הקרנת תפוקה גבוהה למאפנני מולקולה הקטנה של ערוצי אשלגן מיישרים פנימה

Summary

שיטות לפיתוח והאימות של assay פלואורסצנטי כמוני למדידת פעילותם של אשלגן rectifier פנימה (קיר ') ערוצים להקרנת מתחם תפוקה גבוהה מוצגות.

Abstract

חברים מסוימים של המשפחה פנימה מיישר אשלגן (קיר ') הערוץ הם הניחו מטרות תרופה למגוון של הפרעות, כולל יתר לחץ דם, פרפור פרוזדורים, ^ו1,2 כאב. ברוב המקרים, עם זאת, התקדמות לקראת הבנת הפוטנציאל הטיפולי שלהם או הפונקציות פיסיולוגיות בסיסיות אפילו הואטה על ידי המחסור בכלים פרמקולוגיים טובים. אכן, פרמקולוגיה המולקולרית של משפחת המיישר פנימה כבר פגרה הרחק מאחורי זו של superfamily S4 של אשלגן ערוצי מתח מגודר (KV), שעבורו מספר של זיקת nanomolar ומאפנני הרעלן פפטיד סלקטיבית מאוד התגלו ^3. Tertiapin דבורת ארס הרעל ונגזרותיו הם מעכבי עצמה של Kir1.1 וKir3 ערוצים ^4.5, אבל הפפטידים של שימוש המוגבל טיפולי, כמו גם בניסוי בשל מאפייני antigenic והזמינות הביולוגיות ירודה, יציבות מטבולית וחדירנות רקמות. הפיתוח של עצמהובדיקות, במולקולה קטנה סלקטיבית עם תכונות פרמקולוגיות משופרות תהיינה מפתח להבנת הפיסיולוגיה והפוטנציאל טיפולי של ערוצי קיר 'באופן מלא.

מולקולרי ספריות בדיקות הפקת מרכז הרשת (MLPCN) הנתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) קרן משותפת יצרה הזדמנויות למדענים אקדמיים ליזום קמפייני בדיקת גילוי מטרות מולקולריות ולמסלולי איתות בצורך לפרמקולוגיה הטובה יותר ^6. MLPCN מספק חוקרי גישה למרכז הקרנת התעשייה בקנה מידה ובכימיה ואינפורמטיקה רפואית תומכות לפתח חלליות מולקולה קטנה שתסברנה את הפונקציה של גנים ורשתות גנים. השלב הקריטי בהשגת הכניסה לMLPCN הוא הפיתוח של היעד או מסלול הספציפי assay החזק שהוא נוח לתפוקה גבוהה הקרנה (HTS).

כאן, אנו מתארים כיצד לפתח פלואורסצנטי מבוסס תליום (Tl ⁺⁾ שטף אסאy של פונקצית קיר 'ערוץ להקרנת מתחם תפוקה גבוהה ^7,8,9,10. assay מתבסס על החדירות של K ⁺ ערוץ הנקבובי לK ^{+ +} Tl משלימתו. זמין מסחרי ניאון Tl ⁺ כתב צבע משמש לאיתור שטף הטרנסממברני של Tl ⁺ הדרך הנקבובית. ישנן לפחות שלושה צבעים זמינים מסחרי שמתאימים לTl ⁺ מבחני שטף: BTC, FluoZin-2, וFluxOR ^7,8. פרוטוקול זה מתאר פיתוח assay באמצעות FluoZin-2. למרות שפותח במקור ושווק כמחוון אבץ, FluoZin-2 מוצגי גידול יציב ותלוי במינון בפליטת פלואורסצנטי על Tl ⁺ כריכה. התחלנו לעבוד עם FluoZin-2 לפני FluxOR היה זמין ^7,8 וממשיך לעשות זאת ^9,10. עם זאת, בשלבים בפיתוח assay הם למעשה זהים בכל השלושה הצבעים, והמשתמשים צריכים לקבוע איזה צבע מתאים ביותר עבור n הספציפי שלהםeeds. כמו כן, אנו דנים את מדדי ביצועים של assay שיש להגיע אליה כדי להיחשב לכניסה לMLPCN. מאז Tl ^{+ +} בקלות מחלחל ערוצים רוב K, assay צריך להיות להתאמה מרבית היעדים ⁺ K הערוץ.

Protocol

1. דור של שורות תאי polyclonal יציבות

1. הקמת קו איכות גבוהה יציב תא המבטא את ערוץ הקיר 'של ריבית היא צעד ראשון חשוב לקראת פיתוח assay הקרנת תפוקה גבוהה וחסון. המכונן K ⁺ overexpression הערוץ יכול להוביל הפעלה של מסלולים סלולריים מוות, ניוון משורת תאים יציב ואובדן ביצועי assay. כדי למנוע בעיות פוטנציאליות אלה ולספק בקרה פנימית נוחה לפיתוח assay (ראה בהמשך), מערכת ביטוי טטרציקלין-מושרה מומלצת ^8.
2. תרבות הורי T-Rex-HEK293 תאים באמצעות טכניקות סטנדרטיות בB-בינוני (מדיום גידול DMEM המכיל 10% FBS, 50 U / מיליליטר פניצילין, סטרפטומיצין 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו 5 מיקרוגרם / המ"ל Blasticidin S). השתמש בתאי מעבר מוקדמים (קטעים 3-4 כגון מאז הפשרה מאחסון חנקן נוזלי) עבור transfection ובחירת שיבוט יציבה.
3. T-Rex-HEK293 לוח 4 מיליון תאים ב² בקבוק הסנטימטר 75 כך שהבקבוק הוא כ 80% confluent ביום המחרת. תרבות הלילה בCO ₂ חממה 5% ב 37 ° C.
4. Transfect התאים באמצעות 10-15 מיקרוגרם של ה-DNA ומגיב pcDNA5/TO-Kir Lipofectamine LTX / פלוס פי הפרוטוקול של היצרן. אחרי 5 שעות, החלף את מדיום transfection עם B-בינוני.
5. 24 שעות לאחר transfection, החלף את B-בינוני עם בלימת B-בינוני 250 מיקרוגרם / המ"ל Hygromycin (BH-בינוני) להתחיל בבחירת שיבוט יציבה. מזין את התאים כל 2-3 ימים עם טרי BH-בינוני.
6. יותר מ 90% מהתאים צריכים למות במהלך 7 ימים הקרובים, והשאירו מאחורי מושבות קטנות של תאי transfected ביציבות. אפשר המושבות לגדול לכ 10-14 ימים נוספים לפני פיצול ^ל2 בקבוק 175 סנטימטרים להרחבה.
7. להקפאה קריוגנית, להקפיא 3 x 10 ⁶ תאים / מ"ל בתקשורת המכילה 45% התנה BH-בינוני, 45% אנטיביוטיקה ללא DMEM, סרום המכיל 10% וDMSO. להקפיאתאי הלינה ב-80 מעלות צלזיוס בתא הקפאת מכל ולאחר מכן לעבור לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. הפשר תאים מחנקן נוזלי באמצעות הפרוטוקול המומלץ של Invitrogen. שים לב שיכולת הקיום של התאים תהיה נמוכה יותר אם הם קפואים מבקבוק שעולה confluent 75% בעת העיבוד.

2. דור של שורות תאים חד שבטיות יציבות

1. שטוף ² סנטימטר בקבוק תת confluent 75 תאי polyclonal יציבים עם HBSS divalent חינם. הוסף 1 מ"ל של טריפסין ודגירה במשך 3-5 דקות בCO ₂ חממה 5% ב 37 ° C. הוסף 5 מ"ל של מדיום BH לבקבוק כדי לעכב פעילות טריפסין וtriturate שוב ושוב (למשל, 5 פעמים) לנתק את התאים באופן מלא. בזהירות לבדוק את התאים תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח את ההשעיה מורכבת כמעט לחלוטין של תאים בודדים. זה יגביר את הסיכוי לקבלת שורות תאים חד שבטיות.
2. לקבוע את צפיפות התאים ולדללההשעיה לריכוז של 0.7 תאים לכל 20 μl. שימוש רב ערוצית pipettor, 20 μl פיפטה של ​​השעית התא לתוך כל קידוח של BD (או פולי-D-ליזין שווה ערך מצופה) צלחות PureCoat האמין מצופה 384 כן. בעיקרון, 70% מבארות צריכים לקבל תא אחד עם תנאי ציפוי אלה. לכן, צלחת 384 היטב צריכה להכיל יותר מ 200 שיבוטים לניתוח. המשך culturing התאים בCO ₂ חממה 5% ב 37 ° C.
3. אחרי שבוע, לבדוק את הצלחות מתחת למיקרוסקופ לבארות המכילות מושבות בודדות. שים לב המיקום שלהם על המכסה עם סמן קבוע לשימוש עתידי. הקפד גם לציין ואינן כולל בארות המכילות מושבות מרובות. אלה מוכרים בקלות על ידי הופעתו של גידול מושבות מצדדים מרובים של המים מהבאר. להיות מודע לכך שהאידוי נוטה להתרחש במהירות רבה יותר מבארות ליד הקצה של הצלחת. הוסף BH-מדיום לבארות בי אידוי משמעותי התרחש. אחרת, זה לא מיותרo מזין את התאים.
4. לפקח על הבארות בתדירות גבוהה יותר במהלך 7-10 ימים הקרובים. התאים יהיו מוכנים לפצל כאשר בארות עניין הן לפחות 50% confluent.
5. פיצול התאים לשכפל צלחות 384 היטב; צלחת אחת לassaying עם Tl ⁺ שטף ואחר להמשך הקווים חד השבטיים בתרבות. לשאוב את המדיום מהבארות המכילות את שורות תאים של עניין. לשטוף את התאים עם HBSS divalent חינם, להוסיף 20 μl של טריפסין לכל באר ולהעביר את הצלחת ל37 מעלות צלזיוס חממת 15-20 דקות. אחרי שהעביר את הצלחת למכסת מנוע תרבית התאים, להוסיף 20 μl של BH-בינוני לכל באר וtriturate מספר פעמים כדי לנתק את התאים. בדוק את הבארות תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח את התאים הם ניתקו באופן מלא. זה עשוי לדרוש סבבים רבים של pipetting, כמו התאים יהיו חסיד בחוזקה. ברגע שהתאים הם מנותקים, להעביר 10 μl של כל השעית תא כדי לשכפל את הבארות של BD PureCoat החדש האמין מצופה 384-גם צלחת. הקפד לציין את הקשר בין המקור טוב ולשכפל את בארות יעד כך שהשיבוטים מציגים פעילות ערוץ קיר 'חזקה (ראה בהמשך) יכולים להיות נעוצים גם המקורי. הוסף 20 μl של BH-בינוני למקור גם המזין את התאים שנותרו ולהמשיך אותם בתרבות ב5% CO ₂ חממה ב 37 ° C.
6. אפשר התאים בצלחת היעד לדבוק ולגדול עד שבוע. ברגע שרוב השיבוטים להגיע מפגש לפחות 50%, שהם יכולים להיות מוערכים לפעילות קיר 'ערוץ באמצעות Tl ⁺ assay השטף מתואר להלן.
7. היום לפני הבדיקה, לשאוב את מדיום התרבות ולהחליף אותו במדיום המכיל BH FBS דיאליזה 10%. זה מונע ביטוי ערוץ מכוון שיכול לנבוע מסרום מזוהם טטרציקלין. לגרום לביטוי ערוץ קיר 'רק באחת מהבארות הכפולות עבור כל שיבוט על ידי כולל מיקרוגרם 1 / טטרציקלין מ"ל. לשכפל uninduced גם ישמששליטה "רקע". בצע Tl ⁺ מבחני שטף כמתואר הבא.

3. הכללי Tl ⁺ נוהל Assay שטף

1. היום לפני Tl ⁺ ניסוי שטף, לנתק את התאים ולכמת את הצפיפות של השעית התא כמתואר בסעיפי 2.1 ו -2.2. 20,000 תאי צלחת חד שבטיים transfected ביציבות עם גן ערוץ קיר 'של עניין בכל אחד גם מצלחת BD PureCoat האמין מצופית 384 גם באמצעות קומבי Multidrop Thermo או pipettor רב ערוצית. השתמש בינוני BH המכיל 10% FBS דיאליזה לציפוי. שים לב שחלק מהתאים יהיו בתרבית הלילה עם מיקרוגרם 1 / טטרציקלין מ"ל כדי לגרום לביטוי ערוץ קיר, לפני ואילו אחרים לא. המיקום של תאים מושרים וuninduced יהיה שונה לכל סוג של ניסוי ומוצגים באיור 1.
2. למחרת, לבדוק את הצלחות מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים באופן שווה הם חסיד והפיץ על פני חלק התחתוןמהבארות. הבארות צריכות להיות confluent 80-90%.
3. השתמש במכונת כביסת Microplate ELx405 להחליף את מדיום תרבית תאים עם 20 μl לטוב של חיץ assay HBSS המכיל 20 HEPES המ"מ וופר ל-pH 7.3 עם NaOH. לחלופין, אפשר להשתמש בשיטה "קפיצית וטריקה", שבו צלחת היא הפוך ונשברה מטה בחדות כדי להוציא את המדיום לתוך מכולת אשפה, ואז טפח על מגבות נייר נערמו להסיר את המדיה הנותרת. מייד להוסיף חזרה חיץ assay HBSS לצלחת כדי למנוע מהתאים desiccating.
4. הכן FluoZin-2, AM פתרון טעינת צבע. לאחר צנטריפוגה הצינור בקצרה, לפזר 50 מיקרוגרם של FluoZin-2 באבקה 100 μl של DMSO נטול מים. בשלב זה, aliquots של פתרון 1000 x המניות ניתן לאחסן ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר. כאשר יהיו מוכן לשימוש, להוסיף 50 μl של משקל 20% לפתרון F-127/DMSO Pluronic נפח לצבע ולערבב עם pipetting העדין. אין להקפיא את הצבע הפעם Pluronic F-127 נוסף, כטמפרטורה נמוכה עלולה לגרום לפעילי השטח כדי להקדים מתוך פתרון. הוסף נפח 150 μl של FluoZin-2, AM/Pluronic-F127 ל100 מ"ל של חיץ assay HBSS ולערבב בעדינות על מנת להפוך את חיץ טעינת הצבע. שימוש קומבי Multidrop או pipettor רב ערוצית, להוסיף 20 μl של חיץ טעינת צבע לכל 20 μl היטב כבר מכיל מאגר של assay HBSS. דגירת התאים בטמפרטורת חדר למשך כ 1 שעות (בדרך כלל דגירה נעשתה בחושך, למרות שאין ראיות ישירות לכך שיש צורך).
5. בעוד תאי טעינה עם צבע, להכין ⁺ צלחת גירוי Tl. טרי להמס 0.5 גרם של סודה לשתייה ב50 מ"ל של 5x חיץ גירוי Tl ⁺ מכיל סולפט 1 מ"מ מגנזיום, סידן גופרתי mM 1.8, גלוקוז 5 מ"מ, 10 מ"מ וHEPES mM Tl 12 ⁺ סולפט. לחלופין, סודה לשתייה יכולה להיות מוחלפת עם gluconate נתרן אם, למשל, יש לשמור על רמת חומציות הפתרון בטווח צר מאוד והפסד של דו תחמוצת הפחמןהיא דאגה. מכסה את הצינור בחוזקה כדי להגביל את הבריחה של דו תחמוצת הפחמן ולהפוך כמה פעמים עד שהסודה לשתייה עם ההתרככות. שימוש pipettor רב ערוצית, להוסיף 50 μl של פתרון לכל באר של פוליפרופילן צלחת 384 היטב (טבלה 1).
6. לאחר שהתאים היו עמוסים FluoZin-2, בבוקר, שוטף את הכלים במכונת כביסת Microplate ELx405 או באמצעות "הקפיצי וטריקה" שיטה, כפי שתואר לעיל בסעיף 3.3. בהתאם לסוג של Tl ⁺ ניסוי שטף להתבצע, להוסיף חזרה 20 או 40 μl μl של חיץ assay HBSS לכל באר. הצלחות מוכנות כעת לניסויים.
7. הסלולרית וTl ⁺ צלחות לתוך מערכת Hamamatsu פונקציונלי תרופות הקרנה (FDSS) או שווה ערך קורא הקינטית הדמית צלחת עם יכולות משולבות נוזל חלק. השתמש במסננים מתאימים לצבעים מבוססי fluorescein fluorescein / כגון Fluo-4.
8. הגדרת פרוטוקול יחיד, כך שתוספת 10 μl Tl 5x ⁺סדרה מתווספת לבארות המקבילות של צלחת התא המכילה 40 μl של חיץ assay HBSS. פלואורסצנטי שיא הבסיסי בתדר דגימת הרץ 1 עבור לפחות 10 שניות. פלואורסצנטי אמיד גם צריך להיות אחיד ויציב על פני הצלחת פעם אחת תנאי העמסת תא ציפוי אופטימלי, שטיפה וצבע מבוססים. משולב 384 ערוץ pipettor משמש בו זמנית כדי להוסיף ⁺ חיץ גירוי Tl לכל באר.
9. שיא של לפחות 2 דקות, כדי שהשיעור והשיא של Tl העלייה ^+-מושרה בפלואורסצנטי הוא נתפס לניתוח מצב לא מקוון.

4. קביעת הריכוז אופטימלי + ​​Tl

1. Tl ⁺ קלות מחלחל פנימה ביותר rectifier K ⁺ ערוצים. כדי להבטיח שTl ⁺ ריכוזים לא יעלו על הטווח הדינמי של Tl ⁺ כתב לצבוע FluoZin-2, יש לקבוע באופן אמפירי האופטימלי Tl ⁺ ריכוז כדי לשמש גבוה tמסך hroughput. אנו ממליצים ⁺ ריכוז Tl שמעורר 80% מתגובת פלואורסצנטי המקסימלי (EC ₈₀₎ בתנאים שבו הערוץ המופעלת מקסימאלי.
2. פלייט, עומס לצבוע ולשטוף את התאים ב BD PureCoat צלחות אמינות מצופים או שווות ערך פולי-D-ליזין מצופים 384 היטב כפי שתואר לעיל בסעיף 3, והשאיר 40 μl של חיץ assay HBSS בכל אחד גם. כפי שניתן לראות במפת הצלחת באיור 1 א ', עמודת 1 ושורות A1-A23 צריך מכיל תאים שלא היה מושרים עם טטרציקלין ולכן אינו מבטאים את ערוץ הקיר' של עניין. FluoZin-2 את אותות הקרינה מבארות uninduced ישמשו כדי לקבוע את הרמה של Tl ⁺ שטף דרך מסלולים אנדוגניים, כגון Na ⁺ K - משאבה ^+-ATPase ו-K ⁺ מתח המגודר ערוצים, אשר בדרך כלל באים לידי ביטוי בHEK- 293 תאים.
3. השתמש בפלטפורמת Agilent ראבו אוטומטי נוזלית או הוראות טיפול pipetting להכין11 נקודות ⁺ סדרת Tl ריכוז דילול במאגר assay HBSS. בדרך כלל, סדרת דילול סדרה 3-לקפל נעה בין 100% ל - 0.002% Tl ⁺ מוערכת בבדיקה. הסדרה צריכה להיות מורכב בריכוז 5x כי ידוללו את פתרוני Tl ⁺ 01:05 בassay הסופי. הכן את סדרת הדילול על ידי דילול Tl 5x ⁺ החיץ הרגיל מתואר בסעיף 3 עם Tl 5x חיץ ^+-חינם המכיל סולפט 1 מ"מ מגנזיום, סידן גופרתי mM 1.8, גלוקוז 5 מ"מ ו 10 המ"מ HEPES. שוב, טרי להמס 0.5 גרם של סודה לשתייה ב50 מ"ל של החיץ הסופי Tl ⁺ מייד לפני הציפוי בצלחת פוליפרופילן 384 גם לפי המפה שמוצגת בצלחת 2A איור.
4. טען ⁺ צלחות גירוי Tl תא ולתוך FDSS. הגדרת פרוטוקול יחיד, כך שתוספת 10 μl 5x Tl ⁺ הסדרה מתווספת לבארות המקבילות של צלחת התא המכילה 40 μl של HBSחיץ assay S. בסיס-2 FluoZin פלואורסצנטי השיא 10 שניות לפני הוספת Tl ⁺ לצלחת. חזור על הניסוי על 3 ימים נפרדים להקמת השחזור של התוצאות.

5. קביעת רגישות Assay לDMSO

1. המולקולות הקטנות נחקרו במסך תפוקה גבוהה הם מומסים בממס האורגני sulfoxide דימתיל (DMSO), שעצמו יכול להשפיע על הביצועים של assay. לכן, הרגישות של הבדיקה לDMSO חייבת להיות ראשון בחנה להקים ריכוז DMSO הגבוה ביותר המוותר במסך.
2. פלייט, עומס לצבוע ולשטוף את תאי הצלחות בBD-384 גם אמין מצופה PureCoat כמתואר לעיל בסעיף 3, והשאיר 20 μl של חיץ assay HBSS בכל אחד גם. כל הצלחת צריכה להכיל תאים זה היו יכול להיגרם בטטרציקלין (איור 3 א).
3. השתמש בפלטפורמת ראבו אוטומטית נוזלית או הוראות טיפול pipetting להכין 11 נקודתי Dסדרת MSO ריכוז דילול במאגר assay HBSS. בדרך כלל, סדרת דילול 2-לקפל נעה בין 10% ל 0.01% v / v DMSO מוערכת לפעילות בבדיקה. הסדרה צריכה להיות מורכב בריכוז 2x כי ידוללו את פתרוני DMSO בחצי בבדיקה הסופית. סדרת הדילול צריכה להיות מצופית בפוליפרופילן צלחת 384 היטב, על פי מפת הצלחת מוצגת באיור 3 א.
4. הכן Tl 5x ⁺ צלחת גירוי מבוססת על EC ₈₀ או Tl האופטימלי ⁺ הריכוז נקבע בסעיף 4.
5. טען תא, DMSO וTl ⁺ צלחות תמריצים לFDSS. הגדר את פרוטוקול שתי תוספות, כך ש20 μl של ריכוז 2x DMSO הסדרה מתווספת לבארות המקבילות של צלחת התא המכילה 20 μl של חיץ assay HBSS. השאר את DMSO על התאים לאותו פרק הזמן יהיו חשופים לתאי רכב מולקולה קטנה במסך. בסיס-2 FluoZin פלואורסצנטי שיא בלפחות 10 שניות לפני הוספת 10 μl של Tl 5x ⁺ חיץ לכל אחד גם מצלחת התא. חזור על הניסוי על 3 ימים נפרדים להקמת השחזור של התוצאות.
6. הבדיקה צריכה להיות סובלנית לDMSO ריכוזים של לפחות 0.1% v / v למסך טיפוסי תפוקה גבוהה שבתרכובות נבדקו בריכוז של 10 מיקרומטר.

6. קביעת רגישות Assay למאפננים תרופתיים מוכרים

1. לאחר קביעה האופטימלית ⁺ הסובלנות וריכוז DMSO Tl של assay, ההשפעות של סוכנים פרמקולוגית ידועות פעילים בקיר 'ערוץ תיווך Tl ⁺ שטף יש לבחון. זו סדרה של ניסויים תהיה להעריך את הרגישות של assay, יכולת תרכובות דרגה מסדר המבוססים על העצמה, יכולתם לקטלג תרכובות המבוססות על המצב של יעילותם (למשל activator, מעכב), ולזהות תרכובות בקרה ממושמעים לשימוש מאוחר יותר ב assay דevelopment ומסך.
2. פלייט, עומס לצבוע ולשטוף את תאי הצלחות בBD-384 גם אמין מצופה PureCoat כמתואר לעיל בסעיף 3, והשאיר 20 μl של חיץ assay HBSS בכל אחד גם. טור 1 ושורות A1-A23 צריך להכיל תאים שלא היה מושרים בטטרציקלין (איור 4 א).
3. השתמש בפלטפורמת ראבו אוטומטית נוזלית או הוראות טיפול pipetting להכין סדרת דילול ריכוז 11 נקודות של מאפננים ידועים בחיץ assay HBSS. בדרך כלל, סדרת דילול 3-לקפל נעה בין 100 מיקרומטר עד 2 ננומטר היא הערכה לפעילות בבדיקה. הסדרה צריכה להיות מורכב בריכוז 2x כי ידוללו את פתרוני DMSO בחצי בבדיקה הסופית. סדרת הדילול צריכה להיות מצופית בשלושה עותקים בפוליפרופילן צלחת 384 היטב, על פי מפת הצלחת שמוצגת באיור 4 א. הקפד שהדילולים עשויים כך שריכוזי DMSO הסופיים הם זהים בין טיפולים תרופתיים ופחות tha n או שווה לריכוז המרבי המוותר DMSO הגדרתו בסעיף 5.
4. הכן Tl 5x ⁺ צלחת מבוססת על גירוי האופטימלי Tl ⁺ הריכוז נקבע בסעיף 4.
5. טען את התא, ומתחם ⁺ צלחות גירוי Tl לFDSS. הגדר את פרוטוקול שתי תוספות, כך שμl סדרת מתחם ריכוז 2x 20 מתווספת לבארות המקבילות של צלחת התא המכילה 20 μl של חיץ assay HBSS. הוסף את התרכובות לצלחת התא ודגירה לתקופה של עד 20 דקות. שים לב שזמן הדגירה האופטימלית למתחמים כדי לזהות את האות הטוב ביותר יחס ברקע ניתן לקבוע על ידי הפעלת סדרה של ניסויים בו כמה פעמי דגירה שונות שנבחרו. בסיס-2 FluoZin פלואורסצנטי השיא במשך לפחות 10 שניות לפני הוספת 10 μl של Tl 5x ⁺ חיץ לכל אחד גם מצלחת התא. חזור על הניסוי על 3 ימים נפרדים להקמת השחזור של התוצאות.

_title "ניתוח> 7. שחמט

1. בניסויים הבאים, האחידות והשחזור של assay תיבחן באמצעות ניתוח "לוח שחמט". בדרך כלל, מעכב שליטה מצופה בכל באר האחר של כל טור ושורה של צלחת 384 היטב, כפי שמוצג באיור 5 א. בקפדנות על מנת להעריך את הרעש בassay, ₈₀ EC ריכוז של מעכב צריך להיות בשימוש. DMSO מתווסף לבארות האחרות כמו שליטה ברכב. Tl ⁺ שטף בDMSO ותאים שטופלו בתרופה משמשים לחישוב ערך עבור Z ממשלה, מדד סטטיסטי של השתנות אמידות היטב בקרב שתי האוכלוסיות של בארות. Z הממשלה מחושבת באמצעות נוסחה:
   Z ממשלה = 1 - _(עמ 3SD + 3SD _n) / | מתכוון _P + פירוש _n |
   בי SD הוא סטיית תקן, עמ 'הוא שטף חסר מעצורים ועכבות n הוא מלא ערכי שטף. בדיקה עם הערכים הגדולים או שווים ל 0.5 Z '3 ימים הנפרדים של נחשבתuitable לתפוקה גבוהה הקרנה.
2. פלייט, עומס לצבוע ולשטוף את תאי הצלחות בBD-384 גם אמין מצופה PureCoat כמתואר לעיל בסעיף 3, והשאיר 20 μl של חיץ assay HBSS בכל אחד גם. שים לב שכל הצלחת צריכה להיות מושרה בטטרציקלין.
3. הפוך צלחת מתחם / DMSO ידי pipetting לתוך צלחת פוליפרופילן 384 גם שימוש רב ערוצית pipettor, 80 μl / גם של מעכב ידוע של ערוץ יעד הקיר 'בריכוז שנקבע בסעיף 6.5, ו -0.1% v / v DMSO רכב כפי שמוצג באיור 5 א. הוסף מעכב הידוע מתחיל בA1 גם באמצעות ערוץ מרובה pipettor והחלופי לטובים B2 וכן הלאה עד גם B24. חזור על תהליך זה עם DMSO מתחיל בB1 היטב וכך הלאה עד היטב A24. הפריסה הסופית של הצלחת צריכה להתאים את זה של לוח שחמט.
4. הכן 5x ⁺ צלחת Tl גירוי מבוססת על Tl האופטימלי ⁺ נקבעה בסעיף 4.
5. טען תא, המתחם ו-Tl ⁺ גירוי צלחות לFDSS. הגדר את פרוטוקול שתי תוספות, כך שμl סדרת מתחם ריכוז 2x 20 מתווספת לבארות המקבילות של צלחת התא המכילה 20 μl של חיץ assay HBSS. הוסף את התרכובות לצלחת התא ודגירה של עד 20 דקות בטמפרטורת חדר. בסיס-2 FluoZin פלואורסצנטי השיא במשך לפחות 10 שניות לפני הוספת 10 μl של Tl 5x ⁺ חיץ לכל אחד גם מצלחת התא. חזור על הניסוי על 3 ימים נפרדים להקמת השחזור של התוצאות.

8. מסך טייס

1. בשלב הסופי של פיתוח assay, לבצע מסך פיילוט של כמה אלף תרכובות כדי להעריך את הביצועים של הבדיקה בתנאים שישמשו סופו של דבר במסך רחב היקף התפוקה גבוהה.
2. פלייט, עומס לצבוע ולשטוף את התאים ב BD PureCoat צלחות גם 384-אמינות מצופות כפי שתואר לעיל בסעיף 3), והשאיר 20 μl של חיץ assay HBSS בכל אחד גם.שים לב שכל הצלחת צריכה להיות מתורבתת לילה עם טטרציקלין לגרום לביטוי ערוץ קיר '.
3. בחר כ -2,000 עד 3,000 תרכובות מבניות שונות שנבדקה. זה בדרך כלל מתאים ונוח לשימוש באוספי תרכובות עם פעילות ידועה המועשרת פוטנציאלית למאפנני ערוץ יון. אוספים אלה כוללים אוסף הספקטרום (MicroSource) וLOPAC האוסף (סיגמא). בנוסף, זה נבון לכלול מאפננים ידועים של הקיר 'של עניין במסך טייס. באופן אידיאלי תרכובות אלו תתווספנה לבארות באופנה עיוורת כדי לאפשר בדיקה משוחדת משיטות הקטיף פגע תפורטנה בהמשך. הכן את התרכובות בצלחות פוליפרופילן 384 (גם צלחות יעד) באמצעות הנדלר Labcyte אקו נוזל סיכה או כלי מתאים להעברת נפח מתאים של תרכובות שנבחרו בDMSO מאוסף MLPCN (צלחות מקור) לצלחות היעד שימו לב שבדיקה הן תרכובות רק בעמודים 3-22;בכל באר האחר של עמודות 1, 2, 23, 24 להוסיף מעכב ידוע בריכוז הידוע כמדכא את הקיר 'באופן מלא כפי שנקבע בסעיף 7. בבארות הנותרות של עמודות 1, 2, 23, 24 ולהוסיף נפח המתאים של DMSO לייצר פקדי רכב ריכוז בהתאמת DMSO. לדלל את כל הבארות במאגר Assay באמצעות קומבי Multidrop. בדרך כלל תרכובות מבחן תהיינה 20 מיקרומטר, 2-לקפל מעל ריכוז הקרנת היעד שלהם.
4. הפוך ⁺ צלחות גירוי Tl מבוססים על אופטימלי Tl ⁺ הריכוז נקבע בסעיף 4.
5. הפעל את מסך טייס. תשמרו על עצמך כדי להתנודד מדרגות הביצוע של הפרוטוקול לשמור על תזמון עקבי בין צלחות בטווח הקרנת הטייס.
6. ברגע שמסך הטייס הושלם, לנתח את בארות דמקה מעמודות 1, 2, 23, 24 ובאמצעות משוואת Z-הממשלה. בדוק צלחות שמראות ערכי Z-prime של פחות מ -0.5 כדי לקבוע את המקור של פרדה של אוכלוסיות עניה בקרה. להיטים יכולים bהדואר נבחר תוך שימוש במספר השיטות. למסכי פיילוט המקובל לחשב את הסטייה הממוצעת וסטנדרטית של אוכלוסיית השליטה ברכב ולאסוף להיטים מבוססים על בארות מפיקות ערכים> / = 3 סטיות תקן מהממוצע של פקדי הרכב.
7. לאחר קטיף להיט, להיטים נבחרים חוזרים בשני עותקים ב2 סטים של צלחות. קבוצה אחת של צלחות מכילה תא הקיר 'היציב בהיעדר טטרציקלין והשני מכיל שורת תאים היציבה הקיר' בנוכחות טטרציקלין. להיטים שחוזרים חיובי בלפחות אחד משתי הצלחות החוזרות ולא מצליחין להראות פעילות משמעותית בצלחות uninduced עשוי להיחשב אומתו להיטים. בדוק את רשימת החיסול אימת כדי לקבוע כמה מהדגימות "הנסתרות" הבקרה אותרו. כישלון כדי לזהות את הפקדים במסך הטייס מצביע על הצורך באופטימיזציה נוספת של הקרנה או להיט קטיף פרמטרים.

תוצאות

השימוש במערכת ביטוי טטרציקלין-מושרה מספק בקרה פנימית נוחה להבחנת Tl ⁺ שטף דרך מסלולים אנדוגניים וערוץ הקיר 'של עניין. איור 1 מציג מספר דוגמאות של מפות ציפוי סלולרי בשימוש בסוגים שונים של ניסויים. העמדות של בארות המכילות תאי uninduced או טטרציקלין מושרים מס...

Discussion

טיפול נתונים: לאחר שהנתונים נאסף, צעד נפוץ בניתוח כרוך בנרמול התגובה של כל גם פלואורסצנטי, F, לשווי הראשוני שלה בתחילת הניסוי, נ _0. זה נפוץ המכונה "יחס סטטי" וסמל "F / F ^_0". במקרים בי F ₀ נשלטים על ידי צבע חיווי פעולת יחס סטטי משמעותי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
pcDNA5/TO	Invitrogen	V1033-20	וקטור הביטוי טטרציקלין-מושרה
T-Rex-HEK293 תאים	Invitrogen	R71007	שורת תאים טטרציקלין-מושרה
Lipofectamine מגיב LTX / פלוס	Invitrogen	15338100	מגיב transfection
FBS	אטלנטה ביולוגית	S11550	תקשורת סלולרית התרבות
DMEM	Invitrogen	11965	תקשורת סלולרית התרבות
Hygromycin B	Invitrogen	10687-010	תקשורת סלולרית התרבות
S Blasticidin	Invitrogen	R210-01	תקשורת סלולרית התרבות
פניצילין / סטרפטומיצין	Invitrogen	15140	תקשורת סלולרית התרבות
HBSS-divalent חופשי	Mediatech	21022CV	שטיפת תא
טריפסין-0.25%	Mediatech	25053CI	התא דיסוציאציה
טטרציקלין-HCl	סיגמא	T9823	מגיב אינדוקציה
FBS הדיאליזה	אטלנטה ביולוגית	S12650	תקשורת ציפוי
FluoZin-2	Invitrogen	F24189	צבע פלואורסצנטי
Pluronic F-127	Invitrogen	P-3000MP	דאה טעינה
HBSS	Invitrogen	14175	חיץ assay
HEPES	Invitrogen	15630	חיץ assay
3 NaHCO	סיגמא	S6297	Tl + גירוי חיץ
MgSO 4	סיגמא	M2643	Tl + גירוי חיץ
קאסו 4 • 2H 2 O	סיגמא	C3771	Tl + גירוי חיץ
D-גלוקוז	סיגמא	G7528	Tl + גירוי חיץ
תליום סולפט	אולדריץ	204625	Tl + גירוי חיץ
HEPES	סיגמא	H4034	Tl + גירוי חיץ
DMSO	סיגמא	D4540	ממס
שמונה ערוץ האלקטרוני pipettor	Biohit	E300	ציפוי תא ב384 -גם צלחות
BD PureCoat צלחות אמינות מצופות 384 גם	BD Biosciences	356719	microplates Assay
אקו כשיר 384 ובכן פוליפרופילן microplate (384PP)	Labcyte	P-05525	microplates המקור המתחם
microplates פוליפרופילן 384 גם	גריינר ביו אחד	781280
מתקן ריאגנט קומבי Multidrop	Thermo Scientific	5840300
ELx405 מכונת כביסת microplate	BioTek	ELx405HT	שטיפת תא אוטומטית
הד מטפל נוזלי	Labcyte	Labcyte אקו 550
פלטפורמת טיפול נוזל ראבו האוטומטי	טכנולוגיות Agilent	מודל סטנדרטי
חמאמה6000 טס FDSS	Hamamatsu		הדמית קינטי צלחת קורא