דור מצע לEndonucleases של מערכות CRISPR / קאש

Summary

חסינות CRISPR / קאש מערכות לתווך אדפטיבית בחיידקי חיידקים קדומים. חלבוני CAS רבים הציעו לפעול כendoribonucleases פועל על מבשרי crRNA של משתנה אורך. כאן אנו מדגימים שלוש גישות שונות כדי להפיק את המצעים מראש crRNA לניתוח פעילות ביוכימית endonuclease קאש.

Abstract

האינטראקציה של וירוסים והמארחים פרוקריוטים עצבה האבולוציה של חי חיידקים וarchaeal. פרוקריוטים פתחו מספר אסטרטגיות להתחמק התקפות נגיפיות הכוללות שינוי הגבלה, זיהום כושל ומערכות CRISPR / קאש. מערכות אלו מסתגלות חיסוניות נמצאו בחיידקים רבים ומורכבות ביותר הקדומה של ג lustered r egularly אני nterspaced של hort עמ alindromic r EPEAT (CRISPR) רצפים ומספר C RISPR כגני sociated (CAS) (1 איור) ^1-3. קבוצות שונות של חלבונים וחוזרים CAS להגדיר לפחות שלושה סוגים עיקריים של מסתעפים CRISPR / קאש מערכות ^4. החלבונים האוניברסליים Cas1 וCas2 מוצעים להיות מעורבים בספיגה של ה-DNA הנגיפית היפיק אלמנט spacer חדש בין שני שידורים חוזרים בתחנה סופית 5 'של אשכול CRISPR הארכת ^5. כל האשכול משועתק למבשר-crRNA המכיל את כל spacer ורצפים חוזרים ולאחר מכן יעובד על ידי אנזים של Cas6 המשפחה המגוונת לcrRNAs הקטן ^6-8. crRNAs אלה כולל רצף spacer המוקף 'מסוף (8 נוקלאוטידים) ו3' 5 תג מסוף נגזר מהרצף החוזר ^9. זיהום חוזר ונשנה של הנגיף כעת ניתן לחסום כיופנה crRNA החדש על ידי חלבונים מורכבים קאש (Cascade) ל-DNA הנגיפי ולזהות אותו ככזה באמצעות השלמת בסיס ^10. לבסוף, עבור 1 מערכות CRISPR / קאש סוג, nuclease Cas3 יהרוס את הפולש זוהה DNA ^11,12.

תהליכים אלה מגדירים CRISPR / קאש כמערכת חיסונית אדפטיבית של פרוקריוטים ופתחו תחום מחקר מרתק למחקר של חלבוני CAS המעורבים.התפקוד של חלבונים רבים קאש הוא עדיין חמקמק ואת הסיבות לגיוון לכאורה של מערכות CRISPR / קאש להישאר להיות מוארות. פעילות פוטנציאלית של רוב חלבוני CAS נחזתה באמצעות אנליזות חישוביות מפורטות. חלק עיקרי של חלבוני CAS מוצג או הציע לתפקד כendonucleases ^4.

כאן, אנו מציגים שיטות להפקת crRNAs והמבשר-cRNAs ללימוד endoribonucleases קאש. מבחני endonuclease שונים דורשים רצפים חוזרים או קצרים שניתן ישירות מסונתז כoligonucleotides RNA או רצפי crRNA כבר ומראש crRNA המופקים באמצעות RNA פולימראז במבחנת T7 שעתוק ניגר. מתודולוגיה זו מאפשרת שילוב של נוקלאוטידים רדיואקטיביים לדור של מצעי endonuclease כותרתו פנימית ויצירת crRNAs הסינטטי או מוטציה. פעילות endonuclease Cas6 מנוצלת להתבגר-crRNAs מראש לcrRNAs עם 5'-hydroxyl ו2 ', termini פוספט 3'-מחזורי.

Protocol

1. דור של מצעים ארוכים מראש crRNA באמצעות PCR

1. פריימרים עיצוב PCR מיקוד אזורי spacer של אשכול CRISPR. הוסף RNA פולימראז T7 (T7RNAP) רצף אמרגן (5 '-taatacgactcactata-3') לפריימר קדימה ואתרי הגבלה לשיבוט מוצר PCR לוקטור לשני פריימרים (2A למשל BamHI ושלישי לינד pUC19, איור.) .
   הערה: T7RNAP דורש שאריות guanidine לחניכה תקינה של שעתוק.
2. Amplify הרצף של ריבית לפני crRNA מהדנ"א הגנומי באמצעות PCR.
3. הפרד את מוצרי PCR ידי אלקטרופורזה agarose ג'ל וג'ל לחלץ להקה הרצויה. לעכל את מוצר PCR עם אנזימי ההגבלה כדי ליצור קצוות דביקים (למשל BamHI וHindIII, איור. 2A). לטהר מוצר ה-PCR שלך עם ערכת טיהור PCR לחסל מחשוף לפי מוצרים.
4. הגדרת תגובת קשירה המכילה דנ"א ligase T4, מאגר ligase DNA T4 ויחס טוחן 03:01 במוצר ה-PCR ובקע את וקטור PUC יניארי dephosphorylated עם קצוות דביקים מתאימים. דגירה את התערובת על 16 מעלות צלזיוס למשך הלילה. להפוך את תערובת הקשירה לתאי Escherichia coli DH5α מוסמכים בפרוטוקולים סטנדרטיים ולהשתמש הקרנה לבנה כחולה לזהות קשירה מוצלחת.
5. מבודד פלסמידים ממושבות לבנות באמצעות ערכת הכנת פלסמיד. זהה שיבוטים חיוביים על ידי רצף הפלסמיד. לחלופין, המושבה PCR עלול להיות מנוצל להקרנה.

2. דור ביניים מראש crRNA המצעים דרך החישול של oligonucleotides דנ"א

1. עצב קדימה לאחור oligonucleotides עם הרצף הרצוי CRISPR החוזר / spacer. את oligonucleotides מכיל רצף של אמרגן T7 RNAP כמו גם באתרי הגבלת מסוף (למשל BamHI ושלישי לינד pUC19). לסיים את oligonucleotides כדי להבטיח צורת קצוות דביקה שלאחר החישול (ראה איור. 2B ).
2. 5'-phosphorylate nmol 1 מתוך כל oligonucleotide בתגובת 20μl נפרדת הכוללת 5 μl של קינאז polynucleotide T4 (PNK), 2 μl של חיץ T4 PNK 10x, 2 ATP μl (10 מ"מ). דגירה כל דגימה במשך שעה 1 ב 37 ° C.
3. להכליא שני oligonucleotides phosphorylated. שלב 1μl של תערובת phosphorylated קדימה Oligo (מ -2.2)., Μl 1 מתוך תערובת phosphorylated ההפוך Oligo (מ -2.2)., Μl 1 מתוך מאגר T4 DNA ligase 10x בתגובת μl 10. דגירת הדגימות למשך 5 דקות ב 95 ° C על בלוק חימום או במים רותחים, כבה את מקור החום ותן לתערובת להתקרר לטמפרטורת חדר (~ 2-3 שעות).
   הערה: בשלב קריטי זה, תהליך הקירור האיטי מעדיף את החישול של שני oligonucleotides השוואה להיווצרות של מבנים בתוך כל oligonucleotide אחת.
4. לקשור 4 μl של תמהיל ההכלאה, 1μl של וקטור PUC מתעכל וdephosphorylated (0.1 מיקרוגרם /μl) עם ligase T4-DNA, מאגר ligase 10x DNA T4 ו 10 מ"מ ATP בתערובת קשירה 20 μl. דגירת המדגם ב 16 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
5. להפוך את גבעול פלסמידים לתאי Escherichia coli DH5α מוסמכים בפרוטוקולים סטנדרטיים ולנצל הקרנה לבנה כחולה. לבודד ולזהות פלסמידים שיבוטים חיוביים על ידי עיכול (להקרין למוסיף בגודל רצוי) ורצף פלסמיד שלאחר מכן.

3. דור של קאש רנ"א מצעים קצרים באמצעות סינתזת RNA oligonucleotide המותאם אישית

עיצוב הקצר קאש רנ"א מצעים (למשל רצפים בודדים חוזרים, איור. 2C) ולנצל את מתקני סינתזת RNA oligonucleotide מותאמים אישית.

הערה: הכללת deoxyribonucleotide במיקום מצוין של oligonucleotide רנ"א (איור 2 ג) ניתן להשתמש כדי לאתר את האתר של מחשוף רנ"א.

4. במבחנה Tשעתוק 7 RNA פולימראז

1. מבודד פלסמידים עם המבנה תוכנן (מ -1.9. או 2.7.) באמצעות ערכת טיהור פלסמיד maxiprep.
2. Linearize פלסמיד עם אנזים ההגבלה שחותך במורד זרם של הבר המשובט (למשל HindIII). ודא עיכול מלא.
   הערה: אם התחנה סופית מוגדר 3 מסתעפים "של תעתיק הרנ"א היא רצויה, המבנה תוכנן צריך להכיל אתר הגבלה ספציפית נוסף לשעתוק" ניגר "במעלה זרם של רצף HindIII.
3. לטהר את הפלסמיד לינארית ידי פנול: כלורופורם חילוץ (1:1) ומשקעי אתנול. לשחזר את חומצות גרעין על ידי resuspending הגלולה במים סטריליים טופלו DEPC.
4. הגדרה במבחנת T7 RNAP לברוח תערובת שעתוק שמכילה 40 Hepes מ"מ / Koh (pH 8), 22 המ"מ MgCl _2, 5 המ"מ dithiothreitol, spermidine 1 mM, 4 מ"מ מכל טריפוספט nucleoside (ATP, CTP, GTP, UTP ,) 40-100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של מתעכלפלסמיד ומ"ג / מיליליטר T7 RNAP 0.1 במים שטופלו DEPC. דגירה במשך 3 שעות ב 37 ° C.
5. נתח את תעתיקי רנ"א מתקבלים על 12% ג'ל polyacrylamide denaturing אוריאת ז 8 (איור 3 א). תעתיקי רנ"א יכולים להיות מטוהרים דרך מונה ש אניון חילופי כרומטוגרפיה ¹³ והתאוששו על ידי משקעי אתנול משברי RNA וresuspension של הגלולה במים סטריליים DEPC טופל. לשימוש עתידי, לאחסן RNA ב-80 ° C.

5. assay endonuclease Cas6

1. הגדרה 20 μl במבחנת T7 RNAP לברוח תערובת שעתוק (ראה 4.4) המכילה כמות מופחתת של 2 המ"מ ATP והוא השלים עם 2.5 μl ^α-[32 P]-ATP (10 mCi / מ"ל, 5000 / mmol Ci). לטהר את תוצרי תגובה באמצעות מיצוי ג'ל מ12% M ג'ל denaturing 8 אוריאה polyacrylamide. דמיינו להקות ידי autoradiography.
2. לייצר ולטהר את החלבונים רקומביננטיים CAS הרצויים. בדוגמה זו, Cas6 מClostridium thermocellum טוהר באמצעות חום ומשקעי Ni-נ.ת. ע כרומטוגרפיה.
3. הגדרת תגובת endonuclease assay (למשל עבור Clostridium thermocellum Cas6, תגובת התערובת מכילה 20 Hepes מ"מ (KOH pH8), 250 המ"מ KCl, 2 המ"מ MgCl _2, 1 mM DTT, מצע 12,000 עותקים RNA ואנזים מיקרומטר 1 והודגר ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות).
4. טען 5 μl של תערובת התגובה (+ 10 חיץ μl רנ"א טעינה המכיל 95% פוראמיד) על 12% ג'ל M 8 אוריאה polyacrylamide. דמיינו את מוצרי ביקוע לאחר אלקטרופורזה ידי autoradiography.

6. נציג תוצאות

דוגמה של רנ"א מצעים לניתוח פעילות endonuclease קאש מוצגת באיור 3 א. Aliquot של 5 μl של 100 μl אנליטית בתגובת שעתוק במבחנה היה טעון. שים לב שהיעילות של הפקת רנ"א משתנית בין מבנים שונים. חלק לא גורמיםכובע נצפו להשפיע על הכמות של RNA המתקבל הן (i) את הרצף הראשוני בעקבות 1 G נדרש לייזום שעתוק, (ii) את האפשרות של היווצרות מבנה רנ"א במהלך שעתוק ו( ג) הבחירה של אתר ההגבלה לדור של עמדת המחשוף ניגר.

החקירה של פעילות endonuclease RNA דורשת גם חלבונים מטוהרים מאוד רקומביננטי קאש (איור 3) ופקדים שליליים מתאימים. באופן אידיאלי, מדגם שליטה שלילית זו שונה מעט ככל האפשר מהתגובה חקרה קאש endonuclease. זו יכולה להיות מושגת על ידי דגירה של רנ"א עם חיץ ותגובת התא lysate בלי קאש ביטוי (ולאחר הליך הטיהור הזהה). שליטה שלילית אידיאלית היא התוספת של deoxyribonucleotide באתר המחשוף המוצע. באיור 3C, המחשוף של רצף חוזר מסוף 5 'שכותרתו מוצג לClostridium thermocellum Cas6. תחת תנאים זהים, חזור על זה לא מצע יותר כאשר deoxyribonucleotide הוא הציג בעמדה -9. שיטה זו גם מספקת מידע על אתר המחשוף. לבסוף, שכותרתו פנימית-crRNA מראש ארוך הוא בקע ידי Cas6 ושני שברי ביקוע הם נצפו.

איור 1. סקירה סכמטי של פעילות CRISPR / קאש. הסקירה הבאה ההחדרה של רצף ה-DNA נגיפי (protospacer) לאשכול CRISPR (הסתגלות), השעתוק והעיבוד של מערך CRISPR לcrRNAs הקטן על ידי Cas6 endonuclease, הספיגה של crRNAs לתוך מתחם האשד וההתערבות של חזר התקפה נגיפית המבוססת על השלמה בין crRNA וprotospacer. מוטיבי Protospacer סמוכים (PAM) רצפי protospacer נגיפיים מארק.

igure 2 "src =" / files/ftp_upload/4277/4277fig2.jpg "/>
איור 2. דור של רנ"א מצעים לחלבוני קאש. התכנית מציגה את תהליך העבודה ליצירה () ארוכים מראש crRNA מצעים, (ב) ביניים מראש crRNA מצעים ו( C) הקצרים קאש רנ"א מצעים לייצור מראש crRNA. רצפי דוגמה מוצגים למערך CRISPR של Clostridium thermocellum. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 3. Cas6 assay endonuclease. ג'ל א) Toluidine הכחול מוכתם polyacrylamide של oligonucleotide רנ"א מותאם במיוחד (250 pmol) ושתיים במבחנת רנ"א תמלילים (5 μl של תגובה אופיינית μl 100). ג'ל ב) SDS-PAGE של Cas6 הכנה (80 pmol) מClostridium thermocellum אחרי חוםמשקעים ב 50 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 וכרומטוגרפיה Ni-נ.ת. ע. ג) איתור של Cas6 פעילות endonucleolytic לרצפי טרמינל 5 'שכותרתו חוזרת ומראש crRNA בתעתיקי מבחנה. ההקדמה של dNTP בעמדה -9 מבטלת Cas6 מחשוף למצע רנ"א קאש קצר (S, איור. 2C). 5 'תג nt מסוף 8 גם מופק עבור התבגרות crRNA מ מראש crRNA מצעים ארוכים (L, איור. 2A). הלהקות הופרדו על 12% M ג'ל denaturing 8 אוריאה polyacrylamide ומדמיינים ידי autoradiography.

Discussion

השיטות שהוצגו לאפשר את הדור של מצעי CAS endonuclease של טווחי גודל שונים ומשתנים עם חופש בתכנון רצף. הגישה הכי ישר קדימה עבור הדור של מצעי oligonucleotide RNA סינטטיים מוגבלת לעיצובי RNA קצרים עקב הגדלת עלויות ומגבלות טכניות ביצירת oligomers RNA הארוכה יותר. בעוד סינתזת RNA מוצלחת כבר דווחה לoligomers RNA ללא שינוי של מעל אורך 100 נוקלאוטידים, המקסימום הפרקטי וחסכוני לסינתזת RNA מותאמת אישית נמצא מתחת 40 נוקלאוטידים. עם זאת, כל רצף נתון יכול להיות מסונתז והמבוא הממוקד של נוקלאוטידים שונים (למשל deoxyribonucleotides) יכול להיות מנוצל כדי לנתח אתרי ביקוע בפירוט. טרום cRNAs ארוך יותר צריך להיות שנוצר באמצעות שעתוק במבחנה.

חישול של oligonucleotides המכיל מקדם RNA פולימראז T7 מאפשר לייצור אורך ביניים מראש crRNכ. האורך המרבי של oligonucleotides DNA המסונתז באופן שוטף ובחינה כלכלית הוא מעל 150 נוקלאוטידים ומייצג את המקסימום של-crRNAs מראש הסינטטי בשיטה זו. ההרכבה של כמה זוגות oligonucleotide DNA annealed שיוצרים קצוות דביקים אחד עם השני יכול להאריך אורך מקסימאלי זה מחייבת אבל אתגרים הולכים וגדלים בשיבוט של המבנה. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא היכולת להפיק מבנים מראש crRNA (ולכן קאש endonuclease מצעים) עם כל רצף רצוי. זה מאפשר בדיקה של עיצובי crRNA סינטטיים.

לבסוף, מראש crRNAs הגדול יותר ניתן לקבל מamplificates PCR של אלמנטים שלמים הגנומי CRISPR או שבריהן. שינויים בתבנית לשעתוק מבחנת הפלסמיד יכולים להיות הציג דרך mutagenesis אתר המכוון לייצור גרסות טרום crRNA. מבנים אלה יכולים לשמש כדי לנתח את דפוס מחשוף endonucleolytic הגלובלי בתוך כלמראש crRNA.

עבודתו החלוצית לייצור רנ"א פולימרז לא עבר כל שינוי באמצעות T7 RNA במבחנת התעתיק התבססה על העברת RNAs ¹⁴ ו פסיפס וירוס RNA Brome ^15. אמרגן RNA פולימראז T7 הקונצנזוס מורכב מתחום הכרה (-17 עד -5) ותחום ייזום (-4 עד +6) עם ייזום שעתוק בguanosine חיוני 1 ^16. מורד עמדות של 1 יכול להיות מגוון המאפשר לשעתוק של כמעט כל רצף RNA רצוי. השיטות שהוצגו להפקה בתבניות שעתוק ניגרו מבחנה לאפשר לסינתזה במבחנה של-crRNAs מראש מלא התואמים את אזורי CRISPR הגנומי או גרסות סינטטיות מראש crRNA. את התמלילים נוצרים בהווה אדנוזין 5'-מסוף, אלא בתגובת השעתוק ערוכה עם GMP להשיג monophosphate 5 'termini ^14. termini כאלה נדרשים אם את התמלילים הם להיות מתויגעם קינאז polynucleotide T4 ו-γ ^[32 P]-ATP. פעילות מחשוף של Cas6 ואנזימים Cas6 דמויים מייצרת crRNA המכיל 5'-הידרוקסיל ו2 "טרמיני, 3'-מחזורי פוספט. RNAs אלה לאחר מכן ניתן לנתח להכרה על ידי מורכב אשד.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות (אופציונלי)
אנטארקטיקה phosphatase	חוד	M0289L
בTriphosphates מבחנת תמלול כיתת ultrapure נוקלאוטיד	ג'נה Bioscience	NU-1010 - NU-1013
כרומטוגרפיה נוזלית, 100 ktapurifier	GE Healthcare
oligonucleotides דנ"א	MWG אופרון
oligonucleotides RNA	MWG אופרון
ערכת חילוץ ג'ל	Qiagen	28704
ערכת טיהור PCR	Qiagen	28104
ספין Miniprep קיט	Qiagen	27106
קיט מקסי פלסמיד	Qiagen	12163
BamHI	חוד	R0136L
HindIII	חוד	R0104L
אנזים DNA T4	חוד	M0202S
קינאז polynucleotide T4	Ambion	AM2310
פולימראז T7-RNA	הכנה של
מיקס הפתרון Deoxynucleotide	חוד	N0447L
מערכת אלקטרופורזה טטרה מיני הפרוטאי	Bio-Rad	165-8001
840 סורק הסערה	GE Healthcare	163723
האחסון Phosphorscreen	דינמיקה מולקולרית	63-0034-81
ש מונה 5/50 GL	GE Healthcare	17-5166-01
פולימראז ה-DNA Phusion הגבוה פידליטי	חוד	M0530L	להשתמש במאגר GC
Toluidine הכחול	סיגמא	T3260
pUC19	חוד	N3041S
γ-[32 P]-ATP, α-[32 P]-ATP	הרטמן אנליטית	SRP-401, SRP-307