ג'ל אלקטרופורזה agarose להפריד את קטעי ה-DNA

Summary

פרוטוקול בסיסי להפריד את שברי דנ"א באמצעות אלקטרופורזה agarose ג'ל מתואר.

Abstract

אלקטרופורזה agarose ג'ל הוא הדרך היעילה ביותר להפרדת קטעי ה-DNA בגדלים שונים הנעים בין BP 100-25 KB ^1. Agarose מבודד סוגים אצות Gelidium ו Gracilaria, והוא מורכב agarobiose חזר (L-ו-D-גלקטוז) יחידות משנה ^2. במהלך gelation, פולימרים agarose לקשר לא קוולנטית וליצור רשת של חבילות אשר גודל הנקבוביות לקבוע מאפיינים מולקולריים של ג'ל סנון. השימוש בג'ל אלקטרופורזה agarose מהפכה ההפרדה של ה-DNA. לפני אימוץ agarose ג'לים, ה-DNA הופרדו בעיקר באמצעות צפיפות סוכרוז שיפוע צנטריפוגה, שרק סיפק הערכה של גודל. להפריד בין ה-DNA באמצעות אלקטרופורזה agarose ג'ל, ה-DNA הוא נטען לתוך מראש יצוק בארות ג'ל ו יישומי הנוכחי. עמוד השדרה של ה-DNA פוספט (ו-RNA) הוא מולקולה טעונים שלילית, ולכן כאשר הניח שדה חשמלי, שברי דנ"א יהיה להגר עמ 'טעונה ositively האנודה. כי ה-DNA יש יחס אחיד המונית / תשלום, מולקולות ה-DNA מופרדים לפי גודל בתוך ג'ל agarose בדפוס כזה המרחק הוא ביחס הפוך יומן של משקל מולקולרי שלה ^3. הדגם המוביל של תנועת ה-DNA באמצעות ג'ל agarose הוא "מוטה reptation", לפיו החדשנית נע קדימה ומושך את שאר המולקולה יחד ^4. שיעור ההגירה של מולקולת הדנ"א דרך ג'ל נקבעת על ידי הבאות: גודל 1) של מולקולת הדנ"א, 2) ריכוז agarose; 3) קונפורמציה DNA ^5, 4) יישומית, 5) מתח נוכחות ethidium ברומיד, 6) סוג מאגר agarose ו 7) אלקטרופורזה. לאחר ההפרדה, את מולקולות ה-DNA יכול להיות דמיינו תחת אור UV לאחר מכתים עם הצבע המתאים. על ידי ביצוע בפרוטוקול זה, התלמידים צריכים להיות מסוגלים:

1. להבין את המנגנון שבאמצעותו שברי ה-DNA מופרדים בתוך מטריצת הג'ל
2. להבין כיצד קונפורמציה שלמולקולת ה-DNA תקבע הניידות שלה באמצעות מטריצת הג'ל
3. זהה את הפתרון agarose הריכוז המתאים לצרכיהם
4. הכן ג'ל agarose על אלקטרופורזה של דגימות דנ"א
5. הגדרת ג'ל אלקטרופורזה מנגנון אספקת החשמל
6. בחר המתח המתאים להפריד את שברי ה-DNA
7. להבין את המנגנון שבאמצעותו ברומיד ethidium מאפשר הדמיה של להקות ה-DNA
8. קבע את הגדלים של שברי הדנ"א המופרדים

Protocol

1. הכנת ג'ל

1. לשקול את המסה המתאימה של agarose לתוך הבקבוק Erlenmeyer. ג 'ל agarose מוכנים באמצעות aw / פתרון V אחוז. ריכוז agarose ב ג'ל יהיה תלוי בגדלים של קטעי דנ"א להיפרד, עם רוב הג'לים שנעו בין 0.5% -2%. נפח המאגר לא צריך להיות גדול מ 1/3 של קיבולת של הבקבוק.
2. הוסף פועל חיץ כדי agarose בקבוק המכיל. מערבולת לערבב. ג'ל הנפוץ ביותר הם פועל מאגרים טה (40 מ"מ טריס, אצטט, 1 mM EDTA) ו TBE (45 מ"מ טריס-borate, 1 mM EDTA).
3. ממיסים את תערובת agarose / חיץ. הדבר נעשה בדרך כלל על ידי חימום במיקרוגל, אבל יכול להיעשות גם על אש בונזן. ב 30 מרווחי ים, להסיר את הבקבוק ו מערבולת התוכן לערבב היטב. חזור על הפעולה עד agarose נמס לגמרי.
4. הוסף ethidium ברומיד (EtBr) לריכוז של 0.5 מיקרוגרם / מ"ל. לחלופין, ג'ל עשוי גם להיות מוכתם לאחר אלקטרוphoresis בניהול מאגר המכיל 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​EtBr במשך 15-30 דקות, ואחריו destaining בניהול חיץ לאורך שווה של זמן.

הערה: EtBr הוא קרצינוגן חשד חייב להיות מסולק כראוי לכל התקנות של המוסד. כפפות תמיד צריך להיות משוחק בעת טיפול ג'לים המכילים EtBr. צבעים חלופיים צביעה של ה-DNA זמינים, אך EtBr נשאר אחד הפופולריים ביותר וזאת עקב רגישותה ואת העלות.

5. אפשר agarose להתקרר גם על benchtop או הדגירה של אמבט מים 65 מעלות צלזיוס. אי ביצוע הוראה זו יהיה עיוות מגש ג'ל.
6. מניחים את המגש הג'ל לתוך מנגנון הליהוק. לחלופין, ניתן גם להדביק את הקצוות הפתוחים של מגש ג'ל ליצור עובש. מניחים מסרק מתאימה לתבנית ג'ל ליצור את הבארות.
7. יוצקים את agarose מותכת לתוך תבנית ג'ל. אפשר agarose להגדיר בטמפרטורת החדר. הסר את המסרק ואת המקום ג'ל בתיבה ג'ל. לחילופין, ה-Gאל ניתן גם עטוף בניילון ולאחסן ב 4 ° C עד השימוש (איור 1).

2. הקמת מנגנון ג'ל והפרדה של שברי ה-DNA

1. הוסף טעינת צבע על דגימות דנ"א להיפרד (איור 2). ג'ל טעינת צבע מורכב בדרך כלל בריכוז 6X (0.25% bromphenol כחול, cyanol קסילן 0.25%, 30% גליצרול). טוען הצבע עוזר כדי לעקוב אחר כמה רחוק דגימת DNA שלך נסעה, וגם מאפשר דגימה לשקוע ג'ל.
2. תוכנית כבל חשמל למתח הרצוי (1-5V/cm בין האלקטרודות).
3. הוסף חוצץ פועל מספיק כדי לכסות את פני השטח של ג'ל. חשוב להשתמש המאגר פועל זהה לזה המשמש להכנת ג'ל.
4. צרף את תיבת הפניות של ג'ל על ספק הכוח. הפעל את אספקת החשמל ולוודא כי הן תיבת ג'ל ואת אספקת החשמל פועלים.
5. הסר את המכסה. לאטבזהירות לטעון את דגימת DNA (ים) לתוך הג'ל (איור 3). סמן המתאים לגודל ה-DNA תמיד צריך להיות טעון יחד עם דגימות מעבדה.
6. החזר את מכסה התיבה ג'ל. הקתודה (מוביל שחורים) צריך להיות קרוב יותר בארות מאשר מוביל (אדומים) האנודה. בדוק את האלקטרודות מחוברים לאותה החריצים הנכונים באספקת החשמל.
7. הפעילו את המחשב. הפעל את הג'ל עד צבע העביר את המרחק המתאים.

3. התבוננות שברי ה-DNA מופרדים

1. כאשר אלקטרופורזה השלימה, לכבות את החשמל והסר את המכסה של תיבת ג'ל.
2. הסר ג'ל מתיבת ג'ל. מסננים את עודפי חיץ מפני השטח של ג'ל. מניחים את המגש ג'ל על מגבות נייר כדי לספוג את כל המאגר פועל נוסף.
3. הסר את הג'ל ממגש ג'ל ולחשוף את הג'ל לאור UV. הדבר נעשה בדרך כלל באמצעות תיעוד ג'ל המערכת (איור 4). להקות ה-DNA צריך להראותבתור להקות ניאון כתומות. לצלם את הג'ל (איור 5).
4. כמו שצריך להיפטר ג'ל ו חיץ פועל לפי תקנות המוסד.

4. נציג תוצאות

איור 5 מייצג את התוצאה בדרך כלל אחרי אלקטרופורזה בג'ל agarose של מוצרי ה-PCR. לאחר ההפרדה, את שברי ה-DNA וכתוצאה מכך נראים כמו פסים ברורים. תקן ה-DNA או סולם יש להפריד במידה המאפשרת קביעת שימושית של גדלים של להקות לדוגמה. בדוגמה המוצגת, שברי ה-DNA של 765 נ"ב, 880 נ"ב ו 1022 BP מופרדים על 1.5% agarose ג'ל יחד עם סולם 2-log-DNA.

באיור 1. הקרושה agarose ג'ל לאחר הסרת מסרק.

איור 2. תלמיד הוספת צבע טוען את דגימות ה-DNA שלה.

איור 3. התלמיד טוען דגימת DNA לתוך באר ג'ל.

איור 4. דוגמה של מערכת תיעוד ג'ל.

איור 5. התמונה אלקטרופורזה של ג'ל הודעה. EtBr נוספה ג'ל אלקטרופורזה לפני לריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם / מ"ל, ואחריו ההפרדה V 100 במשך שעה 1. ג'ל נחשף לאור UV ו תמונה לקחה עם מערכת תיעוד ג'ל.

Discussion

אלקטרופורזה agarose ג'ל הוכיח את עצמו באופן יעיל ואפקטיבי של הפרדת חומצות גרעין. כוח ג'ל גבוהה של agarose מאפשרת טיפול של ג'ל שיעור נמוך להפריד את שברי דנ"א גדולים. סנון מולקולרית נקבעת על ידי גודל של הנקבוביות שנוצר על ידי צרורות של agarose ⁷ במטריצה ​​ג'ל. באופן כללי, ככל שעולה ריכוז agarose, קטן יותר גודל הנקבוביות. מסורתית ג'ל agarose יעילים ביותר ההפרדה של שברי ה-DNA בין 100 נ"ב ו -25 KB. להפריד בין שברי דנ"א גדולים יותר מ -25 קילו, 1 תצטרך להשתמש בג'ל הדופק בתחום אלקטרופורזה ^6, הכוללת את היישום של זרם חילופין משני כיוונים שונים. בדרך זו יותר שברי דנ"א בגודל מופרדות המהירות שבה הם לכוון את עצמם עם שינויים בכיוון הנוכחי. קטעי דנ"א קטנות יותר מ -100 נ"ב מופרדים בצורה יעילה יותר באמצעות ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide. שונהagarose ג'ל, ג'ל מטריקס polyacrylamide נוצר באמצעות תגובה כימית רדיקלים חופשיים מונע. ג'ל אלו הם דקים יותר של ריכוז גבוה יותר, מופעלים אנכית יש רזולוציה טובה יותר. ב-DNA המודרנית רצף אלקטרופורזה נימי משמש, לפיה צינורות נימי מלאים מטריקס ג'ל. השימוש צינורות נימי מאפשר יישום של מתח גבוה, ובכך שהיא מאפשרת את ההפרדה בין שברי דנ"א (וקביעת רצף ה-DNA) במהירות.

Agarose יכול להיות שונה כדי ליצור התכה נמוכה agarose דרך hydroxyethylation. התכה נמוכה agarose משמש בדרך כלל כאשר הבידוד של שברי הדנ"א המופרדים הרצוי. Hydroxyethylation מפחיתה את צפיפות האריזה של חבילות agarose, ובכך מפחיתה ביעילות גודל הנקבוביות שלהם ^8. משמעות הדבר היא כי קטע DNA באותו גודל ייקח זמן רב יותר כדי לעבור התכה נמוכה agarose ג'ל בניגוד ג'ל agarose סטנדרטי. כי החבילות לקשר זה עם זהדרך לא קוולנטיים אינטראקציות ^9, ניתן להמיס מחדש ג'ל agarose לאחר הקימה.

EtBr הוא מגיב הנפוץ ביותר להכתים-DNA agarose ג'ל ^10. בעת חשיפה לאור UV, האלקטרונים טבעת ארומטית של המולקולה ethidium מופעלים, מה שגורם לשחרור של האנרגיה (אור) כחזרה אלקטרונים למצב בשטח. EtBr עובד על ידי intercalating עצמו מולקולת ה-DNA באופן תלוי ריכוז. זה מאפשר הערכה של כמות ה-DNA בלהקה כל ה-DNA מסוים על בסיס עוצמתו. בגלל מטען חיובי שלו, את השימוש EtBr מפחית את שיעור ההגירה DNA ב -15%. EtBr הוא mutagen החשוד כמסרטן, ולכן יש לנקוט בזהירות בעת הטיפול ג'ל agarose המכילים אותו. בנוסף, EtBr נחשב פסולת מסוכנת וצריך להיות מסולק כראוי. כתמים חלופיים-DNA ג'ל agarose כוללים SYBR זהב, SYBR ירוק, קריסטל ויולט מתיל כחול. מבין אלה,מתיל כחול קריסטל ויולט אינם דורשים חשיפת הג'ל לאור UV להדמיה של להקות ה-DNA, ובכך להפחית את הסיכוי של מוטציה אם ההחלמה של שבר דנ"א בג'ל הוא הרצוי. עם זאת, הרגישות שלהם נמוכה מזו של EtBr. SYBR זהב SYBR ירוק, שניהם רגישים מאוד, צבעים תלויים סגול עם רעילות נמוכה EtBr, אבל הם הרבה יותר יקר. יתר על כן, כל צבעי חלופיים או לא יכול להיות או לא עובדים טוב כאשר הוסיף ישירות ג'ל, ג'ל ולכן יהיה חייב להיות מוכתם הודעה לאחר אלקטרופורזה. בגלל הקלות עלות, תועלת, ורגישות, EtBr עדיין הצבע המועדף על חוקרים רבים. עם זאת, במצבים מסוימים, כגון כאשר סילוק פסולת מסוכנת או קשה כאשר תלמידים צעירים מבצעים ניסוי, צבע פחות רעיל עשוי להיות מועדף.

צבעים טוען המשמשים ג'ל אלקטרופורזה לשרת שלוש מטרות עיקריות. ראשית הם מוסיפים צפיפות מדגם, שמאפשר לו לשקוע ג'ל. שנית, צובעת את לספק צבע ולפשט את תהליך הטעינה. לבסוף, צבעים נעות במחירים סטנדרטיים באמצעות ג'ל, המאפשר הערכה של מרחק כי שברי דנ"א היגרו.

בגדלים המדויקים של קטעי דנ"א מופרדות ניתן לקבוע על ידי התוויית יומן של משקל מולקולרי של להקות שונות של תקן ה-DNA על המרחק של הלהקה כל אחד. תקן ה-DNA מכיל תערובת של קטעי דנ"א של שנקבעו מראש בגדלים שניתן בהשוואה מול דגימות ה-DNA ידועים. חשוב לציין כי צורות שונות של ה-DNA לעבור ג'ל בקצב שונה. ה-DNA פלסמיד Supercoiled, בגלל קונפורמציה קומפקטית שלה, עובר דרך ג'ל המהירה ביותר, ואחריו קטע DNA ליניארי באותו גודל, עם צורה עגולה פתוח נסיעה האיטי ביותר.

לסיכום, מאז אימוץ agarose ג'ל בשנות ה -1970 להפריד את ה-DNA, יש לוהוכחה אחת הטכניקות הכי שימושי צדדי במחקר מדעי ביולוגי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
אני agarose	Amresco	0710
בור חומצה	סיגמא	B7901
Bromophenol כחול	סיגמא	B8026
EDTA	סיגמא	E9884
Ethidium ברומיד	סיגמא	E7637	מסרטנים, צריך להיות מסולק כמו פסולת מסוכנת
חומצה אצטית קרחונית	דיג	BP2401-212	מאכל
גליצרול	דיג	G33-1
Xylenדואר cyanol FF	סיגמא	X4126
טריס בסיס	סיגמא	T1503
החוקר / FX ג'ל מערכת תיעוד	Fotodyne
ינשוף Easycast B1 מיני ג'ל אלקטרופורזה מערכת	Thermo Scientific	B1-PTM
EPS 301 ספק כוח	GE Healthcare	18-1130-01