Isolamento e la coltura di neuroni ippocampali da topi prenatali

Riepilogo

Forniamo un protocollo per la coltura di neuroni dell'ippocampo altamente purificato da cervelli dei topi prenatale senza l'uso di uno strato di cellule gliali alimentatore.

Abstract

Culture primarie di ratto e murina neuroni ippocampali sono ampiamente utilizzati per rivelare meccanismi cellulari in neurobiologia. Isolando e crescente singoli neuroni, i ricercatori sono in grado di analizzare le proprietà relative al traffico cellulare, la struttura cellulare e localizzazione singola proteina utilizzando una varietà di tecniche biochimiche. I risultati di tali esperimenti sono fondamentali per testare le teorie riguardanti la base neurale della memoria e dell'apprendimento. Tuttavia, risultati inequivocabili di queste forme di esperimenti si basano sulla capacità di crescere colture neuronali con minima contaminazione da altri tipi di cellule cerebrali. In questo protocollo, si usa mezzi specifici per la crescita dei neuroni e dissezione attenta di tessuto embrionale ippocampale per ottimizzare la crescita dei neuroni sani minimizzando tipi cellulari contaminanti astrociti (cioè). Tessuti embrionali del mouse ippocampale può essere più difficile da isolare rispetto al tessuto roditori simili a causa delle dimensioni del campione per dissection. Mostriamo tecniche di dissezione dettagliata dei dell'ippocampo dal embrionali cuccioli di topo al giorno 19 (E19). Una volta che il tessuto dell'ippocampo è isolato, dissociazione dolce delle cellule neuronali si ottiene con una concentrazione diluita di tripsina e distruzione meccanica progettati per separare le cellule dal tessuto connettivo, fornendo minimo danneggiamento singole celle. Una descrizione dettagliata di come preparare pipette da utilizzare nella interruzione è inclusa. Placcatura densità ottimali sono previste per immuno-fluorescenza protocolli per massimizzare la cultura di successo cellulare. Il protocollo prevede una tecnica veloce (circa 2 ore) ed efficiente per la coltura di cellule neuronali di topo tessuto dell'ippocampo.

Protocollo

1. Set-up prima del raccolto

1. Per generare cuccioli prenatali per la raccolta dei neuroni, pianificare allevamento topi adulti tra 19 giorni prima del giorno di isolamento dei neuroni. (C57BL / 6 topi età 2-8 mesi sono stati utilizzati accoppiamenti ai fini dello sviluppo di questo protocollo). Accoppiamento di successo può essere confermata dalla presenza di un tappo vaginale nella conferma femminile, palpitazioni o visiva di gravidanza.
2. Il giorno prima dell'isolamento neurone:
   1. Per le applicazioni di immunofluorescenza, vetro coprioggetti cappotto in piastra da 24 pozzetti con un leggero strato di 3:1 collagene 1, coda di topo: poly-D-lisina soluzione.
   2. Per le applicazioni di colture cellulari, cappotto adeguato tessuto dimensioni ware cultura di plastica con un leggero strato di 3:1 collagene 1, coda di topo: poly-D-lisina soluzione.
3. Appoggiare le piastre scoperti in una cappa di coltura tissutale sotto una luce UV durante la notte.
4. Lavare i piatti con la soluzione Balance Hank sterile di Salt (HBSS) primada utilizzare. Piastre rivestite possono essere riempiti con HBSS e conservato fino ad una settimana a 4 ° C al buio.

2. Tissue Harvest

1. La sterilità è sempre un fattore quando cresce colture cellulari primarie e, come tale, la massima cautela dovrebbe essere esercitata per garantire l'ambiente più sterile possibile. Con particolare attenzione alla tecnica sterile, la dissezione iniziale e la raccolta di tessuto nervoso per questo protocollo può essere completato al di fuori di una cappa a flusso laminare con il minimo rischio di contaminazione. Dopo la raccolta iniziale, tutti i passi successivi devono essere condotte in condizioni di massima sterilità all'interno di una cappa di nominale per la coltura cellulare.
2. Eutanasia di un mouse incinta dopo circa 19 giorni dopo la fecondazione per decapitazione. L'uso di anestesia per l'eutanasia la femmina incinta non è raccomandato in quanto l'anestesia è noto per provocare la morte delle cellule cerebrali (Stratmann, et al., 2010). Uso sterili forbici dissezione e pinze, creare un'apertura nella metà ventrale latomouse per rivelare completamente cavità corporea. Gli strumenti possono essere sterilizzati con alcol e una fiamma libera.
3. Cuccioli prenatale sarà situato verso la parte posteriore della cavità corporea del topo e devono essere facilmente visibili nell'utero. Con autoclave pinze sterili, aprire l'utero e togliere cuccioli. Decapitare cuccioli con freschi forbici sterili e la testa luogo rimosso su garza sterile sotto un microscopio da dissezione. Gli strumenti sterili autoclave può essere fiamma pulita con alcol e fiamme libere prima e durante l'uso.
4. Con forbici o bisturi sterili, cranio aperto di cucciolo dal retro del collo al naso. Questa procedura può normalmente essere completata con l'inserimento di una punta delle forbici nel forame vertebrale e quindi procedere anteriormente. Rimuovere con attenzione l'intero cervello con una pinza. Mettere il cervello su garza sterile. Usando un bisturi sterile, rimuovere il cervelletto e incidere lungo la linea mediana del cervello per separare in due emisferi (figura 1) .
5. Afferrare una piccola sezione di meningi che circondano l'ippocampo con una pinza sterile e tirare dolcemente. Sebbene non sia strettamente necessario rimuovere le meningi prima isolare l'ippocampo, la presenza delle meningi può rendere la dissezione dell'ippocampo più difficile a causa della durezza della membrana. In entrambi i casi, l'ippocampo sarà più chiaramente visibile dopo le meningi sono stati rimossi. L'ippocampo è una struttura curva che inizia nella parte distale del dell'emisfero e piega ventrale (Figura 2). Come quella interna, concava, lato (caudale) sta affrontando un ventricolo, è già libero. Pertanto, per isolare l'ippocampo, bisogna tagliare lungo il lato esterno convesso. Dopo la dissezione, sollevare delicatamente con le pinze ogni ippocampi tessuti sterili e il trasferimento in un piccolo piatto coltura tissutale con riscaldate (37 ° C) HBSS sotto una cappa di coltura cellulare. Tessuto cerebrale possono essere combinati da cuccioli multipli.

"> 3. Tissue dissociazione

1. Usando un bisturi sterile, tessuto cerebrale delicatamente tritare in 3 ml di HBSS sterili in un piatto 100 Tissue Culture mm.
2. Trasferire il tessuto tritato e HBSS ad un tubo da 15 ml. Aggiungere 1,5 ml di HBSS e 0,5 ml di soluzione di tripsina 0,25% a un volume totale di 5 ml.
3. Cap e capovolgere delicatamente il tubo 4-5 volte per mescolare. Prova per evitare di produrre bolle come DNA liberato dal tessuto digerito aderiranno le bolle e causare il tessuto macinate a galleggiare invece di regolare al fondo della provetta (Figura 3).
4. Incubare tessuto dell'ippocampo a 37 ° C per 15 minuti, invertendo tubo come sopra ogni 5 minuti.
5. Lasciare il tessuto di depositarsi sul fondo della provetta.
6. Accuratamente rimuovere la soluzione in eccesso con una pipetta sterile, lasciando tessuto indisturbato sul fondo del tubo.
7. Lavare tessuto pellet con 5 ml di HBSS a 37 ° C per 5 minuti. Ripetere per un totale di 3 volte. Lasciare tessuto si depositino completamenteal fondo della provetta ogni volta prima di procedere alla fase di lavaggio successivo.
8. Rimuovere il lavaggio finale dal tessuto pellet e sostituirlo con 2 ml di HBSS freschi.

4. Neuron Triturazione

1. Prima di iniziare passi triturazione, è necessario preparare fuoco lucido pipette Pasteur. Utilizzando un bruciatore Bunson, tenere una sterile 9 pollici punta di pipetta Pasteur (figura 4a) nella fiamma fino diametro dell'apertura pipetta è circa 0,5 mm di dimensioni e bordi dell'apertura pipetta sono state leggermente arrotondati (figura 4b). Lasciare raffreddare completamente pipetta prima di iniziare il processo di triturazione.
2. Utilizzando una normale sterile da 9 pollici pipetta Pasteur, delicatamente triturare il tessuto per un totale di 7 volte. Pezzi di tessuto più grandi sono normali a questo punto e dovrebbe essere consentito di depositarsi sul fondo del tubo prima di passare alla fase successiva.
3. Trasferire il supernatante in una nuova sterile tubo da 50 ml.
4. Per il tessuto rimanente, aggiungere 2 ml di HBSS sterili e triturare un totale di 5 volte utilizzando il lucido fuoco pipetta Pasteur.
5. Consentire tutti i pezzi rimanenti tessuto grandi di depositarsi sul fondo della provetta e combinare surnatante con il supernatante precedente per un totale di 4 ml di cellule dissociate neuronali.

5. Cella Placcatura

1. Contare le cellule dissociate utilizzando un emocitometro.
2. Come regola generale, una volta che il numero delle cellule sono stati determinati, sottrarre il 20% da quel numero finale per tenere conto di morte cellulare che può verificarsi dopo placcatura.
3. Le celle possono essere placcati con le seguenti raccomandazioni:
   Per coprioggetti in una ben piastra da 24 - 6 x 10 ⁴ cellule / pozzetto in 0,5 ml
   Per piastre 60 mm coltura dei tessuti - 4 x 10 ⁵ cellule / piastra in 3 ml
   Per 100 piastre tessuto Cultura - 6 mm x 10 ⁶ cellule / piastra in 6 ml
4. Mescolare il numero di cellule appropriate con il volume indicato di terreni in piastra Neurobasal (NeurobasalSupporti contenenti B27 Supplement [1 ml / 50 ml], 0,5 mM glutammina Solution, 25 pM glutammato (Mr 147,13 g / mol), penicillina (10.000 unità / ml) / streptomicina (10.000 pg / ml) [250 microlitri / ml 50] , 1mM HEPES (Mr 238,3 g / mol), il 10% dei donatori Horse inattivato al calore, Siero) e aggiungere celle a piastre. Piastre Agitare delicatamente per distribuire le cellule in modo uniforme. HI-Horse di siero viene aggiunto ai terreni in piastra per arricchire le cellule durante le prime 24 ore di crescita. Le cellule sono poi svezzati dal siero e restituiti ad un ambiente privo di siero per riduzione di serie del siero ad ogni sostituzione dei supporti. Va inoltre notato che mentre a concentrazioni più elevate glutammato è tossico per le colture di cellule neuronali, alle concentrazioni più basse aggiunte qui, si inibisce l'attacco di cellule non neuronali ^11. Tuttavia, dovrebbe essere aggiunto ai terreni in piastra per le prime 24 ore di coltura e successivamente lasciato su eventuali mezzi di alimentazione per impedire neurotossicità delle cellule.
5. Ppizzo neuroni a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore notte.
6. Rimuovere metà del volume dei mezzi dalle cellule e sostituirlo con un volume uguale di alimentazione dei supporti Neurobasal (Media Neurobasal contenente B27 Supplement [1 ml / 50 ml], 0,5 mM glutammina Solution, penicillina (10.000 unità / ml) / streptomicina (10.000 pg / ml) [250 microlitri / ml 50], 1 mM HEPES (Mr 238,3 g / mol).
7. I neuroni devono essere alimentati ogni 4 giorni rimuovendo metà dei vecchi media e la sua sostituzione con lo stesso volume di alimentazione dei supporti Neurobasal freschi. Processi neuronali dovrebbe iniziare a essere visibile il giorno 1 (figura 5a) e diventare prevalente by Day 10 (figura 5b).

6. Risultati rappresentativi

La capacità di crescere e cultura primarie cellule neuronali è diventato una parte indispensabile della neuroscienza. Colture primarie consentono al ricercatore di analizzare le specifiche vie cellulari, modificazione chimica e del trattamento, target loczazione e modelli di crescita in un ambiente controllato. Molte di queste procedure utilizzano una sofisticata metodologia di visualizzare le modifiche specifiche risposte cellulari. In questo caso, neuroni dell'ippocampo sono utilizzati per studiare specifici percorsi neuronali che risulterebbe difficile, se non impossibile analizzare nel cervello intatto. Preparazione del vicino popolazioni omogenee di neuroni dalle aree specifiche del cervello è critico per studiare la funzione cerebrale. Effetti molecolari in singoli neuroni possono essere determinanti per delineare percorsi di ordine superiore come la memoria o l'apprendimento. Poiché questo protocollo produce colture relativamente puri di neuroni dell'ippocampo, senza la necessità di uno strato alimentatore di cellule gliali, questi neuroni sono facilmente utilizzati per studi di immunofluorescenza. Tuttavia, come con tutta la cultura primaria da organi che contengono più tipi di cellule, certo livello di contaminazione da cellule meno desiderati possono verificarsi. In isolamento di cellule neuronali, cellule gliali di contaminazione può essere un problema comune. Le cellule gliali cuno essere facilmente individuati sulla visualizzazione microscopica della coltura come loro morfologia differenze significative rispetto ai neuroni bersaglio (Figura 6). L'impatto di contaminazione cellule gliali dipenderà previsto impiego delle culture. Se le cellule vengono utilizzate per l'esame immuno-fluorescenza, la contaminazione gliale può essere niente più che un inconveniente quando si cerca di fotografare i singoli neuroni. Tuttavia, se le colture neuronali sono da utilizzare per l'analisi biochimica, eccessiva contaminazione da parte delle cellule gliali potrebbe causare cambiamenti rilevanti nei risultati. Modi per affrontare la contaminazione delle cellule gliali sono illustrate ulteriormente la discussione.

Una volta che i neuroni sono state isolate con successo e crescere in coltura, una tipica applicazione è quello di esaminare i processi cellulari immuno-fluorescenza tecniche. Come illustrato nella figura 7, organelli, come i mitocondri, possono essere colorate usando coloranti vitali aggiunto ai terreni di coltura prima di fissarezione. Endogeni proteine ​​cellulari può essere visualizzato da cellule fisse utilizzando le normali tecniche di immuno-fluorescenza (Figura 8). Una volta che le cellule neuronali sono fissate, anticorpi specifici per proteine ​​di interesse possono essere introdotti nelle cellule e queste proteine ​​possono essere visualizzati utilizzando un microscopio a fluorescenza. Colture di neuroni anche fornire al ricercatore i mezzi per esaminare gli effetti delle proteine ​​individuali sulle funzioni neuronali. Utilizzando una varietà di tecniche comprendenti transfezione del DNA, elettroporazione o trasduzione virale, proteine ​​possono essere sovraespressa in cellule neuronali (Figura 9). Come neurale cellule rispondono agli effetti di un eccesso di proteine ​​espresse da può avere conseguenze dirette su come il cervello può rispondere e offre la possibilità di individuare bersagli cellulari per trattamenti farmacologici. I dettagli di questi tipi di esperimenti vanno oltre lo scopo di questo lavoro, ma non dimostrano che le culture preparate da questa tecnica sono adatti per una vasta gamma di down-stream applicazioni. Tuttavia, la semplicità generale di questo protocollo, così come il breve periodo di tempo necessario per preparare queste culture neuronali fanno di questo un metodo ideale per l'impiego in laboratorio di neuroscienze di oggi.

Figura 1. Dissezione del cervello di topo prenatale. La prima incisione è lungo la linea mediana del cervello che lo separa in due emisferi.

Figura 2. Posizione dell'ippocampo del cervello di topo prenatale. Il corpo striato viene spostato da parte per visualizzare l'ippocampo e si nota dalla curva struttura "fagiolo" tipo nella regione distale di ciascun emisfero.

Figura 3. Dissociazione del tessuto dell'ippocampo in soluzione di tripsina.

Figura 4. Pasteur puntali utilizzato in triturazione del tessuto ippocampale. (A) normale punta di pipetta Pasteur. (B) Fire-lucida punta di pipetta Pasteur. Prendere nota dei bordi arrotondati e la diminuzione di circa il 50% nelle dimensioni di apertura pipette.

Figura 5. Neuroni dell'ippocampo isolato utilizzando questa procedura e placcato in NB Media. (A) La crescita cellulare 1 giorno post-placcatura. Processi neuronali cominciano ad essere visibili nel corso del Giorno 1. (B) La crescita cellulare 10 giorni post-placcatura, neuriti sono ramificate e sovrapposizioni.

Figura 6. Neuroni dell'ippocampo contaminate da cellule gliali coltivate per 7 giorni e colorati con il pennarello organello MitoTracker Red CM-H2XRos (Invitrogen # M7515) e transfected con GFP-LC3 con Lipofectamine 2000 (Invitrogen # 11668019). I mitocondri sono visibili in tutte le cellule però solo un singolo neurone è successo trasfettate con il costrutto fluorescente. La contaminazione con cellule gliali fa l'analisi di GFP-LC3 espressione nei processi neuronali difficili da visualizzare.

Figura 7. Neuroni dell'ippocampo cresciuta per 7 giorni e colorati con il pennarello organello MitoTracker Red CM-H ₂ Xros (Invitrogen # M7513). Questo colorante vitale viene utilizzato per colorare mitocondri attivi in ​​cellule di coltura dei tessuti. Le cellule sono state fissate in paraformaldeide al 4% / PBS e visualizzati mediante microscopia a fluorescenza. Lo stesso colorante è non fluorescente fino ossidato nei mitocondri. Mitocondri attivi può essere visto in tutti i processi neuronali.

Figura 8. neuroni dell'ippocampo destinati alla produzione di 7 giorni, fissate con paraformaldeide al 4% / PBS e immuno-colorati con anticorpo monoclonale anti-anticorpo β tubulina (Sigma # T0198). A seguito di anticorpo primario, Oregon verde marcato di capra anti-topo secondario (Invitrogen # O11033) sono stati aggiunti e visualizzati mediante microscopia a fluorescenza.

Figura 9. Colture ippocampali neuronali sono stati coltivati ​​per 5 giorni e transfettate con GFP-LC3β costrutto di DNA usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen # 11.668.019). Al 7 ° giorno, le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4% / PBS e aggresomes con LC3β GFP tag incorporati nel loro membrana esterna sono stati visualizzati usando la microscopia a fluorescenza. Aggresomes si trovano in tutto il corpo cellulare e neuriti e sono indicati con le frecce.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Colture di ippocampo sono stati utilizzati in biologia molecolare per oltre 20 anni. In linea di principio, colture neuronali può essere fatto da qualsiasi parte del cervello, culture dell'ippocampo hanno dimostrato di essere più popolari a causa dell'architettura relativamente semplice della popolazione di cellule nervose nell'ippocampo ^7. Culture ippocampali sono tipicamente realizzati in fase avanzata di tessuto embrionale. Questo tessuto è più facile da dissociare e contiene un minor numer...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Venditore	Numero di catalogo
Rat Tail collagene 1	BD Biosciences	354236
Poly-D-lisina Soluzione	Chemicon	A-003-E
Hanks soluzione salina bilanciata	Invitrogen	14175-095
Tripsina Solution (1X) 0,25%, liquido	Invitrogen	15050-065
NeuroBasal Medium (1X) di liquido	Invitrogen	21103-049
B27 Supplement (50X) di liquido	Invitrogen	17504-044
L-Glutammina 200 mm (100X) di liquido	Invitrogen	25030-149
Penicillina (10.000 unità / ml) / streptomicina (10.000 pg / ml)	Invitrogen	15140-148
HI-Donor siero di cavallo	Atlanta Biologicals	S12150H