Hypothalamic 마우스 뇌 슬라이스의 GFP 태그 뉴런의 영상 칼슘 응답

요약

이 프로토콜에서는, 우리는 영상 칼슘의 최근 진행 상황을 업데이트 ^{2 + 신호 2 + 표시기 염료.}

초록

뇌의 정보의 인코딩, 정확한 분자 단계뿐만 아니라 시상 하부가 남아 같은 뇌 영역의 다기능 핵에서 특정 뉴런의 활동에 관한 중요한 질문에 근간이 메커니즘에 대한 우리의 지식에 엄청난 증가에도 불구하고. 이 문제는 여러 neurohormone의 신호 전달 폭포의 규정에 관련된 분자 구성 요소의 식별이 포함되어 있습니다. 세포 내 칼슘 ^2의 고도는 ⁺ 두 신호 전달의 수준과 신경 사이트에서, 뉴런의 감도를 조절에 중요한 역할을한다.

새로운 도구는 특정 발기인의 통제하에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하여 뇌 뉴런의 무수한에서 뉴런을 식별하는 데 도움 등장했습니다. 모두 spatially 및 시간적 자극 - 유도 모니터링하려면 ^칼슘이 GFP 태그 뉴런, 비 녹색 형광 칼슘 ^{2 +} 지표 염료 N의 ⁺ 응답eeds는 사용할 수 있습니다. 또한, 공 촛점 현미경은 조직 내에서 깊이 독특한 비행기에서 뉴런을 시각화하고 밖에서 초점 형광를 제한 할 수있는 능력으로 인해 조직 조각의 이미지 개별 뉴런의 좋아하는 방법입니다. 뉴런 ¹ GFP 태그와 ratiometric 칼슘 ^{2 +} 표시 fura-2 조합에 사용되었습니다. 그러나 염료는 자외선 (UV) 빛 예정입니다. UV 빛의 레이저와 제한된 광학 침투 깊이의 비용은 많은 실험실에서의 사용을 방해. 또한, GFP 형광은 fura-2 신호를 ² 영향을 줄 수 있습니다. 따라서, 저희는 빨간색 형광 칼슘 ^{2 +} 지표 염료를 사용하기로 결정했습니다. fura - 붉은 거대한 스트로크의 변화는 하나의 여기 파장을 사용하여 GFP와 함께 붉은 형광의 다색 분석을 할 수 있습니다. 우리는 후각 뉴런에게 ³ GFP 태그와 함께 fura 빨간색을 사용하여 이전에 좋은 결과를했습니다. 후각 조직 슬라이스에 대한 프로토콜은 전자 일 듯qually 잘 hypothalamic 뉴런의 ^4. 카 ² 기반 Fura - 레드 ⁺ 영상도 성공적으로 GFP 태그 췌장 β-세포와 HEK 세포 ^5,6로 표현 GFP 태그 수용체와 결합되었다. fura - 붉은 작은 장식 체로 그리기의 표시등이 칼슘 ⁷ 바인딩 후 650 nm의에서의 형광 강도가 감소한다는 것입니다. 따라서, 낮은 칼슘 ^{2 +} 농도와 휴식 뉴런의 형광은 상대적으로 높은 강도를 갖추고 있습니다. 이것은 주목해야한다, 다른 붉은 칼슘 ^{2 +} - 표시 염료가 없거나 현재 개발되고, 그 다른 뉴런과 뇌 영역에서 더 나은 또는 개선 된 결과를 제공 할 수 있습니다.

프로토콜

1. 솔루션 및 아가로 오스 겔의 작성

1. 더블 증류수와 표에 따라 세포 솔루션을 준비합니다. pH는 것 ~ 7.3 carbogen (95% O _{5분의 2} %의 CO _2), osmolarity 300 mOsm ⁸ 10 분 폭기 후. 높은 osmolarity가 필요한 경우, 그것은 더 많은 포도당 (1 MM 1 mOsm와 동일)를 추가하여 조정할 수 있습니다. 솔루션은 먼지 입자 가능한 박테리아 contaminations를 제거하기 위해 0.2 μm 막 필터를 사용하여 두 번 필터링합니다.

시약의 이름	약어	몰. 무게	Conc.	회사	고양이. N °
나트륨 염화물	NaCl	58.44 g / 몰	120 MM	VWR	27,810
나트륨 탄산수 소염	NaHCO 3	84.01 g / 몰	25 MM	머크	106329
염화칼륨	KCl	74.55 g / 몰	5 MM	머크	104936
BES *	C 6 H 15 NO 5 S	213.25 g / 몰	5 MM	시그마	14,853
황산 마그네슘, 무수	MgSO 4	120.37 g / 몰	1 ㎜	시그마	M7506
칼슘 염화물 이수화	CaCl * 2H 2 O	147.02 g / 몰	1 ㎜	머크	102382
D (+) - 포도당 일 수화물	C 6 H 12 O 8 * H 2 O	198.17 g / 몰	10 MM	머크	108342

*N, N-비스 (2 - 히드 록시 에틸)-2-aminoethansulfonic 산

2. 이 솔루션은 4 ° C에 저장되어 있지만 사용하기 전에 10 분 동안 carbogen (95% O _{5분의 2} %의 CO _2)와 aerated해야합니다.
3. 현재 (3 단계 참조) 절단 절차를 수행하는 동안 뇌를 안정 1cm 한천 겔 ³ 블록도 준비하고 있습니다. 첫째, 약 60 솔루션을 가열 ° C.를 두 배의 증류수에서 4 % (w / V) 한천을 (시그마) 분해 온수 용해 한천 솔루션은 1cm의 높이에 사각형 페트리 접시에 부어 있습니다. 냉각 및 경화 후, 4 % 한천 젤은 1cm ^3의 블록으로 절단됩니다. 이 블록은 4 ° C.에서 4 주가에 저장 될 수

2. 마우스 뇌의 해부

모든 동물 실험 절차는 각 기관의 동물 복지위원회에 의해 설립 된 가이드 라인에 따라 수행되어 있는지 확인하시기 바랍니다.

1. 간만에 신 났지 전동물을 ificing하면, 한천 겔 블록이 사용 준비가되어 있는지 확인하십시오.
2. isoflurane과 마우스 (약 1 분에 대한 정밀 vaporizer를 사용하여 산소의 isoflurane 1-4%)를 마취. 이 hypoxia 따라서 neuronal 손상을 방지하는 것이 중요합니다. isoflurane의 단점은 정밀 기화기를 사용하는 비용과 물류입니다. 마우스가 희생 될 수 있으므로 개방형 시스템에서 치명적인 과다 복용은 대안이 될 수 있습니다. 산업 안전이 경우 심각한 문제입니다. isoflurane은 직접 방을 배출해야합니다. 따라서, 개방형 시스템의 과다 복용은 화학 퓸 배출 후드에서 수행해야합니다.
3. 후면 발 반사를 테스트하여 마취의 깊이를 모니터링 한 후 목 베기 마우스를 안락사시켜야. 이 페달 또는 앞발로 땅을 차다 핀치 반사은 굳게 동물의 탈퇴 응답을 유도하기 위해 손가락 사이에 동물의 발자국이 나 발가락을 곤란하게하여 수행됩니다. 반사를 보여줍니다 동물 마취의 수술 수준되지 않으며 확실히하지에안락사시켜야하는 상태입니다.
4. 목 베기 후, 정면 뼈에서 외부 뒤통수 융기로, 시상 방향으로 중앙 단일 에지 razorblade으로 두피에 상처를 냈어. 그런 다음 아래 복부 방향으로합니다 (그림 1A-C), 뱃 부리 장식이있는 측면 방향으로 안쪽 꼬리 끝에서 먼저 두피의 두 부분으로 이동합니다.
5. 두 측면과 작은 봄 가위 (그림 1C에 방향에게 검은 색 점선 화살표를 절단에 대한 참조) 구멍의 매그넘에서 한 뱃 부리 장식이있는 컷합니다. 무딘 집게 (그림 1C에서 확장 회색 화살표를 참조) 측면 뱃 부리 장식이있는에 mediocaudal에서 두개골에서 조심스럽게 다니엘. 나이가 동물에서 시상 봉합의 작은 상처가 뇌의 손상 대뇌 피질의 레이어를 피하기 위해 도움이 종종 필요합니다.
6. 이 순간에 뒤통수, interparietal 및 정수리 뼈가 분리되어야한다. 여전히 존재하는 경우, 경질 한 학교는 신중하게 BR 손상을 방지하기 위해 집게를 사용하여 제거해야다음 단계에서 아무것도.
7. squamosal 뼈, 앞 ethmoidal와 정면 구멍 (그림 1D)를 가져가.
8. 뇌 이제 쉽게 역 마이크로 숟가락 주걱을 사용하고 두개골 신경 (그림 1E)를 severing 제거 할 수 있습니다.

3. 마우스 뇌의 코로나 Hypothalamic 섹션 썰기

1. 절단 방지 표면에의 복부 측면에 뇌를 놓고 하나의 에지 면도날 (그림 2A)와 소뇌를 제거합니다. 이 직선 절단 표면은 코로나 뇌 부분의 썰기 활성화 할 수있는 접시에 뇌를 장착하기위한 기초가 될 것입니다.
2. 빠른 경화 고성능 시아 노 아세틸렌 접착제 superglue (; 그림 1A Loctite 406)의 낮은 금액을 사용하여 마이크로톰의 기초 판의 상처 섹션 (Zeiss, Hyrax V50)와 접착제 뇌합니다. 또한, 접착제 뇌의 복부 측면에서 1cm ³ 한천 겔 블록 (1.5 참조) (의 'V'를 참조 그림 2B) (Zeiss, Hyrax V50)는 뇌를 지원하고 수정합니다. 뇌와 젤 블록 컷 후 조직 슬라이스를 제거에 문제가 발생 사이에 접착제를 순회을 피하기 위해 너무 많이 접착제를 사용하지 않도록하십시오. 겔 블록은 마이크로톰 (그림 2B)에서 절단 블레이드의 맞은 편에 위치합니다.
3. 본드가 마른 몇 초 후, 가득하여 마이크로톰의 목욕탕에 판을 넣어 6 ° C 추위 산소 (95% O _{5분의 2} %의 CO ₂₎ 세포 솔루션 (1.1 참조).
4. 적절한 낮은 썰기 속도를 사용하여 300 μm 두께 조각을 잘라. 우리 마이크로톰의 경우, 우리는 60 Hz에서, 0.8 mm의 진폭 및 0.8 mm / s의 (그림 2C)의 속도의 주파수를 사용합니다. 코로나 뇌 조각이 중 각 컷 후 직접 수집 또는 전체 뇌 sectioned 때까지 욕조에 남아있을 수 있습니다. 코로나 뇌 조각을주의 깊게 transfe 아르감기에 산소를 세포 솔루션을 비커에 rred. 다양한 도구 전송 (예를 들면 절단 폭 넓은 플라스틱이나 유리 파스퇴르 피펫 또는 확장 숟가락 spatulas)을 수행하도록 설계되었습니다. 이 선호되고있는 experimentator에 따라 달라집니다. 가장 중요한 조각은 피해를 최소화하기 위해 적절하게 처리해야합니다.
5. 마이크로톰가 자동으로 조각을 잘라 프로그래밍 할 수있는 경우,이 순간에 칼슘 ^{2 +} 지표 염료 로딩 솔루션을 준비 할 수 있습니다. 그렇지 않으면, 그것은 썰기 뇌가 2 단계를 시작하기 전에, 즉 뉴런에 칼슘 ^{2 +} 응답을 측정하기위한 지연을 최소화하기 위해 종료하기 전에이 솔루션의 준비를 수행 할 것을 권장합니다.

4. 칼슘 ^{2 +} 표시기 염료로드 솔루션의 준비

로드 뉴런의 중요한 단계는 종종에 의해 유도 손상의 양에 따라 달라 세포의 건강과의 속도 유지분해 절차. 또 다른 중요한 단계는 신선한 Pluronic의 사용 F-127 솔루션 (4.1 참조)이 될 것 같습니다. 그것은 실험실에서이 솔루션을하고 업체에서 premade 솔루션을 사용하지 권장되고 있습니다. 온도, 습도 및 F-127 솔루션 Pluronic의 선반 수명에 따라, 우리는 칼슘 ^{2 +} 로딩 절차를 수행하는 동안 후각과 뇌 뉴런의 저하를 지적했다.

1. DMSO 솔루션의 상단에있는 Pluronic F-127 분말을 추가하여 디메틸 sulfoxide (DMSO)에 20 % (w / V)이 Pluronic F-127 (시그마)를 준비합니다. 바로 이전 소용돌이 또는 혼합없이이 솔루션을 sonicate. 2 분 sonication 내에서 Pluronic F-127가 해산 될 것입니다. 100 μl Pluronic F-127 솔루션은 신선한 매주을 준비하고 있습니다.
2. 50 μg 세포 투과성 fura-red/AM (Invitrogen, AM, 아세 톡시 메틸 에스테르) 중 하나 튜브를 타고 F-127 솔루션을 5 μl 20 % Pluronic를 추가합니다. 귀하의 피펫의 팁을 사용하여 솔루션을 섞는다.
3. 45 μl 세포 soluti을 추가에 혼합 곧 소용돌이를로 (1.1 참조).
4. 추가 325 μl 세포 솔루션을 추가하고 3 분의 튜브를 sonicate.
5. sonication은 산소를 1.156 ML을 (95% O _{5분의 2} %의 CO ₂₎ 최종 칼슘 ^{2 +} 지표 염료 로딩 솔루션 (30 μM의 fura-red/AM, 0.33 %의 DMSO와 0.065 %의 Pluronic F-127)를 얻을 수있는 세포 솔루션을 추가 한 후 . 사용까지 어두운 장소 (4.8 참조)에 튜브를 저장합니다.
6. 산소 (95% O _{5분의 2} % CO ₂₎ 세포 솔루션 (물론 당 최대 6 조각)로 가득 찬 6도 세포 배양 판 (BD 매)에 코로나 뇌 조각을 전송합니다.
7. 뇌 조각을 손상하지 돌봐 6 잘 접시의 챔버에서 산소를 세포 솔루션을 빨아.
8. 모든 잘에 칼슘 ^{2 +} 지표 염료 로딩 솔루션의 Pipet 직접 750 μl. 뇌 조각은 fura-red/AM을 (집중 하중)이 포함 된 솔루션이 적용되어야한다.
9. Incubat37 번 45-60 분에 대한 ° C. :; : O ₂ / CO ₂ 세포 배양 배양기 (5 % CO ₂ 23.5 % O _2)의 전자 조각
10. 부화 시간의 끝에서, fura 빨간색으로 세포를 과부하 및 염료의 킬레이트 화 작업을 통해 미묘한 방법으로 칼슘 ^{2 +} 측정에 영향을 막기 위해 신선한 산소를 세포 솔루션 칼슘 ^{2 +} 지표 염료 로딩 솔루션을 대체합니다. 조각은 다음 O ₂ / 사용까지 CO ₂ 인큐베이터 (설정에 대한 이전 지점 참조)에 보관 및 최대 3-6 시간에 대한 가능한 아르되고있다.

5. 현미경 및 분석

이 프로토콜에 관심 셀을 식별 GFP,과 칼슘 ^{2 +} 표시기 염료의 형광 강도는 뇌 슬라이스로 동시에 측정됩니다. 따라서, 공 촛점 현미경은 두 emissi를 수집하는 올바른 레이저, 필터와 두 개의 광전자 증 튜브가 장착되어야한다신호에. GFP 및 fura-붉은 색의 형광 강도의 변화는 488 nm의 단일 여기 파장을 사용하여 측정 할 수 있습니다. fluorophores에서 방출 형광는 GFP 및 fura - 레드 600 나노 미터보다 더 큰 파장을위한 긴 패스 필터에 대한 필터 522/DF35 나노 미터를 사용하여 수집 할 수 있습니다.

1. 세포 내 칼슘 ^{2 +} 농도의 측정하는 형광 신호의 모니터링을 자극 유발 변경, 시작하려면 fura 붉은로드 뇌 조각 중 하나가 기록 챔버 (즉, 워너 계측기 RC-27 오픈 목욕 상공 회의소)에 전달된다 그는 공 촛점 현미경 설정 (그림 3A, B)에 장착 할 수 있습니다.
2. (; 단계 1.1을 참조 산소를 세포 솔루션) 때문에 목욕탕 솔루션의 재관류 속도로 이동하는 조각을 방지하기 위해 하프 (그림 3C)와 뇌 조각을 고정합니다. 하프 (슬라이스 홀더)에 중독 나일론 스레드의 병렬 배열 (~ 1mm에 의해 서로 분리)으로 구성되어 있습니다U 모양 실버 또는 플래티넘 프레임. 이 단계에서 목욕 솔루션의 온도는 적어도 상온해야합니다. 높은 온도가 필요한 경우, 적절한 치료는 현미경에서 부품을 이동으로 인해 초점 비행기의 현미경 렌즈와 운동에 응축을 방지하기 위해주의가 필요하다.
3. 세포 칼슘 ^{2 +} 표시기 염료의 흑자를 제거하는 산소를 세포 솔루션을 10 분의 슬라이스를 Perfuse. 재관류의 유량은 ~ 100 S / μl (적절한 재관류 시스템이 ⁹ 참조에 대한 도움말 참조)으로 조정해야합니다.
4. 낮은 배율의 현미경을 통해 슬라이스를 봐, 기록에 대한 슬라이스의 방향을 메모하고 뇌의 hypothalamic 지역의 경우, 슬라이스의 관심 지역을 찾으십시오.
5. 높은 배율로 변경하고 GFP 이미지를 수집하여 슬라이스에 대한 관심의 셀을 찾아 동시에 fura-붉은 색의 형광 강도를 확인신호 (그림 4A-C). 표면 근처의 세포가 손상 또는 사망 할 수있다. 따라서 10 개 이상의 μm의 깊이에 위치한 세포 이미징을위한 선택해야합니다. 우리는 안정적으로 40-50 μm의 깊이 세포를 측정 수 whereafter 신호 강도가 떨어지기 시작했다. 낮은 칼슘 ^{2 +} 농도와 휴식 세포의 fura - 빨간 신호가 상대적으로 높은 형광 강도를 기억하십시오. 이 높은 형광 강도는이 경우의 죽은 세포를하지 징조입니다. GFP 신호는 조직 슬라이스 또는 세포 내 pH를 ¹⁰ 변경 사항에 대한 표시와 같은 드리프트 나 움직임을 감지하는 데 사용할 수 있습니다.
6. fura 붉은 형광 강도의 변화에​​ 측정이 가능하고 두 fluorophores의 표백하지 못하게하는 값으로 레이저 파워를 조정합니다. 따라서, 가장 낮은 레이저 파워로 시작과 검은 색 레벨 (오프셋), 검출기 공, 게인 및 레이저 중립적 인 밀도 필터를 변경하여 충분한 신호 대 잡음 비율을 얻기 위해 조정s입니다. 레이저 파워를 제외하고, 동일한은 GFP 신호에 대해 수행해야합니다.
7. 0.5 사이의 속도로 이미지를 얻기 위해 시작 - 2 Hz에서의 fura-빨간색과 GFP 신호를 수집 할 수 있습니다. 인수 요금은 칼슘 ^{2 +} 신호의 예상 속도에 최적화해야합니다. 전압 의존 칼슘 ^{2 +} 스파이크 다양한 초 메신저의 활성화를 요구하는 일부 신호 전달 폭포의 활성화보다 빠르고 짧은 과도가 발생할 수 있습니다. 이미지 수집의 길이는 실험의 목적에 적합한해야합니다. 시간이 지남에 따라 GFP 신호는 뇌 슬라이스의 움직임이 발생했는지 확인하는 데 도움이됩니다.
8. 수집 및 실험이 진행되는 동안, 모든 스캔 헤드 설정을 비교할 수 있습니다 신뢰할 수있는 결과를 기록하기 위해 지속적인 개최해야합니다.
9. , 시간이 지남에 따라 형광의 변화는 여러 수학 프로그램, 즉 ImageJ을 (NIH, 베데스다, MD 사용하여 분석 할 수 HTTP:/ / rsb.info.nih.gov / 엘 제이 /), 이고르 프로 (Wavemetrics) 또는 MATLAB (MathWorks). 관심 지역을 나타내는 GFP 태그 뉴런의 somata을 둘러싸하면 (ROI)이 동일한 지역은 ^칼슘이의 변화를 분석 할 수 ⁺ 시간이 지남에 따라 fura 빨간색 형광 신호를 사용합니다.

칼슘 ^{2 +} 신호는 임의의 형광 단위 또는 기준 형광 (F)에 표준화 된 형광 강도 (ΔF)에서 상대적으로 변화의 값 (ΔF / F) 등이 제시 될 수 있습니다. 이 절차를 제외 편향의 결과 칼슘 ^{2 +} 지표 염료로 fura 빨간색을 사용하여 세포 내 칼슘 ^{2 +} 농도 증가한다. 결과의 해석을 쉽게하기 위해, 우리는 칼슘 ^{2 +} (그림 4C)에 상승을 표시하는 긍정적 인 형광 신호를 얻기 위해 -1로 ΔF / F 값을 곱한 것이 좋습니다.

뉴런 칼슘의 진폭 및 주파수 사이의 결과를 비교하려면 ^{2 + 신호는 일반적으로 분석됩니다. 그러나, 일부 칼슘 2 + 신호는 일반 기간 또는 유사한 진폭과 발생하지 않습니다. 일부 신호는 강력하게 세포 내에서 확률 프로세스에 의해 영향을받을 수 있습니다. 따라서, 주어진 셀에 + 칼슘 2의 총 변화를 수량화하고 다른 뇌 영역이 지역 언더 곡선 (AUC)의 분석 뉴런 사이의 + 응답이 더 적절한 칼슘 2의 비교를 활성화 할 수 있습니다. 카 2의 금액에 대한 이런 조치는 + 모든 초기 칼슘 2 + 과도 두 번째 단계를 포함하고 높은 칼슘 2 + 응답 및 진동을 입었다. 이 경우 관리에서 뉴런 사이의 비교를 사용하도록 설정 같은 기간을 분석주의해야한다.}

6. 대표 결과

시상 하부의 뉴런을 표현 생식샘 자극 호르몬 분비 호르몬 수용체 (GnRHR)를 특성화 시작하려면 우리는 유전자 변형 마우스의 사용을 만든 Cre로 인한 exci 후 빠른 GFP에 시온 뉴런에게 ^4,11를 GnRHR - 표현. GFP 형광의 뉴런은 시상 하부 등 다양한 뇌 영역에서 확인되었습니다. 이 GnRHR의 뉴런의 생리적 특성을 조사하기 위해 우리가 먼저 카 ² 기록 ⁺ 공 촛점 현미경을 사용하여 hypothalamic 슬라이스의 신호. 첫째, 우리는 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 이러한 생쥐에서 코로나 뇌 조각을 획득하였습니다. 그림 1은 필요한 도구, 재료와 마우스 뇌를 절개하는 단계를 보여줍니다. 코로나 hypothalamic 뇌 조각은 프로토콜의 지점 4의 단계에 따라 절단 (그림 2) 다음로드되었습니다. 해당 지역의 단일 뇌 슬라이스가 (단계 5.1-5.9 참조) 하프 (그림 3)과 보안 한 후 공 촛점 현미경을 사용하여 이미징, 녹음 챔버에 배치되어 있습니다. 그림 4는 단일 식별이 개인 코로나 뇌 조각의 예를 보여줍니다 GnRHR - τGFP 세포 기관, loadin 후 나머지의 형광g fura-red/AM와 뇌 조각과 GFP 신경 세포가 자극 - 유도 칼슘 ² 조사를 수 있도록 충분히 fura 빨간색을 촬영 한 것으로 보인다 병합 공 촛점 이미지 ^+이 세포의 신호. 우리 프로토콜 사용 우리는 처음 GnRHR의 뉴런이 GnRH와 직접 활성화 (그림 4E)에 대한 응답으로 시상 하부의 여러 분야에서 자극 탐지에 대해서도 이와 유사한 칼슘 ^{2 +} 신호를 사용하는지 여부 검사. 그러나, 이러한 신호는 자극 강도와 뇌 영역 ^(4)에 따라 자신의 파형에서 다릅니다. 칼슘 ^{2 +} 응답의 역학의 변화를 수량화하기 위해, 지역 - 아래 - 더 - 곡선 (AUC)가 세포 내 칼슘 ^{2 +} (그림 4E) ^4의 증가를위한 조치로 계산 될 수있다. 연구는 현재 칼슘 ^{2 +의} 파도와 진동, 성별에 대한 자신의 의지와 동물의 호르몬 상태를 근간 분자 기초를 조사 할 진행중이며, 그들은 변조 할 수 있는지 여부다른 자연 자극에 의​​해.

1 그림. 도구, 재료 및 마우스 뇌를 절개하는 단계. A. 뇌 해부에 사용 도구 및 자료 : 1, Loctite 406 superglue, 2, 마이크로 숟가락 주걱, 3, 단일 에지 면도날, 4, 중소 봄 가위, 5, 부근 포셉, 6, 가위, 7, 페트리 접시는 한천을 포함하는 젤 블록, 8, 마이크로톰에 장착 뇌에베이스 플레이트. BF. 프로토콜의 지점 2에 설명 된 몇 가지 단계의 이미지. 절단 두피의 위치 (빨간색 선) 및 피부 (단계 2.4 참조) 뼈에서 떨어져 쉬게해야 할 방향을 나타내는 화살표 (주황색)을 나타내는 마우스 머리 B.의 사진. 피부가 (단계 2.4 참조) 뼈 구조를 보여 끌려 후 마우스 머리 C.의 사진. 무딘 집게로 태아의 두개골을 열기위한 가위와 방향 방향을 절단하는 것은 검은 색 중 하나와 함께 표시됩니다각각 화살표 또는 회색 폭 넓은 화살표를 닦았다. 다양한 뼈 구조를 제거 후 마우스의 뇌 (- 2.7 단계 2.5 참조) D.의 사진. 뇌의 제거 E.의 사진은 아직 두개골 신경을 통해 두개골에 연결되어 있습니다. 상대적으로 큰 피해를 마우스 뇌의 F.의 사진.

그림 2. 마우스 뇌의 코로나 hypothalamic 섹션의 칼자국. A.이 (단계 3.1 참조) 소뇌를 제거하고 단일 에지 면도날의 위치를​​ 나타내는 사진에 담아보세요. 뇌와 관련하여 한천 겔 블록의 B. 위치는 (단계 3.2 참조) 마이크로톰의 기초 판에 접착. 코로나 뇌 슬라이스의 C. 절삭는 (여기서 뇌와 마이크로톰의 절단 블레이드에 관해서는에서 젤 블록 위치의 위치를​​합니다,. 단계 3.4 참조). D, 발등, V, 복부.

그림 3. 녹음 챔버에 위치 뇌 슬라이스. A, B. 개요 (A) 이상 확대 (B) 코로나 뇌 슬라이스의 hypothalamic 지역 (단계 5.1 참조)에 대한 자유로운 접근을 제공 워너 계측기 RC-27 개방형 욕실 기록 챔버의. (단계 5.2 참조) 기록 챔버의 위치에 조각을 개최합니다 나일론 스레드의 병렬 배열을 포함하는 C. U 자형 금속 하프.

4 그림. 카 ² 마우스 hypothalamic 뇌 슬라이스의 τGFP 뉴런의 ⁺ 신호. AD. GFP 신경과 코로나 마우스 뇌 조각의 fura-붉은 형광을 동시에 취득의 식별. GnRHR - τGFP 뉴런 (녹색)을 식별 코로나 뇌 슬라이스의 A. 공 촛점 이미지입니다. 뇌 영역의 B. 비교적 균일 한 형광 신호 (적색) A fura-red/AM과 뇌 슬라이스를로드 한 후 관찰에 표시. C.는 neu을 보여주는 이미지를 흡수 합병rons는 칼슘 ^{2로드 +} 표시 염료 (노란색)에 묘사. 이 비 GFP의 somata (화살표)의 예는 회색 선으로 표시됩니다 반면, GFP 신경 somata의 경계는 점선 흰색 라인에 표시됩니다. 배경에 비해 붉은 색 형광 높은 금액으로 GFP 및 비 GFP의 신경 세포의 D. 예를 들어. 체세포 자극 - 유도 칼슘 ² E.의 예 다른 hypothalamic 뇌 영역의 개별 GFP 태그 뉴런 (PE, periventricular 핵, DM, dorsomedial 시상 하부, 아크, arcuate 핵)에서 ⁺ 응답. 지역 언더 곡선 (AUC)은 붉은 색 지역으로 그려져 있습니다. 뚜렷한 카 ² 사이 ⁺ 신호 GnRHR - 표현 다른 hypothalamic 핵의 뉴런하는 것은 칼슘 ^2의 총 변화에 대한 추정으로 AUC를 사용하여 비교할 수 있습니다 ⁺ 같은 기간 동안 특정 셀 인치 F. 도식 도면 및 다이어그램 AE에서 분석 GFP 태그 뉴런의 위치를 나타내는 패널 어퍼 :. 코로나 뇌 s의 위치hypothalamic 뇌 영역 (빨간색 선)를 포함 ection 중 낮은 패널 :. 뇌 슬라이스 (가운데)와 붉은 점으로의 기록 GFP 태그 뉴런의 대략적인 위치를 나타내는 붉은 박스 영역의 확대 (하단 패널)의 도식 그림 E에 표시된 PE, DM)와 개선문 (Arc, 낮은 패널 방식의 검은 색 영역 : 제 ³ 뇌실. 낮은이 다이어그램 Paxinos와 프랭클린 ^{12 일부터} 구성된다. 왼쪽 아래 번호는 Bregma의 거리 (mm)를 나타냅니다.

토론

신경 과학의 주요 문제는 뇌 사회 정보를 처리 방법을 이해하는 것입니다. 사회적 인식에 필요한 정보의 주된 소스가 후각이나 pheromonal 신호에 의해 인코딩되어 있습니다. neuronal 코의 인구, 특히 뇌, 시상 하부에서 신호의 인식에 의해 이러한 신호의 감지는 많은 사회적 과정과 영향력 호르몬 및 기타 neuroendocrine 요소 ^13-16에서 핵심적인 역할을한다. 여러 뉴런과 다기능 핵을 포함하는 시?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
이름	회사	고양이. N °
한천	시그마	A1296
Fura-red/AM	Invitrogen	F-3021
Pluronic F-127	시그마	P2443
디메틸 sulfoxide	피셔 과학	BP231
진동 - 블레이드 마이크로톰 Hyrax V 50	Zeiss	9770170
마이크로톰 Hyrax V 50 장치 CU 65 냉각	Zeiss	9920120
O 2 / CO 2 인큐베이터, CB210-UL	접합재	0019389
슈퍼 접착제, Loctite 406TM	Henckel	142580
더블 spatulas, 스푼 모양	Bochem	3182
Microspoon의 spatulas, 스푼 모양	Bochem	3344
봄 가위, 모리아 - Vannas - 울프 - 7mm 블레이드	정밀 과학 도구	15370-52
봄 가위, Vannas - 3mm 블레이드	정밀 과학 도구	15000-00
바그너 가위	정밀 과학 도구	14071-12
의료 포셉, 뒤몽의 7B	정밀 과학 도구	11270-20
대형 직사각형 오픈 목욕 상공 회의소 (RC-27)	워너 악기	64-0238
공 촛점 현미경 BioRad 래디언스 2100	Zeiss	NA