안쪽 정류기의 칼륨 채널의 소형 분자 변조기에 대한 높은 처리량 검사

요약

안쪽 정류기의 칼륨 (Kir) 높은 처리량 화합물 심사에 대한 채널의 활동을 측정하기위한 양적 형광 분석을 개발하고 검증하기위한 방법이 제공됩니다.

초록

안쪽 정류기의 칼륨 (Kir) 채널 가족의 특정 구성원은 고혈압, 심방 세동과 통증 ^1,2 등의 질환의 다양한에 대한 약물 목표를 postulated 있습니다. 대부분의 경우, 그러나, 자신의 치료 가능성이나 기본적인 생리 기능을 이해하는 방향으로 진행 좋은 약리 도구의 부족에 의해 느려졌습니다. 사실, 안쪽 정류기 제품군의 분자 약리학 훨씬 nanomolar 화성과 매우 선택적 펩타이드 독소의 변조기의 번호가 ³ 발견되었습니다 된 전압 개폐 칼륨 (KV) 채널의 S4 superfamily의 뒤에 느껴지있다. 벌 독이 독소의 tertiapin 및 파생 ^4,5 Kir1.1와 Kir3 채널의 강력한 억제제하지만, 펩티드는 실험적으로 therapeutically뿐만 아니라 제한된 용도의 antigenic 속성과 가난한 생체 이용률, 신진 대사 안정성과 조직 penetrance로 인해 수 있습니다. 강력한 개발향상된 약리 특성을 가진 선택적 작은 분자 프로브는 완전히 생리학과 Kir 채널 치료 가능성을 이해하는 열쇠가 될 것이다.

학술 과학자들은 더 나은 약리학 ⁶ 필요로하는 분자 표적 및 신호 전달 경로에 대한 프로브 발견 캠페인을 시작하기 위해 국립 보건원에서 지원하는 분자 도서관 프로브 제작 센터 네트워크 (MLPCN (주) NIH) 공통 기금은 기회를 만들었습니다. MLPCN는 연구자에게 산업 규모 검진 센터, 의약 화학, 정보학은 유전자와 유전자 네트워크의 기능을 명료하게하다하는 작은 분자 프로브를 개발 지원에 대한 액세스를 제공합니다. MLPCN에 항목을 얻을의 중요한 단계는 높은 처리량 검사 (HTS)에 대한 의무입니다 강력한 대상 또는 경로 별 분석의 개발입니다.

여기, 우리는 형광 기반의 탈륨 (TL ⁺⁾ 자속 assa을 개발하는 방법에 대해 설명합니다높은 처리량 화합물 심사 ^7,8,9,10에 대한 Kir 채널 기능의 y는. 분석은 K의 투자율 ⁺ K ⁺ congener TL ^+에 채널 기공을 기반으로합니다. 상업적으로 이용 가능한 형광 TL ⁺ 기자 염료가 모공을 통해 TL의 transmembrane 유량을 ⁺ 감지하는 데 사용됩니다. BTC, FluoZin-2 및 FluxOR ^7,8 : TL ⁺ 자속 assays에 적합 적어도 세 상업적으로 이용 가능한 염료가 있습니다. 이 프로토콜은 FluoZin-2를 사용하여 분석 개발에 대해 설명합니다. 원래 개발 및 아연 표시로 판매했지만, FluoZin-2 전시 TL시 형광 방출 ⁺ 바인딩에 강력하고 복용 종속적 인 증가합니다. 우리는 FluxOR는 ^7,8 사용할 수 등 ^9,10 할 계속하기 전에 FluoZin-2와 협력하기 시작했습니다. 그러나, 분석 개발 단계는 세 염료에 본질적으로 동일하며, 사용자는 자신의 특정 N에 가장 적합한 어떤 염료 확인해야합니다eeds. 우리는 또한 MLPCN에 항목으로 간주 할 수에 도달해야합니다 검정의 성능 벤치 마크에 대해 설명합니다. TL ^+는 쉽게 대부분의 K ⁺ 채널을 permeates 때문에, 분석은 대부분의 K ⁺ 채널 대상에 적용해야합니다.

프로토콜

1. 안정적인 Polyclonal 세포 라인의 생성

1. 관심 Kir 채널을 표현하는 고품질의 안정적인 세포 라인의 설립은 강력한 높은 처리량 검사 분석을 개발 대한 중요한 첫 걸음입니다. 제정 K ⁺ 채널 overexpression은 셀 사망 경로, 안정적인 세포 라인 변성 및 분석 성능의 손실의 활성화로 이어질 수 있습니다. 이러한 잠재적 인 문제를 방지하고 분석 개발을위한 편리한 내부 통제 (아래 참조)를 제공하기 위해 테트라 사이클린-inducible 표현 시스템은 ^8을 권장합니다.
2. 문화 부모의 T-렉스 - HEK293 B-중간 (DMEM 성장 매체 10 % FBS, 50 U / ML 페니실린, 50 μg / ML 스트렙토 마이신, 5 μg / ML Blasticidin S를 포함)에 표준 기술을 사용하여 셀. transfection하고 안정적인 클론 선택에 대한 초기 통로 세포를 (액체 질소 저장에서 해동부터 예 3-4 통로)를 사용하십시오.
3. 의 플레이트 4000000 T-렉스 - HEK293 세포75cm ² 플라스크 그래서 술병은 약 80 % 합류 다음 날입니다. 37 번 5 % CO ₂ 인큐베이터에서 밤 문화 ° C.
4. 제조업체의 프로토콜에 따라 10-15 pcDNA5/TO-Kir DNA의 μg 및 Lipofectamine LTX / 플러스 시약을 사용하여 셀을 Transfect. 5시간 후, B-중간으로 transfection 매체를 교체하십시오.
5. 24 시간 transfection 후, B-매체가 안정적인 클론 선택을 시작하기 250 μg / ML Hygromycin (BH-미디어)를 포​​함과 B-매체를 교체하십시오. 신선한 BH-매체마다 2-3일 세포를 먹이.
6. 세포의보다 큰 90 %는 안정적으로 transfected 세포의 작은 식민지 남겨두고, 다음 7 일 동안 죽을 것입니다. 식민지 확장에 대한 175cm ^두 플라스크에 분할하기 전에 추가 10~14일에 대한 성장 할 수 있습니다.
7. cryopreservation를 들어, 3을 동결 × 10 45 % 포함 미디어 ⁶ 셀 / ML BH-매체 45% 항생제 무료, 혈청 함유 DMEM와 10 %의 DMSO를 완비. 얼음이 얼다-80에서 잠을 자면 세포가 ° 셀 냉동 컨테이너의 C하고 장기 저장을 위해 액체 질소로 이동합니다. Invitrogen의 권장 프로토콜을 사용하여 액체 질소에서 세포를 해동. 그들이 처리시 75 % 합류보다 큰 술병에서 냉동하는 경우 세포의 생존 능력이 낮은됩니다.

2. 안정적인 단클론 세포 라인의 생성

1. 이가의 무료 HBSS와 안정 polyclonal 세포의 하위 합류 75cm ² 플라스크를 씻으십시오. 37 5 % CO ₂ 인큐베이터에서 3-5 분 동안 트립신과 배양 1 ML을 추가 ° C. 트립신의 활동을 억제하고 완전히 세포를 떼어 놓다하기 위해 (예를 들어, 5 회) 반복적으로 씹다하는 플라스크에 BH-미디어의 5 ML을 추가합니다. 조심스럽게 정지 거의 완전히 하나의 세포로 구성하기 위해 현미경으로 세포를 검사한다. 이 단클론 세포 라인을 얻을 가능성이 높아집니다.
2. 셀 밀도를 결정하고 희석20 μl 당 0.7 세포의 농도에 정지. BD PureCoat 아민 - 코팅 (또는 이에 상응하는 폴리-D-라이신 코팅) 384 잘 접시의 각도에 멀티 채널 pipettor, 세포 현탁액의 피펫 20 μl을 사용합니다. 원칙적으로, 우물의 70 %이 도금 조건으로 한 셀을 받아야합니다. 따라서, 384도 플레이트는 분석 200 개 이상의 클론을 포함해야합니다. 37 번 5 % CO ₂ 배양기에서 배양 세포를 ° C. 계속
3. 일주일 후, 하나의 식민지를 포함하는 우물에 대한 현미경으로 접시를 검사한다. 나중에 참조 할 수 있도록 영구 마커와 뚜껑에서 자신의 위치를​​ 확인합니다. 또한 참고 여러 식민지를 포함하는 우물을 제외해야합니다. 이러한 가장 쉽게 잘 여러 방면에서 성장 식민지의 모습으로 인정 받고 있습니다. 증발는 판의 가장자리 근처 우물에서 더 빨리 발생하는 경향이 있음에 유의해야합니다. 중요한 증발가 발생했습니다 우물에 BH-미디어를 추가 할 수 있습니다. 그렇지 않으면, 불필요한 t이다세포를 먹이 O.
4. 다음 7~10일 동안 더 자주 우물을 모니터링 할 수 있습니다. 셀 관심 우물이 50 % 이상 합류 할 때 분할 할 준비가 될 것입니다.
5. 384 잘 접시를 복사 할 셀을 분할, 문화의 단클론 선를 계속 TL ⁺ 자속과 다른과 시금 한 판. 관심 세포 라인을 포함하고있는 우물에서 매체를 대기음. 이가의 무료 HBSS로 세포를 씻어 잘 각 트립신의 20 μl를 추가하고 15-20 분 동안 37 ° C 배양기에 플레이트를 전송합니다. 세포 배양 후드로 다시 판을 이동 한 후, 각도에 BH-중간의 20 μl를 추가하고 세포를 떼어 놓다을 여러 번 씹다. 전지가 완전히 dissociated을 보장 할 수있는 현미경 아래에 우물을 검사합니다. 세포가 단단히 자기편 될 것 같은이, pipetting 여러 순찰을 요구할 수 있습니다. 세포 dissociated되면, 새로운 BD PureCoat 아민 - 코팅 (38)의 우물을 복제하기 위해 각각의 세포 현탁액의 10 μl를 전송번호판 4 - 잘. 물론 소스 사이의 관계를 유의하고 강력한 Kir 채널 활동을 (아래 참조) 전시 클론 원래 잘로 되돌릴 수 있도록 대상 우물을 복제해야합니다. 37 5 % CO ₂ 인큐베이터에서 남은 전지를 공급와 문화에서 그들을 계속 잘 원본 ° C.에 BH-중간의 20 μl를 추가합니다
6. 대상 플레​​이트의 세포가 준수 및 최대 주에 대한 성장 할 수 있습니다. 클론의 대부분은 적어도 50 % 합류에 도달하면, 그들은 TL을 사용하여 Kir 채널 활동에 대해 평가 할 수 있습니다 ⁺ 자속 분석은 아래에 설명했다.
7. 검정 전날은 문화 매체를 대기음 10 % dialyzed FBS를 포함하는 BH 미디어로 교체. 이 테트라 사이클린 오염 된 혈청에서 발생 할 수 부주의 채널 표현을 방지 할 수 있습니다. 1 μg / ML의 테트라 사이클린을 포함하여 각 복제에 대한 중복 우물 중 하나에 Kir 채널 식을 유도. 잘 uninduced 중복이 될 것입니다"배경"제어 할 수 있습니다. 다음 설명에 따라 TL ⁺ 플럭스 assays을 수행합니다.

3. 일반 TL ⁺ 플럭스 분석 절차

1. TL 전날 ⁺ 자속 실험은 세포를 해리와 섹션 2.1 및 2.2에 설명 된대로 세포 현탁액의 밀도를 quantitate. 판 20,000 단클론 전지는 안정적으로 열 Multidrop 콤비 또는 멀티 채널 pipettor을 사용하여 BD PureCoat 아민 - 코팅 384 잘 접시의 각 잘에 관심이 Kir 채널 유전자와 transfected. 도금 10 % dialyzed FBS를 포함하는 BH 매체를 사용하십시오. 일부 세포가 Kir 채널 식을 유도하는 데 1 μg / ML의 테트라 사이클린과 함께 밤새 배양 되오니, 이용에 참고하여, 다른 안 반면. 유도와 uninduced 셀의 위치는 실험의 각 유형에 차이가되며, 그림 1에 표시됩니다.
2. 다음 날, 세포가 자기편 있는지 확인하기 위해 현미경으로 접시를 검사하고 균일하게 바닥에 걸쳐 분산우물의. 우물은 80-90%의 합류해야합니다.
3. 20 μl 당 잘 20 밀리미터 HEPES를 포함하는 HBSS 분석 완충액으로 세포 배양 매체를 교체하고 NaOH로 pH를 7.3로 버퍼에 ELx405 Microplate 와셔를 사용하십시오. 또한, 사람은 한 접시가 반전과 폐기물 용기에 매체를 꺼낼 수 급격히 내려 부러하고 나머지 미디어를 제거하는 적층 종이 수건에 수색 했더니되고, "영화와 슬램"방법을 사용할 수 있습니다. 즉시 desiccating에서 세포를 방지하기 위해 판에 HBSS 검정 버퍼를 다시 추가 할 수 있습니다.
4. FluoZin-2를 준비, 염색로드 솔루션입니다. 간단히 튜브를 centrifuging 후, 무수 DMSO 100 μl에 FluoZin-2 분말의 50 μg을 분해. 이 시점에서 1000 X 주식 솔루션의 aliquots는 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. 때 사용할 준비가 완만 한 pipetting과 염료와 혼합에 볼륨 Pluronic F-127/DMSO 솔루션 당 20 %의 무게의 50 μl를 추가합니다. Pluronic F-127이 추가 된 후 같은 염료를 고정하지 마십시오낮은 온도는 계면 활성제가 용액에서 침전 될 수 있습니다. FluoZin-2의 150 μl 볼륨, HBSS 검정 버퍼의 AM/Pluronic-F127 100 ML를 추가하고 염색 로딩 버퍼를 만들기 위해 부드럽게 섞는다. Multidrop 콤비 또는 다중 채널 pipettor을 사용하여 HBSS 검정 버퍼의 각도 이미 포함 된 20 μl로 염색로드 버퍼의 20 μl를 추가합니다. 약 1 시간 (이것은 필요하다고 직접적인 증거가 없지만 일반적으로 부화가 어둠 속에서 수행 된)을 상온에서 세포를 배양.
5. 세포가 색소를로드하는 동안 TL ⁺ 자극 판을 준비합니다. 갓 1 ㎜의 황산 마그네슘 1.8 밀리미터 황산 칼슘, 5 MM 포도당, 10 밀리미터 HEPES, 12 MM TL ⁺ 황산을 포함하는 5 배 TL ⁺ 자극 버퍼의 50 ML에 나트륨 중탄산염의 0.5 g을 용해. 예를 들어, 솔루션 산도는 이산화탄소의 매우 좁은 범위와 손실 내에 보관해야합니다, 경우 또는 나트륨 중탄산염은 나트륨 글루 콘산로 대체 할 수 있습니다관심사입니다. 이산화탄소의 탈출을 제한하고 나트륨 중탄산염이 솔루션으로 될 때까지 여러 번 반전에 단단히 관 뚜껑. 멀티 채널 pipettor 사용하여 폴리 프로필렌 384도 플레이트 (표 1)의 각 우물 솔루션 50 μl를 추가합니다.
6. 세포 FluoZin-2와 함께로드 된 후, AM, ELx405 Microplate 세탁기와 접시를 씻거나 위의 섹션 3.3에 설명한 바와 같이, "영화와 슬램"방법을 사용합니다. TL의 종류 ⁺ 수행 할 자속 실험에 따라 다시 20 μl 또는 각도에 HBSS 검정 버퍼 40 μl를 추가합니다. 번호판은 이제 실험에 대한 준비가되어 있습니다.
7. 하마 마츠 기능 약물 검사 시스템 (FDSS) 또는 통합 액체 분배 기능을 갖춘 동급 운동 이미징 플레이트 리더로 전지 및 TL이 ⁺ 접시. 같은 Fluo-4와 같은 fluorescein / fluorescein 기반의 염료에 적합한 필터를 사용합니다.
8. 단일 추가 프로토콜을 설정 10 μl 5 배 TL 그 때문에 ⁺시리즈는 HBSS 검정 버퍼 40 μl를 포함하는 셀 플레이트의 해당 우물에 추가됩니다. 적어도 10 초에 1 Hz에서 샘플링 주파수에서 기록 기준 형광. 최적의 셀 도금, 세척, 염료 하중 조건을 설정하고 나면 잘 - 투 - 잘 형광은 한 접시에 걸쳐 균일하고 안정적​​이어야합니다. 통합 384 채널 pipettor 동시에 각도에 TL ⁺ 자극 버퍼를 추가하는 데 사용됩니다.
9. TL 형광의 ⁺ 유발 증가의 속도와 정상은 오프라인 분석을 위해 캡처 될 수 있도록 적어도 2 분에 대한 기록.

4. 최적 TL의 + 농도의 결정

1. TL ^+는 쉽게 가장 안쪽 정류기 K ⁺ 채널을 permeates. TL ⁺ 농도는 TL의 동적 범위를 초과하지 않도록하기 위해 ⁺ 기자 염료 FluoZin-2, 하나는 경험적으로 높은 t에 사용되는 최적의 TL ⁺ 농도를 확인해야합니다hroughput 화면. 우리는 채널이 maximally 활성화 조건에서 최대 형광 반응 (EC _80)의 80 %를 세상의 시작과 끝, TL의 ^{+ 농도를} 사용하는 것이 좋습니다.
2. 판, 염색 부하와 각도에 HBSS 검정 버퍼 40 μl를두고, 섹션 3에 설명 된대로 BD PureCoat 아민 - 코팅 또는 이에 상응하는 폴리-D-라이신 - 코팅 384 잘 접시에 세포를 씻어. 그림 1A, 열 1, A1-A23는 테트라 사이클린과 유도되지 않은, 따라서 관심의 Kir 채널을 표현하지 않는 셀을 포함해야합니다 행의 판지도에 표시된. uninduced 우물에서 FluoZin-2 형광 신호 등의 구명과 같은 내생 경로를 통해 TL ⁺ 자속의 수준을 결정하는 데 사용됩니다 ⁺ - 정상적으로 표현됩니다 K ^+-ATPase 펌프 및 전압 개폐 K ⁺ 채널, HEK- 293 세포.
3. 을 준비하는 pipetting 애질런트 브라보 자동 액체 처리 플랫폼 또는 수동을 사용HBSS 분석 버퍼에 11 점 TL ⁺ 농도 희석 시리즈. 일반적으로, 100 %에서 0.002 % TL ^+에 이르기까지 3 배 시리얼 희석 시리즈는 검정에서 평가됩니다. TL ^{+ 솔루션은} 최종 분석에 1시 5분을 희석되기 때문에 시리즈는 5 배 농도에서 구성해야합니다. 5 배 TL 1 ㎜의 황산 마그네슘 1.8 밀리미터 황산 칼슘, 5 MM 포도당과 10 밀리미터 HEPES를 포함하는 ⁺ 무료 버퍼와 제 3 항에 설명 된 표준 5 배 TL ⁺ 버퍼를 diluting하여 희석 시리즈를 준비합니다. 다시 말하지만, 신선한 그림 2A에 표시된 플레이트지도에 따라 384도 플레이트 폴리 프로필렌에 도금 직전 최종 TL ⁺ 버퍼의 50 ML에 나트륨 중탄산염의 0.5 g을 용해.
4. FDSS로 전지 및 TL ⁺ 자극 판을로드합니다. 10 μl 5 배 TL ⁺ 시리즈는 HBS의 40 μl를 포함하는 셀 플레이트의 해당 우물에 추가됩니다 있도록 단일 추가 프로토콜을 설정S 분석 버퍼. TL을 추가 ⁺ 판에 전에 10 초에 대한 기록 기준 FluoZin-2 형광. 결과의 재현성을 확립하기 위해 세 별도의 일에 실험을 반복합니다.

5. DMSO에 검정 감도의 결정

1. 높은 처리량 화면에서 심문을 작은 분자는 자체 분석의 성능에 영향을 미칠 수있는 유기 용매 디메틸 sulfoxide (DMSO)에 용해되어 있습니다. 따라서, DMSO에 분석의 감도가 처음 화면에서 허용 최고 DMSO 농도를 확립하기 위해 검사해야합니다.
2. 판, 염색 부하와 각도에 HBSS 검정 버퍼 20 μl를두고, 섹션 3에 설명 된대로 BD PureCoat 아민 - 코팅 384 잘 접시에 세포를 씻어. 전체 플레이트는 테트라 사이클린 (그림 3A)로 유도 된 세포를 포함해야합니다.
3. 11 점 D를 준비 pipetting 브라보 자동 액체 처리 플랫폼 또는 수동을 사용HBSS 검정 버퍼에 MSO 농도 희석 시리즈. 일반적으로 10 %에서 0.01 % V / V DMSO에 이르기까지 2 배 희석 시리즈는 검정의 활동 평가됩니다. DMSO 솔루션은 최종 분석에서 반으로 희석되기 때문에 시리즈는 2 배 농도에서 구성해야합니다. 희석 시리즈는도 3a에 도시 된 플레이트지도에 따라 384도 플레이트 폴리 프로필렌으로 도금해야합니다.
4. EC ₈₀ 또는 최적의 TL 섹션 4에서 결정 ⁺ 농도에 따라 5 배 TL ⁺ 자극 판을 준비합니다.
5. FDSS에 셀, DMSO와 TL ⁺ 자극 판을로드합니다. 배 농도 DMSO 시리즈의 20 μl은 HBSS 분석 버퍼 20 μl를 포함하는 셀 플레이트의 해당 우물에 추가됩니다 있도록 두 추가 프로토콜을 설정합니다. 셀이 화면 중에 작은 분자 차량에 노출 될 시간을 같은 양의 세포에 DMSO를 남겨주세요. 에 대한 기록 기준 FluoZin-2 형광적어도 10 초 셀 플레이트의 각도에 5 배 TL ⁺ 버퍼 10 μl를 추가하기 전에. 결과의 재현성을 확립하기 위해 세 별도의 일에 실험을 반복합니다.
6. 분석은 화합물은 10 μm의 농도에서 시험되는 전형적인 높은 처리량 화면에 최소 0.1 % V / V의 농도를 DMSO에 관대해야합니다.

6. 알려진 약리 변조기에 대한 분석 감도의 결정

1. 검정의 최적의 TL ⁺ 농도와 DMSO 허용 오차를 결정 후,이 효과는 검토해야 Kir 채널 매개 TL ⁺ 자속에 pharmacologically 활성 에이전트 알려져 있습니다. 실험의이 시리즈는 효능 자신의 모드 (예 : 활성, 억제)을 기반으로 화합물을 분류하고, 나중에 사용하도록 잘 행동 제어 화합물을 식별 할 수들이 힘, 능력에 따라 순위가 주문 화합물에 대한 분석의 감도, 능력을 평가할 수있을 것입니다 검정 Development와 화면.
2. 판, 염색 부하와 각도에 HBSS 검정 버퍼 20 μl를두고, 섹션 3에 설명 된대로 BD PureCoat 아민 - 코팅 384 잘 접시에 세포를 씻어. 열 1 행 A1-A23는 테트라 사이클린 (그림 4A)로 유도되지 않은 세포를 포함해야합니다.
3. HBSS 검정 버퍼의 알려진 변조기의 11 점 농도 희석 시리즈를 준비 pipetting 브라보 자동 액체 처리 플랫폼 또는 수동을 사용합니다. 일반적으로, 100 μM에서 2 NM에 이르기까지 3 배 희석 시리즈는 검정의 활동 평가됩니다. DMSO 솔루션은 최종 분석에서 반으로 희석되기 때문에 시리즈는 2 배 농도에서 구성해야합니다. 희석 시리즈는 그림 4A에 도시 된 플레이트지도에 따라 384도 플레이트 폴리 프로필렌에 세중의에 도금해야합니다. dilutions가 최종 DMSO 농도는 약물 치료와 덜 THA 사이에 동일 것과 같은 변경되어 있는지 확인하십시오 n 또는 제 5 항에 정의 된 최대 허용 DMSO 농도와 동일.
4. 섹션 4에서 결정 최적의 TL ⁺ 농도에 따라 5 배 TL ⁺ 자극 판을 준비합니다.
5. FDSS에 전지, 화합물 및 TL ⁺ 자극 판을로드합니다. 20 μl 2 배 농도 화합물 시리즈는 HBSS 분석 버퍼 20 μl를 포함하는 셀 플레이트의 해당 우물에 추가됩니다 있도록 두 추가 프로토콜을 설정합니다. 셀 플레이트에 화합물을 추가하고 최대 20 분까지에 품다. 배경 비율에 가장 좋은 신호를 감지 할 수있는 화합물에 대한 최적의 부화 시간이 몇 다른 배양 시간이 선택됩니다 일련의 실험을 실행하여 결정 할 수 있습니다. 셀 플레이트의 각도에 5 배 TL ⁺ 버퍼 10 μl를 추가하기 전에 적어도 10 초 동안 기록 기준 FluoZin-2 형광. 결과의 재현성을 확립하기 위해 세 별도의 일에 실험을 반복합니다.

_title "> 7. 바둑판 분석

1. 실험의 다음 시리즈에서 분석의 균일 성과 재현성은 "바둑판"분석을 사용하여 평가됩니다. 그림 5A와 같이 일반적으로, 제어 억제제는 384 잘 접시의 각 열 및 행의 다른 모든 우물에 도금되어 있습니다. 엄격한 검정의 소음을 평가하기 위해 억제제 EC ₈₀ 농도를 사용해야합니다. DMSO는 차량 제어와 같은 다른 우물에 추가됩니다. 의 TL ⁺ 자속 DMSO 및 약물 처리 전지는 Z 프라임, 우물의 두 인구 중 잘 - 투 - 잘 다양성의 통계 측정에 대한 값을 계산하는 데 사용됩니다. Z 총리는 공식을 사용하여 계산된다 :
   Z 프라임 = 1 - (3SD _P + 3SD _N) / | 의미 _P + _N을 의미 |
   SD는 표준 편차이고, P는 자유로운 유량이며, N은 완벽하게 자속 값을 저해하고 있습니다. 3 별도의 일에보다 크거나 0.5 동일한 Z '값 분석은 S 간주됩니다높은 처리량 검사에 대한 uitable.
2. 판, 염색 부하와 각도에 HBSS 검정 버퍼 20 μl를두고, 섹션 3에 설명 된대로 BD PureCoat 아민 - 코팅 384 잘 접시에 세포를 씻어. 전체 판은 테트라 사이클린과 유도해야합니다.
3. 멀티 채널 pipettor를 사용하여 384도 폴리 프로필렌 판에 pipetting하여 화합물 / DMSO 판을 μl / 잘 대상 Kir 섹션 6.5에서 결정된 농도의 채널, 0.1 % V / V DMSO의 알려진 억제제의 80 차량은 그림 5A에 표시. 최대 잘 B24에 멀티 채널 pipettor 잘 B2 등으로 대체를 사용하여 잘 A1부터 알려진 억제제를 추가합니다. DMSO 잘 A24에에 그렇게까지 ​​잘 B1에서 시작하여과이 절차를 반복합니다. 판의 최종 레이아웃은 바둑판의 일치해야합니다.
4. 최적의 TL을 기반으로 5 배 TL ⁺ 자극 판 ⁺ 섹션 4에서 결정을 준비합니다.
5. 전지, 화합물 및 T로드리터 ⁺ FDSS에 자극 접시합니다. 20 μl 2 배 농도 화합물 시리즈는 HBSS 분석 버퍼 20 μl를 포함하는 셀 플레이트의 해당 우물에 추가됩니다 있도록 두 추가 프로토콜을 설정합니다. 셀 플레이트에 화합물을 추가하고 최대 실온에서 20 분에 품다. 셀 플레이트의 각도에 5 배 TL ⁺ 버퍼 10 μl를 추가하기 전에 적어도 10 초 동안 기록 기준 FluoZin-2 형광. 결과의 재현성을 확립하기 위해 세 별도의 일에 실험을 반복합니다.

8. 파일럿 화면

1. 분석 개발의 마지막 단계에서 대규모 높은 처리량 화면에 결국 사용됩니다 조건 하에서 분석의 성능을 평가하기 위해 몇 천 화합물의 시험 화면을 수행합니다.
2. 각 우물에 HBSS 검정 버퍼 20 μl를 떠나지 플레이트, 염색 부하 및 제 3 항에 설명 된대로 BD PureCoat 아민 - 코팅 384 잘 접시에 세포를 씻어).전체 플레이트가 Kir 채널 식을 유도하기 위해 테트라 사이클린과 함께 밤새 배양해야합니다.
3. 테스트 할 약 2,000에서 3,000 구조적으로 다양한 화합물을 선택합니다. 그것은 종종 적절하고 잠재적으로 이온 채널 변조기에 대한 풍부한 알려진 활동과 화합물 컬렉션을 사용하기 편리합니다. 이러한 컬렉션은 스펙트럼 컬렉션 (MicroSource)와 LOPAC 컬렉션 (시그마)가 포함되어 있습니다. 또한, 파일럿 화면에서 관심 Kir 알려진 변조기를 포함 신중한 것입니다. 이상적으로이 화합물은 나중에 설명 히트 따기 방법의 편견 테스트를 수 있도록 눈을 멀게 패션에 우물에 추가됩니다. 대상 플레​​이트에 MLPCN 수집 (소스 판)에서 DMSO의 선택 화합물의 적절한 볼륨을 전송하는 Labcyte 에코 액체 처리기 또는 적절한 핀 도구를 사용하여 384도 폴리 프로필렌 판 (대상 플레​​이트)에 화합물을 준비하는 시험 화합물이 있습니다 열만 3-22에서,열 1, 2, 23의 모든 다른뿐만에서는 24 제 7 항에서 결정 완전히 Kir을 억제하는 것으로 알려진 농도에 알려진 억제제를 추가 할 수 있습니다. 열 1, 2, 23, 24의 나머지 우물에서 DMSO 농도가 검색 차량 컨트롤을 생성하기 위해 DMSO의 적절한 볼륨을 추가 할 수 있습니다. Multidrop 콤비를 사용하여 분석 완충액으로 모든 우물을 희석. 일반적으로 시험 화합물은 2 배의 대상 심사 농도 위 20 μM이 될 것입니다.
4. 섹션 4에서 결정 최적의 TL ⁺ 농도에 따라 TL ⁺ 자극 판을 만듭니다.
5. 파일럿 화면을 실행합니다. 파일럿 심사 실행에 플레이트들 사이 일관된 타이밍을 유지하기 위해 프로토콜의 실행 단계를 비틀하는데주의를 기울여야.
6. 파일럿 화면이 완료되면 Z-프라임 방정식을 사용하여 열을 1, 2, 23, 및 24에서 바둑판 우물를 분석합니다. 제어 인구의 가난한 분리의 원인을 결정하기 위해 이하 0.5의 Z-주요 값을 표시 번호판을 검사합니다. 조회수는 B 수e는 방법 번호를 사용하여 선택했습니다. 파일럿 화면의 경우는 차량 제어 인구의 평균과 표준 편차를 계산하고> / = 3 표준 편차 차량 컨트롤의 평균에서 값을 생산 우물에 따라 조회를 선택하는 것이 일반적입니다.
7. 히트 따기 후,의 재시험 선택한 조회수 플레이트 2 세트에서 중복. 접시 중 하나 세트는 테트라 사이클린과 다른 하나는 테트라 사이클린의 존재에 안정적으로 Kir 셀 라인을 포함의 부재에서 안정적인 Kir 세포가 포함되어 있습니다. 두 재시험 플레이트의 적어도 하나의 긍정적 인 재시험 및 uninduced 접시에 중요한 활동을 보여 실패로 간주 될 수 있다는 조회수가 안타를 확인했습니다. 검색된 얼마나 많은 '숨겨진'컨트롤 샘플 확인하기 위해 검증 된 히트 목록을 검사합니다. 파일럿 화면에 컨트롤을 감지하지 않으면 심사 또는 히트 따기 매개 변수의 추가 최적화에 대한 필요성을 나타냅니다.

결과

테트라 사이클린-inducible 표현 시스템의 사용은 내생 경로와 관심 Kir 채널을 통해 TL ⁺ 자속을 구별하기에 편리한 내부 통제를 제공합니다. 그림 1 쇼 실험의 다른 유형에 사용되는 셀 도금지도의 예. uninduced 또는 테트라 사이클린 - 유도 세포를 포함하는 우물의 위치는 서로 다른 색상으로 표시됩니다. 그림 2A는 분석 개발과 화합물 심사에 대한 최적의 TL ⁺ ...

토론

데이터 치료 : 일단 데이터가 분석에 일반적인 단계는 실험, F ₀ 초에 초기 값으로 각도의 형광 반응, F를 정규화, 포함한다 수집하고 있습니다. 이것은 일반적으로 "정적 비율"로 지칭하고 "F / F ^{_{0"상징합니다.}} F ₀ 표시기 염료에 의해 ​​지배되는 경우에는 정적 비율 작업이 실질적으로 같은 조명, 신호 컬렉션에 disuniformities 등 여러 요인...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
pcDNA5/TO	Invitrogen	V1033-20	테트라 사이클린-inducible 표현 벡터
T-렉스 - HEK293 세포	Invitrogen	R71007	테트라 사이클린-inducible 세포 라인
Lipofectamine LTX / 플러스 시약	Invitrogen	15338100	Transfection 시약
FBS	애틀랜타 체액	S11550	세포 배양 미디어
DMEM	Invitrogen	11,965	세포 배양 미디어
Hygromycin B	Invitrogen	10687-010	세포 배양 미디어
Blasticidin S	Invitrogen	R210-01	세포 배양 미디어
페니실린 / 스트렙토 마이신	Invitrogen	15,140	세포 배양 미디어
무료 HBSS - 이가의	Mediatech	21022CV	셀 세척
트립신 - 0.25 %	Mediatech	25053CI	세포 분리
테트라 사이클린-HCL	시그마	T9823	유도 시약
Dialyzed FBS	애틀랜타 체액	S12650	도금 미디어
FluoZin-2	Invitrogen	F24189	형광 염료
Pluronic F-127	Invitrogen	P-3000MP	염료로드
HBSS	Invitrogen	14,175	검정 버퍼
HEPES	Invitrogen	15,630	검정 버퍼
NaHCO 3	시그마	S6297	TL + 자극 버퍼
MgSO 4	시그마	M2643	TL + 자극 버퍼
카소 4 • 2H 2 O	시그마	C3771	TL + 자극 버퍼
D-포도당	시그마	G7528	TL + 자극 버퍼
탈륨 황산	올드리치	204625	TL + 자극 버퍼
HEPES	시그마	H4034	TL + 자극 버퍼
DMSO	시그마	D4540	용제
여덟 채널 전자 pipettor	Biohit	E300	384에서 셀 도금 -잘 접시
BD PureCoat 아민 - 코팅 384 잘 접시	BD Biosciences	356719	검정 microplates
에코는 384 자 폴리 프로필렌 microplate (384PP)를 자격	Labcyte	P-05525	합성 소스 microplates
384도 폴리 프로필렌 microplates	Greiner 바이오 하나	781280
Multidrop 콤비 시약 디스펜서	열 과학	5840300
ELx405 microplate 와셔	BioTek	ELx405HT	자동 셀 세척
액체 처리기를 반향	Labcyte	Labcyte 에코 550
브라보, 자동화 된 액체 처리 플랫폼	애질런트 테크놀로지스	표준 모델
Hamama츠 FDSS 6000	하마 마츠		운동 이미징 플레이트 판독기