בידוד והתרבות של נוירונים בהיפוקמפוס מעכברים טרום לידתי

Summary

אנו מספקים פרוטוקול תרבות מטוהרים מאוד נוירונים בהיפוקמפוס של המוח עכבר טרום לידתי ללא שימוש שכבת תא גלייה מזין.

Abstract

תרבויות העיקריות של עכברוש נוירונים בהיפוקמפוס Murine נמצאים בשימוש נרחב כדי לחשוף את המנגנונים התאיים בנוירוביולוגיה. על ידי בידוד הולך וגדל נוירונים בודדים, החוקרים מסוגלים לנתח מאפיינים הקשורים בסחר נייד, מבנה נייד ולוקליזציה חלבון הפרט באמצעות מגוון של שיטות ביוכימיות. תוצאות ניסויים אלה הם קריטיים לבדיקת תיאוריות העוסקות הבסיס העצבי של הזיכרון והלמידה. עם זאת, תוצאות ברורות של צורות אלה של ניסויים מבוססות על היכולת לגדול תרבויות עצביים עם זיהום מינימלי של סוגי תאים אחרים במוח. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים בתקשורת ספציפיים המיועדים הצמיחה נוירון ו דיסקציה זהירה של הרקמה העוברית בהיפוקמפוס כדי לייעל צמיחה של נוירונים בריאים תוך מזעור סוגי תאים מזהמים (האסטרוציטים IE). עוברי רקמות העכבר ההיפוקמפוס יכול להיות קשה יותר לבודד מאשר רקמת מכרסם דומה בשל גודל המדגם עבור dissection. אנחנו מראים טכניקות הנתיחה מפורטים של ההיפוקמפוס מ גורים ביום 19 (E19) עובריים של עכברים. לאחר רקמת ההיפוקמפוס הוא מבודד, ניתוק עדין של תאים עצביים מושגת עם ריכוז מדוללת של טריפסין הפרעה מכנית נועד תאים נפרדים של רקמת חיבור, תוך מתן נזק מינימלי תאים בודדים. תיאור מפורט של איך להכין בטפי להחדרת נוזלים לשמש הפרעה כלול. צפיפות ציפוי אופטימליים ניתנים חיסונית הקרינה פרוטוקולים על מנת למקסם את תרבית תאים מוצלח. הפרוטוקול מספק שיטה מהירה (כ 2 שעות) ויעיל התרבות של תאים מרקמות העכבר בהיפוקמפוס.

Protocol

1. הגדרת לפני קציר

1. כדי לייצר גורי טרום לידתי של הקציר נוירון, לתזמן הרבייה בין עכברים בוגרים 19 ימים לפני יום של בידוד תא העצב. (C57BL / 6 עכברים הגילאים 2-8 חודשים שימשו הזדווגויות למטרות פיתוח בפרוטוקול זה). זיווג מוצלח שניתן לאשר על ידי זיהוי של תוסף הנרתיק באישור הלמות הלב הנשי, או חזותי של ההריון.
2. יום לפני בידוד תא עצב:
   1. עבור יישומים immunofluorescence, זכוכית המעיל coverslips בצלחת 24 גם עם ציפוי לאור קולגן 03:01 1, זנב עכברוש: ​​פולי-D-ליזין פתרון.
   2. עבור יישומים תרבית תאים, בגודל המתאים מעיל רקמת התרבות כלי פלסטיק עם ציפוי לאור קולגן 03:01 1, זנב עכברוש: ​​פולי-D-ליזין פתרון.
3. הנח את הצלחות שהתגלו מכסה המנוע התרבות הרקמה תחת אור UV למשך הלילה.
4. לשטוף את הצלחות עם פתרון של האנק סטרילית מלח מאזן (HBSS) לפנילשימוש. לוחות מצופים יכול להיות מלא עם HBSS ומאוחסנים עד שבוע ב 4 ° C בחושך.

2. רקמת קציר

1. עקרות תמיד גורם כאשר גדל בתרביות תאים ראשוניים, וככזה, בזהירות הגדולה ביותר צריך להיות למימוש על מנת להבטיח סביבה סטרילית ככל שניתן. עם תשומת לב קפדנית טכניקה סטרילי, דיסקציה הקציר ראשונית של רקמה עצבית עבור פרוטוקול זה ניתן להשלים מחוץ למכסה המנוע זרימה למינרית עם סיכון מינימלי של זיהום. לאחר הקציר הראשון, כל השלבים הבאים יש לבצע בתנאים סטריליים היותר בתוך מכסה המנוע דורג על תרבית תאים.
2. להרדים העכבר בהריון כ 19 ימים לאחר ההפריה על ידי עריפת ראש. שימוש בהרדמה להרדים נשים בהריון לא מומלץ כמו הרדמה ידוע כגורם התא מוות מוחי (Stratmann, et al., 2010). באמצעות מספריים הניתוח, מלקחיים סטריליות, לפתוח פתח בצד באמצע הגחון שלהעכבר כדי לחשוף לחלוטין את חלל הגוף. מכשירים ניתן לעקר באמצעות אלכוהול להבה פתוחה.
3. גורים טרום לידתי יהיה ממוקם לכיוון האחורי של חלל הגוף של העכבר וניתן לראותה בקלות ברחם. עם מלקחיים סטריליות autoclaved, פתח את הרחם ולהסיר גורים. לערוף גורים במספריים סטריליות טריים והראש במקום הוסר על גזה סטרילית תחת מיקרוסקופ לנתח. סטריליות, מכשירים autoclaved יכול להיות להבה לנקות בעזרת אלכוהול להבה פתוחה לפני ובמהלך השימוש.
4. בעזרת מספריים סטריליות או הגולגולת אזמל, הפתוח של הגור מן העורף אל האף. הליך זה יכול להסתיים בדרך כלל על ידי הוספת 1 קצה המספריים אל foramen השדרה ואז ממשיך anteriorly. מוציאים בזהירות את המוח כולו עם מלקחיים. מניחים את המוח על גזה סטרילי. באמצעות אזמל סטרילי, הסר את המוח הקטן ואת לחתוך את קו האמצע של המוח להפריד את זה לשני חצאי המוח (איור 1) .
5. להבין קטע קטן של קרומי המוח שמסביב ההיפוקמפוס עם מלקחיים סטריליות ולמשוך אותו בעדינות. למרות שזה לא הכרחי להסיר את קרומי המוח לפני לבודד את ההיפוקמפוס, הנוכחות של קרומי המוח יכולים לעשות דיסקציה של ההיפוקמפוס קשה יותר בשל הקשיחות של הקרום. בכל מקרה, ההיפוקמפוס יהיה יותר לעין לאחר קרומי המוח הוסרו. ההיפוקמפוס הוא מבנה מעוגל שמתחיל בחלק הדיסטלי של חצי הכדור ומכופפת ventrally (איור 2). כפי הפנימי, בצד הקעור, (הזנב) פונה החדר, הוא כבר חופשי. לכן, כדי לבודד את ההיפוקמפוס, צריך לחתוך לאורך הצד החיצוני קמורה. לאחר דיסקציה, בעדינות להרים את כל hippocampi עם מלקחיים רקמות סטריליים והעברת לתוך צלחת קטנה תרבות רקמות עם החמים (37 מעלות צלזיוס) HBSS תחת מכסה המנוע תרבית תאים. רקמת המוח ניתן לשלב בין מספר רב של גורים.

"> 3. רקמות דיסוציאציה

1. באמצעות רקמות אזמל סטרילי, המוח בעדינות לרכך ב 3 מ"ל של HBSS סטרילי צלחת 100 מ"מ תרבות רקמות.
2. העברת רקמות טחון ו HBSS לצינור קוני 15 מ"ל. הוסף 1.5 מ"ל של HBSS ו 0.5 מ"ל של תמיסת טריפסין 0.25% להיקף כולל של 5 מ"ל.
3. שווי בעדינות להפוך את הצינור 4-5 פעמים כדי לערבב. נסו להימנע לייצר בועות כמו ה-DNA להשתחרר רקמות מתעכל יהיה להיצמד לבועות ולגרום רקמות טחון לצוף במקום יישוב לחלק התחתון של הצינור (איור 3).
4. דגירה רקמה בהיפוקמפוס על 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, צינור היפוך לעיל כל 5 דקות.
5. אפשר רקמות להתיישב אל החלק התחתון של הצינור.
6. מוציאים בזהירות את הפתרון עודף באמצעות פיפטה סטרילית, משאיר רקמות באין מפריע בחלק התחתון של הצינור.
7. לשטוף את רקמת גלולה עם 5 מ"ל של HBSS על 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. חזור על סך של פי 3. אפשר רקמות לחלוטין להתיישבלחלק התחתון של הצינור בכל פעם לפני שתמשיך לשלב הבא הכביסה.
8. הסר את הכביסה סופית על רקמות גלולה ולהחליף עם 2 מ"ל של HBSS טריים.

4. נוירון טחינה דקה

1. לפני תחילת הפעולות טחינה דקה, תצטרך להכין מלוטשים אש בטפי להחדרת נוזלים פסטר. באמצעות צורב Bunson, החזק סטרילית 9 אינץ' פיפטה פסטר עצה (איור 4 א) בלהבה עד קוטר פתח פיפטה הוא כ 0.5 מ"מ בגודלם קצוות פתיחה פיפטה היה מעוגל מעט (איור 4 ב). אפשר פיפטה להתקרר לחלוטין לפני תחילת התהליך טחינה דקה.
2. שימוש רגיל סטרילית 9 אינץ' פיפטה פסטר, בעדינות triturate רקמה בסך הכל 7 פעמים. חלקים גדולים יותר של רקמות תקינים בשלב זה צריך להיות מותר להתיישב אל החלק התחתון של הצינור לפני המעבר לשלב הבא.
3. העברת supernatant כדי צינור טרי 50 מ"ל סטרילי חרוטי.
4. לרקמה הנותרת, להוסיף 2 מ"ל של HBSS סטריליים ו triturate בסך הכל 5 פעמים באמצעות אש מלוטש פיפטה פסטר.
5. אפשר את כל החלקים הנותרים רקמות גדולות יותר להתיישב אל החלק התחתון של הצינור ולשלב supernatant עם supernatant הקודם עבור סכום כולל של 4 תאים עצביים מ"ל הסתייגותם.

5. תא ציפוי

1. ספירת התאים הסתייגותם באמצעות hemocytometer.
2. ככלל, ברגע מספרים סלולריים נקבעו, הפחיתו 20% מן המספר הסופי לתת דין וחשבון על מוות תא שעלולה להתרחש לאחר ציפוי.
3. תאים יכולים להיות מצופה באמצעות ההמלצות הבאות:
   עבור coverslips בצלחת 24 באר - 6 x 10 ⁴ תאים / היטב מ"ל 0.5
   במשך 60 מ"מ רקמות צלחות תרבות - 4 x ^10/5 תאים הצלחת מ"ל 3
   עבור 100 מ"מ רקמות צלחות תרבות - 6 x 10 ⁶ תאים / הצלחת מ"ל 6
4. מערבבים מספרים סלולריים מתאימים עם נפח המצוין של מדיה ציפוי Neurobasal (NeurobasalMedia המכילים B27 מוסף [1 מ"ל / 50 מ"ל], 0.5 פתרון mM גלוטמין, 25 מיקרומטר גלוטמט (מר 147.13 g / mol), פניצילין (10,000 יחידות למ"ל) / סטרפטומיצין (10,000 מיקרוגרם / מ"ל) [μl 250/50 מ"ל] , 1 מ"מ HEPES (מר 238.3 g / mol), 10% תורמים מומת חום סוס סרום) ולהוסיף תאים צלחות. צלחות עיטורים בעדינות להפיץ התאים באופן שווה. HI-תורמים סרום סוס נוסף לתקשורת ציפוי להעשיר את התאים במהלך 24 השעות הראשונות של צמיחה. התאים לאחר מכן נגמל סרום וחזר הסביבה סרום, חינם על ידי הפחתת הסידורי של סרום על החלפת כל כלי התקשורת. ראוי גם לציין כי בעוד גלוטמט בריכוזים גבוהים הוא רעיל בתרביות תאים עצביים, על ריכוזים נמוכים שנוספו כאן, זה יהיה לעכב את ההתקשרות הלא תאים עצביים ^11. עם זאת, יש רק להוסיף את התקשורת ציפוי במשך 24 השעות הראשונות התרבות ולאחר מכן עזבו את כל מדיה הארוחה כדי למנוע neurotoxicity של התאים.
5. Pתחרה נוירונים 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור במשך הלילה.
6. הסר במחצית נפח התקשורת בין התאים ולהחליף אותו נפח של שהתקשורת מלבה Neurobasal (Media Neurobasal המכיל תוסף B27 [1 מ"ל / 50 מ"ל], 0.5 מ"מ פתרון גלוטמין, פניצילין (10,000 יחידות למ"ל) / סטרפטומיצין (10,000 מיקרוגרם / מ"ל) [μl 250/50 מ"ל], 1 HEPES מ"מ (מר 238.3 g / mol).
7. נוירונים יש להאכיל כל 4 ימים על ידי הסרת מחצית מן התקשורת הישנה והחלפתו נפח זהה של טרי שהתקשורת מלבה Neurobasal. תהליכים עצביים צריך להתחיל להיות מוצג יום 1 (איור 5 א) ולהיות נפוצה של יום 10 (5 ב 'איור).

6. נציג תוצאות

היכולת לצמוח התרבות תאים עצביים העיקריים הפך לחלק בלתי הכרחית של מדעי המוח. תרבויות ראשיים לאפשר החוקר לנתח מסלולים תאיים מסוימים, שינוי כימי וטיפול, היעד localization דפוסי הצמיחה בסביבה מבוקרת. רבים התהליכים האלה לנצל מתודולוגיה מתוחכמת כדי לחזות שינויים ספציפיים תגובות התא. במקרה זה, נוירונים בהיפוקמפוס משמשים ללמוד מסלולים עצביים ספציפיים יוכיח קשה, אם לא בלתי אפשרי לנתח במוח ללא פגע. הכנת אוכלוסיות הומוגניות ליד של נוירונים מאזורים מסוימים במוח היא קריטית עבור הלומדים תפקוד המוח. תופעות מולקולריים נוירונים בודדים יכולים להיות תפקיד התוויית מסלולי מסדר גבוה יותר כגון זיכרון או למידה. כמו פרוטוקול זה מניב תרבויות טהור יחסית של נוירונים בהיפוקמפוס, ללא צורך של שכבת מזין תאים גליה, הנוירונים האלה מנוצלים בקלות ללימודי immunofluorescence. עם זאת, כמו כל התרבות העיקרי של איברים המכילים סוגי תאים רבים, חלקם זיהום על ידי התאים הרצויים פחות יכול להתרחש. בבידוד של תאים עצביים, זיהום על ידי תאים גליה יכולה להיות בעיה נפוצה. גליה תאים גאפשר לאתר בקלות על להדמיה מיקרוסקופית של תרבות כמו המורפולוגיה שלהם שונה באופן משמעותי את הנוירונים היעד (איור 6). ההשפעה של זיהום תא גלייה תהיה תלויה בשימוש המתוכנן של התרבויות. אם התאים נמצאים בשימוש לבדיקה חיסונית הקרינה, זיהום גליה יכול להיות לא יותר מאשר אי נוחות כאשר מנסים לצלם נוירונים בודדים. עם זאת, אם התרבויות נוירונים הם לשמש ניתוח ביוכימי, כל זיהום משמעותי של תאים גליה יכולה לגרום לשינויים גדולים בתוצאות. דרכים להתמודדות עם זיהום תא גלייה מתוארים נוספת בדיון.

לאחר נוירונים היו מבודדים בהצלחה גדל בתרבות, 1 יישום טיפוסי היא לבחון תהליכים תאיים חיסונית הקרינה טכניקות. כמו באיור 7, אברונים, כמו המיטוכונדריה, ניתן מוכתמים באמצעות צבעים חיוניים שנוספו התקשורת והתרבות לפני לתקןation. חלבונים תאיים אנדוגניים ניתן דמיינו מתאי קבועים באמצעות תקן חיסוני הקרינה טכניקות (איור 8). ברגע תאים עצביים קבועים, נוגדנים ספציפיים עבור חלבונים בעלי עניין יכולים להיות הציג את התא אלו חלבונים ניתן דמיינו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. נוירונים בתרבית מספקים גם חוקר את האמצעים לבחון תופעות חלבון בודדים על פונקציות עצביים. שימוש במגוון טכניקות כולל transfections DNA, electroporation או התמרה ויראלית, חלבונים ניתן ביטוי יתר בתאים עצביים (איור 9). כיצד מגיבים תאים עצביים להשפעות של ביטוי יתר חלבונים יכולה להיות מסקנות ישירות על איך המוח יכול להגיב מציעה את האפשרות של זיהוי מטרות הסלולר עבור טיפולים תרופתיים. את פרטי מסוג הניסויים מעבר להיקף של מאמר זה אבל הם ממחישים כי תרבויות שהוכנו על ידי טכניקה זו מתאימים למגוון רחב של עד-Stream יישומים. עם זאת, הפשטות הכוללת של פרוטוקול זה, כמו גם, פרק הזמן הקצר שנדרש כדי להכין את תרבויות עצביים להפוך את שיטת אידיאלי לשימוש מדעי המוח של היום במעבדה.

באיור 1. Dissection של המוח העכבר טרום לידתי. החתך הראשון הוא לאורך קו האמצע של המוח מפריד אותה לשני חצאי המוח.

איור 2. מיקום של ההיפוקמפוס במוח העכבר טרום לידתי. הסטריאטום הוא זז הצידה כדי להמחיש את ההיפוקמפוס הוא ציין ידי "שעועית כליה" המבנה המעוגל סוג באזור הדיסטלי של האונה כל.

איור 3. דיסוציאציה של רקמה בהיפוקמפוס בפתרון טריפסין.

4. איור טיפים פיפטה פסטר בשימוש טחינה דקה של רקמה בהיפוקמפוס. (א) רגיל פסטר בקצה הצינורית. (ב) Fire-מלוטש פסטר בקצה הצינורית. שימו לב קצוות מעוגלים ירידה של 50% בערך בגודל הפתיחה פיפטה.

באיור 5. נוירונים בהיפוקמפוס מבודד באמצעות הליך זה מצופה ב NB מדיה. (א) תא הצמיחה 1 יום לאחר ציפוי. תהליכים עצביים מתחילים להיות גלויים במהלך יום 1. (ב) צמיחת תאים 10 יום שלאחר ציפוי, neurites הם מסועף וחופפים.

איור 6. נוירונים בהיפוקמפוס מזוהמים בתאי גלייה גדל במשך 7 ימים ו מוכתם MitoTracker סמן אברון Red CM-H2XRos (Invitrogen # M7515) ו transfected עם GFP-LC3 באמצעות Lipofectamine 2000 (Invitrogen # 11668019). המיטוכונדריה הם נראים בכל התאים, אך רק תא עצב יחיד transfected בהצלחה עם מבנה ניאון. זיהום עם מתאי גליה עושה אנליזה של ביטוי ה-GFP-LC3 בתהליכים עצביים קשה לדמיין.

איור 7. נוירונים בהיפוקמפוס גדל במשך 7 ימים ו מוכתם MitoTracker סמן אברון האדום CM-H ₂ XRos (Invitrogen # M7513). צבע חיוני זה משמש כתם המיטוכונדריה פעיל תאים בתרבית רקמה. התאים היו קבוע paraformaldehyde 4% / PBS ו דמיינו ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הצבע עצמו הוא לא פלורסנט עד חמצון במיטוכונדריה. המיטוכונדריה פעיל ניתן לראות לאורך כל התהליכים עצביים.

איור 8. נוירונים בהיפוקמפוס גדל ל -7 ימים, קבועים עם paraformaldehyde 4% / PBS ו חיסונית מוכתם נוגדן חד שבטי נגד טובולין β (Sigma # T0198). בעקבות הנוגדן העיקרי, אורגון הירוק שכותרתו עז נגד העכבר נוגדנים משני (Invitrogen # O11033) נוספה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי דמיינו.

איור 9. תרבויות נוירונים בהיפוקמפוס גדלו במשך 5 ימים transfected עם DNA-GFP LC3β לבנות באמצעות Lipofectamine 2000 (Invitrogen # 11668019). בכל יום 7, תאים נקבעו באמצעות paraformaldehyde 4% / PBS ו aggresomes עם LC3β GFP מתויג שולבו הממברנה החיצונית שלהם היו דמיינו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. Aggresomes נמצאים בכל הגוף התא neurites ו מסומנים בחיצים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

תרבויות בהיפוקמפוס נעשה שימוש בביולוגיה מולקולרית של יותר מ -20 שנה. אמנם באופן עקרוני, תרבויות עצביים יכול להתבצע מכל חלק של המוח, בהיפוקמפוס תרבויות הוכיחו להיות פופולרי ביותר בשל הארכיטקטורה הפשוטה יחסית של האוכלוסייה תא העצב בהיפוקמפוס ^7. תרבויות בהיפוקמפו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	מוכר	מספר קטלוגי
זנב עכברוש קולגן 1	BD Biosciences	354236
פולי-D-ליזין פתרון	Chemicon	A-003-E
הנקס תמיסת מלח מאוזן	Invitrogen	14175-095
טריפסין פתרון (1X) 0.25%, נוזל	Invitrogen	15050-065
בינוני NeuroBasal (1X) נוזלי	Invitrogen	21103-049
B27 מוסף (50X) נוזלי	Invitrogen	17504-044
L-גלוטמין 200 מ"מ (100x) נוזלי	Invitrogen	25030-149
פניצילין (10,000 יחידות למ"ל) / סטרפטומיצין (10,000 מיקרוגרם / מ"ל)	Invitrogen	15140-148
HI-תורמים סוס סרום	אטלנטה ביולוגיות	S12150H