a 4 ° C.
2. Disidratare cervello mettendo da paraformaldeide direttamente in EtOH sempre più concentrata a temperatura ambiente: 25% EtOH, 1 giorno, 50% EtOH, 1 giorno, 75% EtOH, 1 giorno, 95% EtOH, 2 giorni e il 100% EtOH, 2 giorni .
3. Chiarire tessuto cerebrale intorno ai vasi sanguigni immergendo il cervello perfuso in salicilato di metile per 2 giorni a temperatura ambiente.
4. Vascolarizzazione di tutto il cervello unsectioned chiarito può essere ripreso con il cervello immerso in salicilato di metile sotto un microscopio da dissezione (Fig. 1) (MZFL microscopio Leica III, Leica Microsystems, Bannockburn, IL) o microscopio campo chiaro (Fig. 2) (Leica DM / LS, Leica Microsystems).
5. Reclarificationpuò essere fatto se il tessuto non è completamente eliminato. Dal cervello salicilato di metile, il trasferimento, al 95% EtOH per 2 giorni, 100% EtOH per 2 giorni, e salicilato di metile per 2 giorni.

4. Micro-CT Imaging o istologica Application-Preparazione del tessuto

1. Il cervello può essere ripreso con micro-CT subito dopo chiarimenti o dopo il re-idratazione (Fig. 4).
2. Per preparare il tessuto cerebrale per l'analisi istologica, reidratare il cervello attraverso seriale EtOH diluito: 100% EtOH, 1 giorno, 95% EtOH, 1 giorno, 75% EtOH, 1 giorno, 50% EtOH, 2 giorni, il 25% EtOH, 2 giorni ; e conservare in PBS. Il cervello può essere quindi inclusi in paraffina utilizzando una procedura standard.

5. Rappresentante Risultati

A seguito di fusione vascolare, la cerebrovasculature può essere visto macroscopicamente sulla superficie del cervello (Fig.1a). L'albero vascolare all'interno del parenchima può essere visualizzata precisa quanto segue (Fig. 1B). La struttura dettagliata vascolarepuò essere ripreso e analizzato al microscopio campo chiaro (Fig. 2), dissezione portata (Fig. 3), e con micro-TAC (Fig. 4). Utilizzando il microscopio chiaro, il sistema vascolare può essere vista a diversi piani focali senza sezionare il cervello (Fig. 2A), così come microvasi individuali a maggiore ingrandimento (Fig. 2B). In un ambito di dissezione, si può vedere l'intera struttura vascolare in un unico piano focale, permettendo una migliore visualizzazione della struttura tridimensionale della cerebrovasculature (Fig. 3). Le immagini scattate sotto un microscopio da dissezione può mostrare morfologia grande nave e vascolarizzazione intero cervello, ma mancano i dati riportati nelle immagini scattate con la microscopia brightfield (Fig. 2B). Questa tecnica ci ha permesso di individuare i pescherecci irregolari nel nostro modello sperimentale topo adulto BAVM ^2. La Figura 5 mostra un esempio dei vasi stessi irregolari rilevate da micro-TAC (Fig. 5A) e microscopio a campo chiaro (Fig. 5B). Insieme, questi dati dimostrano che siamo in grado di analizzare tlo stesso campione con strumenti di imaging più dopo la fusione vascolare.

Figura 1. Cervello di topo intero successivo getto vascolare. Prima (A) e dopo (B) chiarificazione con salicilato di metile solvente. Le navi possono essere chiaramente visualizzate sulla superficie del cervello (A) e nella procedura di chiarificazione parenchima seguente (B).

Figura 2. Immagini al microscopio di Brightfield chiarito cerebrali vascolari fuso. Cervello può essere ripreso in diversi piani e livelli diversi di ingrandimento. Scale Bar 200μm (A) e 50 micron (B).

Figura 3. Dissezione immagine al microscopio a 1x mostrando tutta topo adulto cerebrovasculature cervello da una vista dorsale.

Figura 4. Micro-CT scansione delle immagini del cervello stesso intero topo adulto mostrato in Figura 3 da una vista dorsale.

Figura 5. Applicazione del metodo di fusione vascolare per rilevare una malformazione arterovenosa cerebrale. A) Micro-TAC del cervello fuso vascolare mostra regione allargata, irregolari AVM-come navi in ​​emisfero destro da una vista ventrale. Immagine ingrandita della regione (scatola bianca) viene mostrato sulla destra. B) Lo stesso vasi irregolari visualizzati al microscopio campo chiaro con ingrandimento 50x. Scala bar 50 micron.

Discussione

Riportiamo qui un metodo per la fusione di cerebrovasculature topo adulto che può essere ripreso con diverse modalità. L'applicazione di questo metodo al BAVM modello di malattia consente l'analisi 3D dei vasi irregolari. Potenziali futuri studi includono la quantificazione dei micro-CT immagini, analisi istologica dei tessuti, e la diagnosi di progressione della malattia vascolare.

Problemi comuni riscontrati e suggerimenti

Perfusione completa del sistema vascolare del cervello non è sempre raggiunto. Avere una pressione sufficiente a raggiungere i vasi sanguigni distale senza rompersi l'atrio sinistro e l'aorta è una sfida. Per superare questo problema, applicare una pressione costante di circa 100 mmHg. Inoltre, regolare l'ago grado di garantire deflusso appropriata di fusione agente nell'aorta. E 'importante che le arterie carotidi non si limita così l'agente di casting può raggiungere i vasi cerebrali. Procedure critiche che correlano con il miglioramento dei piccoli vasi perfusione sono: (1) adeguata compensazione del sangue dai vasi, (2) filtrazione del agente di casting, e (3) posizionamento dell'ago durante l'iniezione agente di casting. Si deve prestare attenzione per evitare l'iniezione di casting agent in atrio sinistro e del polmone. Altri ricercatori sono riusciti a perfusi del mouse ³ e ⁴ ratto cerebrovasculature senza l'utilizzo di ulteriori procedure. Analisi manuale di Microfil vasi perfusi di contrasto con hemotoxylin ha mostrato 93% nave perfusione lumen ^5. Sempre scartare o completamente pulire qualsiasi tipo di strumento che viene a contatto con l'agente di fusione in quanto dovrà polimerizzare rapidamente, e gli strumenti non possono essere utilizzati per soggetti multipli. Chiarimento del tessuto cerebrale circostante il mouse può essere impegnativo. A seguito di immersione in salicilato di metile, il tessuto può apparire opaca, rendendo difficile l'imaging nave. Assicurare adeguata disidratazione e chiarificazione dovrebbe risolvere questo problema. Posizionamento tessuto cerebrale su un bilanciere durante l'alcool metilico e di strattamento alicylate può migliorare chiarificazione dei tessuti.

Inconvenienti della Tecnica

I limiti di questa tecnica sono: (1) è necessario per iniettare la soluzione di agente di casting immediatamente dopo la miscelazione come sarà addensare rapidamente dopo il catalizzatore è aggiunto (2) l'agente di casting riempie vasi di conduttanza di grandi dimensioni facilmente, ma non affidabile riempire navi più piccole, come le arteriole (vasi di resistenza) e capillari (vasi nutritivi) e (3) non è il miglior contrasto radiopaco per la micro-TC, anche se alcuni gruppi preferiscono Microfil per la micro-TC ^1,6. Tuttavia, seguendo i suggerimenti proposti in precedenza, tra cui posizionamento dell'ago, le posizioni nave e pressione di perfusione, fusione completa di navi più piccole può essere raggiunto. L'adattabilità a vari strumenti di analisi rende questo agente di un prezioso strumento per analizzare la struttura cerebrovascolari, tra cui la circolazione arteriosa e venosa, con variprospettive.

Le applicazioni della tecnica

Il vantaggio di questo metodo è il suo potenziale applicazione ampio. Il cast riempie tutte le navi, comprese le arterie, vene e capillari di tutti i tessuti all'interno del corpo, così le strutture vascolari in molti organi di diverse specie possono essere analizzati. In precedenza, altri gruppi hanno usato questa perfusione per grandi e piccoli ^{7 8 unità} umani, scimmia ^{9, 10} pecore, ratto ^4,11,12 e mouse ^3,13. Mostriamo ora la prova di usare questa tecnica per analizzare la struttura dei microvasi nel cervello di topo, negli stati sani e malati ^2. In aggiunta, ci sono soluzioni Microfil con diverse viscosità a disposizione di perfusione vasi di diverse dimensioni e colori diversi per migliorare la visualizzazione dei vasi in vari organi. Per esempio, il rosso può essere facilmente visibili nel parenchima cerebrale pallido e giallo contrasta bene conrosso scuro miocardio. Inoltre, poiché il materiale è radiopaco, vasi può essere ripreso con micro-TC per ottenere un'immagine 3D ruotabile. Il tessuto può essere utilizzato anche per le sezioni di paraffina e l'analisi istologica dopo essere stato fotografato.

Conclusione

Si dimostra qui un protocollo per fare un cast vascolari dei vasi sanguigni del cervello di topo adulto, che può essere adattato usando una varietà di tecniche di analisi per studiare la struttura morfologica del cerebrovasculature. Abbiamo anche fornito prove per l'applicazione di questo metodo per un modello di stato di malattia BAVM, rappresentata dal allargata, i vasi di forma irregolare che il sangue arterioso al shunt da circolazione venosa. Ci sono una varietà di metodi di fusione vascolare disponibili. Il protocollo semplice forniamo qui per un cast vascolare può essere utilizzato come uno strumento per valutare la vascolarizzazione del cervello di topo adulto utilizzando varie modalità di imaging.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Note
Microfil	Flowtech, Inc.	MV130	4 mesi shelf life
Salicilato di metile	Fisher Scientific	O3695-500	per chiarire i tessuti