A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
בפרוטוקול זה, אנו מעדכנים את ההתקדמות האחרונה בתחום ההדמיה Ca 2 + אותות של נוירונים GFP-tagged בפרוסות רקמת המוח באמצעות ניאון אדום Ca 2 + מחוון צבע.
למרות גידול עצום בידע שלנו על את המנגנונים בבסיס הקידוד של מידע במוח, שאלה מרכזית בנוגע לצעדים המולקולריים המדויקים, כמו גם את פעילותם של תאי עצב ספציפי בגרעינים רבים תפקודיים של אזורי מוח כגון ההיפותלמוס יישאר. בעיה זו כוללת זיהוי של המרכיבים המולקולריים המעורבים בוויסות של מפלי העברת אותות neurohormone שונים. גבהים של Ca 2 + התאי לשחק תפקיד חשוב בויסות הרגישות של תאי עצב, היא ברמה של העברת אותות ובאתרים סינפטיים.
כלים חדשים צמחו כדי לסייע בזיהוי נוירונים במספר העצום של תאי עצב במוח בהבעת חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת השליטה של אמרגן מסוים. כדי לפקח גם מרחב ובזמן גירוי-Induced Ca 2 + תשובות בGFP בתיוג נוירונים, שאינו ירוק זרחני Ca 2 + מחוון הצבע needs לשמש. בנוסף, מיקרוסקופיה confocal היא שיטה מועדפת של נוירונים בודדים בפרוסות הדמית רקמות בשל היכולת לדמיין נוירונים במטוסים שונים של עומק בתוך הרקמה ולהגביל פלואורסצנטי מחוץ לפוקוס. Ca 2 + ratiometric המחוון Fura-2 כבר בשימוש בשילוב עם ה-GFP מתויג-1 תאי עצב. עם זאת, הצבע הוא נרגש על ידי אור אולטרה סגול (UV). העלות של הליזר ואת עומק החדירה האופטי המוגבל של אור UV הפריעה את השימוש בו במעבדות רבות. יתר על כן, GFP פלואורסצנטי עלול להפריע Fura-2 האותות 2. לכן, החלטנו להשתמש בניאון אדום Ca 2 + צבע מחוון. השינוי הענק של הסטרוקס Fura אדום מאפשר ניתוח ססגוני של הקרינה האדומה בשילוב עם ה-GFP באמצעות אורך גל עירור יחיד. בעבר היו לנו תוצאות טובות באמצעות Fura אדום בשילוב עם ה-GFP-tagged נוירונים ריח 3. הפרוטוקולים לפרוסות רקמת הרחה נראים עובדים דוארqually גם בנוירונים ההיפותלמוס 4. Fura האדום מבוסס Ca 2 + הדמיה הייתה גם שלב בהצלחה עם β-תאי ה-GFP-tagged לבלב ואת הקולטנים של GFP מתויג-מתבטאים בתאי HEK 5,6. גחמה קטנה של Fura האדום היא שעוצמת הקרינה שלה ב 650 ננומטר מקטינה פעם המחוון נקשר סידן 7. לכן, הקרינה של נוירונים מנוחה עם Ca נמוך + 2 יש ריכוז עצמה גבוהה יחסית. יש לציין, כי אחרים האדומים Ca 2 +-צבעי חיווי קיימים או כרגע בשלבי פיתוח, שעשוי לתת תוצאות טובות יותר או שיפור בנוירונים שונים ואזורים במוח.
1. הכנה ופתרון agarose ג'ל
שם מגיב | נוטריקון | מול. משקל | קונצרט כלשהו. | חברה | חתול. N ° |
נתרן כלורי | NaCl | 58.44 ג'/ mol | 120 מ"מ | VWR | 27810 |
<פחם נתרן מימן/ Td> | 3 NaHCO | 84.01 ג'/ mol | 25 מ"מ | מרק | 106329 |
אשלגן כלורי | KCl | 74.55 ג'/ mol | 5 מ"מ | מרק | 104936 |
BES * | ג 6 15 H NO 5 S | 213.25 g / mol | 5 מ"מ | סיגמא | 14853 |
מגנזיום סולפט, נטול מים | MgSO 4 | 120.37 g / mol | 1 mM | סיגמא | M7506 |
dihydrate סידן כלוריד | CaCl * 2H 2 O | 147.02 g / mol | 1 mM | מרק | 102382 |
monohydrate D (+)-גלוקוז | C 6 H 12 O 8 * H 2 O | 198.17 g / mol | 10 mM | מרק | 108342 |
*חומצת N, N-Bis (2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonic
2. נתיחה של מוח העכבר
אנא ודא כי כל הליכי בעלי החיים הניסיוניים מבוצעים בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי ועדות רווחת בעלי החיים של המוסדות המתאימים.
3. חיתוך סעיפי ההיפותלמוס עטרה של מוח העכבר
4. הכנת Ca 2 + פתרון מחוון דאי טוען
שלב קריטי בנוירונים טעינה נותר לעתים קרובות בריאות של התאים אשר תלוי במידת הניזק שנגרמה על ידי והמהירות שלהליך הנתיחה. צעד חיוני נוסף נראה שיש פתרון ה-F-127 (ראה 4.1) השימוש בPluronic הטרי. זה להיות מומלץ כדי להפוך את הפתרון הזה במעבדה ולא להשתמש בפתרון premade מספק. תלויה בטמפרטורה, הלחות וחיי המדף של Pluronic F-127 הפתרון, שציינו שפלה של תאי עצב הרחה והמוח במהלך Ca 2 + הליך טעינה.
5. מיקרוסקופיה וניתוח
בפרוטוקול זה, עוצמת הקרינה של ה-GFP, המזהה את התא של עניין, ושל Ca 2 + מחוון הצבע תהיה ניתן למדוד בו זמנית בפרוסות מוח. לפיכך, confocal מיקרוסקופ צריך להיות מצויד בליזר הנכון, מסננים ושני צינורות מכפילים לאסוף emissi 2על אותות. GFP והשינוי בעוצמת קרינה של Fura אדום ניתן למדוד באמצעות אורך גל עירור יחיד של 488 ננומטר. פלואורסצנטי הפליטה מfluorophores ניתן נאסף באמצעות 522/DF35 ננומטר סינון לGFP ומסנן ארוך לעבור לאורכי גל גדולים מ 600 nm לFura אדום.
Ca 2 + אותות יכולים להיות מוצגים כיחידות קרינה שרירותיות או כערכים (ΔF / F) של השינוי היחסי בעוצמת קרינה (ΔF) המנורמלת פלואורסצנטי תחילת המחקר (F). תוצאת ההליך בסטייה שלילית כאשר התאית Ca 2 + עליית הריכוז באמצעות Fura אדום כצבע מחוון Ca + 2. כדי להקל על הפרשנות של התוצאות, אנו ממליצים הכפלת ערכי ΔF / F עם -1 לקבל אותות קרינה חיוביים כדי להציג עלייה בCa 2 + (האיור 4C).
כדי להשוות את התוצאות בין הנוירונים משרעת והתדירות של Ca 2 + אותות בדרך כלל מנותחים. עם זאת, חלק 2 אותות + Ca אינם מתרחשים בתקופה רגילה או אמפליטודות דומה. כמה אותות עשויים להיות מושפעים במידה רב על ידי תהליכים סטוכסטיים בתוך התא. לכן, כדי לכמת את סך השינוי בCa 2 + בתא נתון וכדי לאפשר השוואה של Ca 2 + תגובות בין תאי עצב באזורים שונים של מוח, ניתוח של שטח, שמתחת לעקומה (AUC) מתאימות יותר. צעד זה עבור הסכום של Ca 2 + מקיף כל Ca 2 + ראשוני, שלבים חולפים שניים וספג גבוהות Ca 2 + תגובות ותנודות. במקרה זה טיפול יש לנקוט כדי לנתח את אותה תקופת זמן כדי לאפשר השוואה בין הנוירונים.
6. נציג תוצאות
כדי להתחיל אפיון הקולטן גונדוטרופין ההורמון משחרר (GnRHR) מבטא הנוירונים ביפותלמוס עשינו שימוש בעכברים מהונדסים שמביעים GFP לאחר exci Cre בתיווךשיאון בGnRHR-להביע תאי עצב 4,11. הנוירונים GFP ניאון זוהו באזורים שונים במוח, כולל ההיפותלמוס. כדי לחקור את התכונות הפיזיולוגיות של נוירונים GnRHR אלה, נרשמו לראשונה Ca 2 + אותות בפרוסות ההיפותלמוס באמצעות מיקרוסקופ confocal. ראשון, השיגו פרוסות מוח עטרה מעכברים אלו תוך שימוש בפרוטוקול שתואר לעיל. איור 1 מדגים את הכלים, חומרים וצעדים לגוזמים את מוח עכבר הכרחיים. את פרוסות המוח ההיפותלמוס העטרה נחתכו (איור 2) ולאחר מכן העמיסו על פי השלבים בנקודה 4 לפרוטוקול. פרוסה אחת של מוח האזור המתאים מוצבת בחדר הקלטה, מאובטחת עם נבל (איור 3) ולאחר מכן צלם באמצעות מיקרוסקופ confocal (ראה שלבים 5.1-5.9). איור 4 מראה דוגמה של שתי פרוסות מוח עטרה בודדות מזהות אחת גופי תא GnRHR-τGFP, הקרינה במנוחה לאחר loadinגרם פרוסת המוח עם fura-red/AM ותמונת confocal הממוזגת המציין כי GFP נוירון לקח את Fura האדום מספיק כדי לאפשר חקירה של גירוי-Induced Ca 2 + אותות בתאים אלה. שימוש בפרוטוקול שלנו בתחילה בדקו האם נוירונים GnRHR לנצל דומים Ca 2 + אותות לזיהוי גירוי באזורים שונים של ההיפותלמוס בתגובה להפעלה ישירה עם GnRH (4E איור). עם זאת, אותות אלה היו שונים בצורת הגל שלהם תלויה בעוצמת גירוי ו4 אזור במוח. כדי לכמת את השינוי בדינמיקה של Ca 2 + תשובות, אזור-תחת העקומה (AUC) ניתן לחשב כמדד לעלייה בCa התאי 2 + (4E איור) 4. לימודים הם כרגע בעיצומו לחקור את הבסיס המולקולרי העומד בבסיס את 2 + Ca גלים ותנודות, בתלותן במין והמצב ההורמונלי של בעלי החיים, והאם הם יכולים להיות מווסתיםעל ידי גירויים טבעיים אחרים.
איור 1. כלים, חומרים וצעדים לגוזמים את מוח עכבר. א כלים וחומרים המשמשים לנתיחת מוח: 1, 406 Loctite דבק מגע, 2, מרית כפית מייקרו, 3, סכין גילוח קצה אחד; 4, מספרי האביב קטנים ובינוניים, 5, מלקחיים קהים; 6, מספריים; 7, צלחת פטרי המכילים אגר ג'ל לחסום; 8, צלחת בסיס להרכבה לתוך מוח microtome. BF. תמונות של כמה צעדים שמתוארים בשלב 2 של הפרוטוקול. תמונה ב 'של ראש עכבר מציין את מיקום החיתוך של הקרקפת (קו אדום) וחיצים (כתום) המצביעים על הכיוון צריך להיות מורם העור מהעצם (ראה שלב 2.4). תמונת ג ראש העכבר לאחר העור התרחק מראה את מבני העצם (ראה שלב 2.4). חיתוך כיוון המספריים והכיוון שלפרץ את הגולגולת עם מלקחיים הבוטים מצוין עם או השחורמקווקו חיצים או חיצים רחבים אפורים, בהתאמה. תמונת ד של מוח העכבר לאחר חיסול מבני העצם השונים (ראה שלב 2.5-2.7). תמונת א 'של ההסרה של המוח עדיין מחוברת לגולגולת באמצעות עצבי הגולגולת. צילום של פ מוח עכבר יחסית לא נפגע.
איור 2. חיתוך של חלקים ההיפותלמוס עטרה של מוח העכבר. א לצלם מציין את המיקום של סכין גילוח קצה אחד לחיסול המוח הקטן (ראה שלב 3.1). קבוצה ב 'של בלוק ג'ל אגר ביחס למוח הודבקה baseplate של microtome (ראה שלב 3.2). חיתוך של פרוסת המוח ג עטרה (יציין כאן את מיקומו של מוח ובעמדות לחסום ג'ל בהקשר ללהב החיתוך של microtome; ראה שלב 3.4.). ד, הגבה; v, גחון.
איור 3. פרוסת המוח ממוקמת בתא הקלטה., B. סקירה () וגבוהה יותר גדלה (ב) לתא וורנר מכשירי RC-27 פתוח אמבטית הקלטת מתן גישה רחבה לאזורי ההיפותלמוס של פרוסת מוח העטרה (ראה שלב 5.1). נבל מתכת בצורת פרסה המכיל ג מערכים מקבילים של חוטי ניילון שמחזיקים את הפרוסה בעמדה בחדר ההקלטה (ראה שלב 5.2).
איור 4. Ca 2 + אותות בתאי עצב τGFP של פרוסות מוח ההיפותלמוס עכבר. מודעה. זיהוי של ה-GFP נוירון ורכישה סימולטנית של קרינת Fura האדום בפרוסות מוח עכבר עטרה. תמונת Confocal א פרוסת מוח עטרת זיהוי GnRHR-τGFP הנוירונים (ירוק). ב 'אות פלואורסצנציה אחידה יחסית (אדום) של האזור במוח שמוצגת בנצפה לאחר טעינה פרוסת המוח עם fura-red/AM. ג Merged תמונה מראה Neurons מתואר בעמוס Ca 2 + מחוון צבע (צהבהב). גבולות GFP נוירון somata מסומנים בקווים לבנים מקווקוים, ואילו דוגמאות של 2 somata הלא GFP (חיצים) מסומן בקווים אפורים. ד דוגמה של GFP ותא עצב אינו GFP עם כמויות גדולות יותר של קרינה אדומה בהשוואה לרקע. דוגמאות של E. סומטי גירוי-Induced Ca 2 + תגובות נוירונים בודדים GFP-tagged באזורי מוח ההיפותלמוס שונים (PE גרעין, periventricular; ההיפותלמוס DM, dorsomedial; ארק, גרעין מקושת). אזור-תחת העקומה (AUC) מתוארת על ידי האזור האדום. ברור Ca 2 + אותות בין GnRHR-להביע נוירונים מגרעיני ההיפותלמוס שונים ניתן להשוות באמצעות AUC כאומדן לשינוי המוחלט בCa 2 + בתא נתון באותה התקופה. ציורי פ Schematic ודיאגרמות המצביעים על מיקומם של הנוירונים GFP המתויג-נתחו בע"א עליון: פנל. מיקום של המוח של עטרהection המכיל אזורי מוח ההיפותלמוס (קו אדום) מזרח ופנל תחתון:. ציור סכמטי של פרוסת מוח (באמצע) וגדלה של האזור התאגרף האדום שלו (פנל תחתון) מצביעה עם נקודות אדומות מיקום המשוער של הנוירונים GFP המתויג המוקלטים מ PE, DM וארק מוצג בדואר; האזור שחור בתכנית פנל תחתונה: 3 rd חדר לב. תרשימי 2 נמוכים מעובדים מPaxinos ו12 פרנקלין. מספר הפינה שמאלי תחתון מציין את המרחק (מ"מ) מגבחת.
שאלה מרכזית בחקר המוח היא להבין כיצד המוח מעבד מידע חברתי. מקור עיקרי של מידע נחוץ להכרה חברתית מקודד על ידי אותות ריח או מושכים. זיהוי של אותות אלה על ידי אוכלוסיות עצביות באף ומההכרה של האותות במוח, בעיקר ההיפותלמוס, לשחק תפקיד מפתח בתהליכים חברתיים רבים והורמוני הש...
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
אנו מודים לחברינו שהשתתפו ביצירתו סכמו כאן. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מForschungsgemeinschaft דויטשה (SFB 894), "הניתוח אינטגרטיבי של olfaction 'DFG Schwerpunktprogramm 1392 ועל ידי פולקסווגן הקרן (TLZ). TLZ הוא פרופ 'ליכטנברג של פולקסווגן הקרן.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
שם | חברה | חתול. N ° | |
אגר | סיגמא | A1296 | |
Fura-red/AM | Invitrogen | F-3021 | |
Pluronic F-127 | סיגמא | P2443 | |
sulfoxide דימתיל | הפישר סיינטיפיק | BP231 | |
רטט-Blade Microtome השפן V 50 | Zeiss | 9770170 | |
קירור ההתקנים CU 65 לMicrotome שפן V 50 | Zeiss | 9920120 | |
O 2 / CO 2 חממה, CB210-UL | כורך | 0019389 | |
סופר דבק, Loctite 406TM | Henckel | 142580 | |
מריות כפולות, צורת כפית | Bochem | 3182 | |
מריות Microspoon, צורת כפית | Bochem | 3344 | |
מספרי האביב, מוריה-Vannas-וולף - להבי 7mm | כלי מדע פיין | 15370-52 | |
מספרי האביב, Vannas - להבי 3mm | כלי מדע פיין | 15000-00 | |
מספריים וגנר | כלי מדע פיין | 14071-12 | |
רפואי מלקחיים, 7b דומון | כלי מדע פיין | 11270-20 | |
הלשכה גדולה מלבנית פתוחה אמבטיה (RC-27) | וורנר מכשירים | 64-0238 | |
זיו BioRad מיקרוסקופ confocal 2100 | Zeiss | נה |
There was a typo in the abstract of Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices.
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved