DNA断片の分離のためのアガロースゲル電気泳動

要約

アガロースゲル電気泳動を用いたDNA断片の分離のための基本的なプロトコルが記述されています。

要約

アガロースゲル電気泳動で100 bpから25キロバイト¹までさまざまなサイズのDNA断片を分離する最も効果的な方法です。アガロースは、海藻テングサ属とオゴノリから分離され、繰り返しagarobiose（L-およびD-ガラクトース）のサブユニット²から構成されています。ゲル化時には、アガロースポリマーは、非共有結合的に関連付け、孔径ゲルの分子ふるい特性を決定するバンドルのネットワークを形成しています。アガロースゲル電気泳動の使用は、DNAの分離に革命をもたらしました。アガロースゲルの採択に先立ち、DNAは、主にのみサイズの近似値を提供してショ糖密度勾配遠心法を用いて分離した。アガロースゲル電気泳動を使用して、別のDNAに、DNAは、ゲルと印加される電流にプレキャストウェルにロードされます。 DNA（およびRNA）分子のリン酸バックボーンは負電場に置かれたとき、したがって、充電され、DNA断片は、pに移行しますositivelyアノードを充電されます。 DNAが均一な質量/電荷比を持つため、DNA分子が移動する距離は、その分子量³のログに反比例するようなパターンで、アガロースゲル内のサイズで区切られています。アガロースゲルを介してDNAの動きのための主要なモデルは、リーディングエッジが前方に移動し^、4に沿って分子の残りの部分を引っ張ることにより、 "レプにバイアス"です。 2）アガロース濃度、3）DNAのコンフォメーション^5、4）臭化エチジウム、6の電圧が適用され、5）が存在する）タイプのDNA分子の1）サイズ：ゲルを介してDNA分子の移動速度は、次の要素によって決まりますアガロースおよび7）電気泳動用バッファーの。分離した後、DNA分子は、適切な染料で染色した後、UV光下で可視化することができる。このプロトコルに従うことによって、学生のことができるようになります。

1. DNA断片をゲルマトリックス内に分離されているメカニズムを理解する
2. のコンフォメーション方法を理解するDNA分子はゲルマトリックスを通じて、モビリティを決定します
3. 彼らのニーズに合わせて適切な濃度のアガロース溶液を識別する
4. DNAサンプルの電気泳動用アガロースゲルを準備します。
5. ゲル電気泳動装置と電源を設定する
6. DNA断片の分離に適した電圧を選択します。
7. エチジウムブロマイドはDNAバンドの可視化を可能にするメカニズムを理解する
8. 分離したDNA断片のサイズを決定

プロトコル

1。ゲルの調製

1. 三角フラスコにアガロースの適切な質量を量る。アガロースゲルは、AW / Vの割合のソリューションを用いて調製される。ゲルのアガロース濃度は0.5％-2％の範囲のほとんどのゲルで分離するDNA断片の大きさに依存します。バッファーの量は、フラスコの容量の1/3を超えるべきではありません。
2. アガロース含有フラスコにバッファを実行して追加します。混合する渦巻。バッファを実行する最も一般的なゲルはTAE（40mMのTris-酢酸、1mMのEDTA）とTBE（45 mMのTris-ホウ酸、1mMのEDTA）である。
3. アガロース/バッファ混合物を溶かす。これは最も一般的に電子レンジで加熱することによって行われますが、ブンゼン火炎を介しても行うことができます。 30秒間隔で、内容をよく混合し、フラスコと渦を削除します。アガロースが完全に溶解するまで繰り返します。
4. 0.5μg/ mlの濃度にエチジウムブロマイド（EtBrを）を追加します。また、ゲルはまた、電気の後に染色することができ時間の長さが等しいためにバッファを実行する際に脱色続いて15から30分間、0.5μg/ mlのEtBrを含むバッファを実行しているで泳動。

注：EtBrをが疑われる発がん性物質であると正しく機関の規制ごとに廃棄しなければなりません。 EtBrを含むゲルを取り扱う際の手袋を常に着用する必要があります。 DNAの染色のための代替染料は使用可能ですがEtBrを、その感度とコストのために最も人気のひとつ​​です。

5. アガロースは、ベンチトップまたは65°Cの水浴中でインキュベートすることによりどちらかに冷却することができます。これを怠ると、ゲルトレイをワープします。
6. 鋳造装置にゲルトレイを置きます。あるいは、また、金型を作成するためのゲルトレイのオープンエッジをテープがあります。井戸を作成するためにゲル型に適切な櫛を配置します。
7. ゲル型に溶融アガロースを注ぎます。アガロースは室温で設定することができます。櫛を削除し、ゲルボックスにゲルを置きます。また、Gエルは、ラップに包んで4℃で保存することができます°Cを使用する（ 図1）まで。

2。ゲル装置およびDNA断片の分離の設定

1. （ 図2）分離するDNAサンプルをロードする染料を追加します。ゲルローディング色素は、通常、6X濃度（0.25％ブロモフェノールブルー、0.25％キシレンシアノール、30％グリセロール）で行われています。ローディング色素は、あなたのDNAサンプルが旅してきたどこまで追跡するのに役立ち、また、サンプルがゲルにシンクすることができます。
2. 所望の電圧にプログラム停電電源装置（電極間1-5V/cm）。
3. ゲルの表面を覆うために十分なランニングバッファーを追加します。ゲルを製造するために使用されるものと同じランニングバッファーを使用することが重要です。
4. 電源にゲルボックスのリード線を接続します。電源をオンにしてゲルボックスと電源の両方が機能していることを確認してください。
5. 蓋を外します。徐々にと慎重に（ 図3）ゲルにDNAサンプル（s）をロードします。適切なDNAサイズマーカーは、常に実験試料と一緒にロードする必要があります。
6. ゲルボックスに蓋を交換してください。カソード（黒リード）は、陽極側（赤色リード線）よりも井戸でなければなりません。電極は電源の正しいスロットに接続されていることをダブルチェック。
7. 電源をオンにします。染料は、適切な距離に移行するまで、ゲルを実行します。

3。分離したDNA断片を観察する

1. 電気泳動が完了したときは、電源をオフにして、ゲルボックスの蓋を取り外します。
2. ゲルボックスからゲルを外します。ゲルの表面から余分なバッファを切る。余分なランニングバッファーを吸収するためペーパータオルの上でゲルトレイを置きます。
3. ゲルトレイからゲルを外し、UV光にゲルを公開します。これは最も一般的なゲルドキュメンテーションシステム（ 図4）を使用して行われます。 DNAのバンドが表示されるはずですアップオレンジ蛍光バンドとして。ゲルの写真（ 図5）を取ります 。
4. 適切にゲルおよび機関の規制ごとにランニングバッファーに廃棄してください。

4。代表的な結果

図5は、PCR産物のアガロースゲル電気泳動後の典型的な結果を表します。分離後、得られたDNA断片は明確に定義されたバンドとして表示されます。 DNA標準またはラダーは、サンプルのバンドのサイズの便利な決定を可能にする程度に分離する必要があります。図示の例では、765 bpで、880 bpと1022 bpのDNA断片が2ログのDNAラダーと一緒に1.5％アガロースゲル上で分離されています。

櫛を除去した後の図1。固化したアガロースゲル。

図2学生は、彼女のDNAサンプルにローディング色素を追加します。

図3ゲルのウェルにDNAサンプルをロードする学生。

図4：ゲルドキュメンテーションシステムの例を示します。

図5。ゲル電気泳動後の画像。 EtBrを1時間、100 Vで分離に続いて、0.5μg/ mlの最終濃度を電気泳動前にゲルに追加されました。ゲルをUV光およびゲルドキュメンテーションシステムで撮影した画像にさらされていた。

ディスカッション

アガロースゲル電気泳動は、核酸を分離する効率的かつ効果的な方法であることが証明されています。アガロースの高いゲル強度は、大規模なDNA断片を分離するための割合が低いゲルの処理を行うことができます。分子ふるいは、ゲルマトリックス内のアガロース⁷のバンドルによって生成された細孔のサイズによって決まります。一般的に、アガロース、より小さい細孔径のより高い濃度である。従来のアガロースゲルは、100 bpと25キロバイトの間でDNA断片の分離に最も効果的です。 25キロバイトより大きいDNA断片を分離するために、1つは、2つの異なる方向からの交流電流のアプリケーションが含まれ、パルスフィールドゲル電気泳動法^6を使用する必要があります。このように大きなサイズのDNA断片は、それらが現在の方向の変化に自分自身を再方向付けする速度で区切られています。 100 bp未満のDNA断片がより効果的にポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分離されています。とは異なり、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲルマトリックスは、フリーラジカル主導の化学反応により形成されています。これらの薄いゲルは、高い濃度である垂直に実行され、良好な分解能を持っています。キャピラリー電気泳動シーケンシング現代のDNAが使用されているで、それによってキャピラリーチューブはゲルマトリックスで充填される。キャピラリーチューブの使用は、それによって迅速にDNA断片の分離（およびDNA配列の決定）を有効にする、高電圧の印加が可能になります。

アガロースは、ヒドロキシエチル化によって低融点アガロースを作成するために変更することができます。低融点アガロースは、一般的に分離したDNA断片の分離が望まれているときに使用されます。ヒドロキシエチル化が効果的に細孔サイズ^8を減らし、アガロースバンドルの充填密度を減らすことができます。これは、同じ大きさのDNA断片は、標準的なアガロースゲルとは対照的に低融点アガロースゲルを介して移動に時間がかかることを意味します。バンドルには、お互いに関連付けるためそれが設定された後に非共有結合的相互作用⁹を介して、それが再溶解アガロースゲル電気泳動することが可能です。

EtBrを、アガロースゲル¹⁰でDNAを染色するために使用される最も一般的な試薬です。紫外線にさらされると、エチ分子の芳香環の電子は電子が基底状態に戻るようにエネルギーの放出（光）につながる、活性化される。 EtBrを、濃度依存的にDNA分子に自分自身を挿入することによって動作します。これは、その強度に基づいて、任意の特定のDNAバンドのDNA量の推定が可能になります。ため、その正電荷が、EtBrを使用すると、15％のDNAの移動速度を減少させる。 EtBrを容疑者変異原性と発がん性物質である、従ってそれを含むアガロースゲルを取り扱う際に一つ注意しなければなりません。さらに、EtBrをは有害廃棄物とみなされ、適切に廃棄する必要があります。アガロースゲル中のDNAのための代替染色はSYBRゴールド、SYBRグリーン、クリスタルバイオレット、メチルブルーが含まれています。これらの、メチルブルーとクリスタルバイオレットは、ゲルからDNA断片の回収が必要な場合は、それによって突然変異の確率を減少させる、DNAバンドの可視化のための紫外光へのゲルの露出を必要としません。しかし、その感度はEtBrをより低くなっています。 SYBR金とSYBRグリーンはEtBrをより低い毒性の両方で高感度、UV依存染料であるが、それらはかなり高価です。また、代替染料のすべてのことはできませんいずれか、またはゲルに直接​​添加したときにうまく機能しない、したがって、ゲル電気泳動後のポストで染色しなければならないでしょう。ので、コスト、使いやすさ、感度の、EtBrを、まだ多くの研究者のための選択の染料のままです。しかし、このような有害廃棄物処理が困難な場合や、若い学生である場合など、特定の状況で実験を行っている、毒性の少ない染料が好ましい可能性があります。

ゲル電気泳動に使用されるローディングの染料は、三大目的があります。最初に、彼らは、サンプルに密度を追加する、それがゲルにシンクすることができます。第二に、染料の色を提供し、ロード·プロセスを簡素化します。最後に、色素は、DNA断片が移行し​​た距離の推定を可能にし、ゲルを介して標準的な速度で移動します。

分離したDNA断片の正確なサイズは、各バンドが移動した距離に対するDNA基準の異なるバンドの分子量の対数をプロットすることにより決定することができます。 DNA標準では、未知のDNAサンプルと比較することができますあらかじめ決められたサイズのDNA断片の混合物を含んでいます。それはDNAの異なる形態が異なる速度でゲル内を移動することに注意することが重要です。スーパーコイルプラスミドDNAは、ため、そのコンパクトな立体構造の、最も遅い走行開いた円形のフォームと同じ大きさの直鎖状DNA断片、続いて、最速のゲルを通して移動します。

結論としては、DNAの分離のための1970年代のアガロースゲルを採用しているので、それが持つ生物科学研究の中で最も有用と多彩な技術の一つであることが証明されています。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
アガロースI	Amresco	0710
ホウ酸	シグマ	B7901
ブロモフェノールブルー	シグマ	B8026
EDTA	シグマ	E9884
エチジウムブロマイド	シグマ	E7637	有害廃棄物として処分される発癌性、必要がある
氷酢酸	フィッシャー	BP2401-212	腐食性の
グリセロール	フィッシャー	G33-1
キシレン電子シアノールFF	シグマ	X4126
トリス塩基	シグマ	T1503
治験責任医師/ FXゲルドキュメンテーションシステム	Fotodyne
フクロウEasycast B1ミニゲル電気泳動システム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	B1-PTM
EPS 301電源	GEヘルスケア	18-1130-01