השימוש במערכי חלבון שלב הפוכים (RPPA) לחקור וריאצית ביטוי חלבון בתוך הסרטן של תאי כליה בודד

Summary

RPPA מאפשר ביטוי החלבונים של מאה דגימות, שהודפסו בשקופיות ניטרוצלולוזה לחקירה בו זמנית, תוך שימוש בנוגדנים שכותרתו fluorescently. טכניקה זו יושמה כדי לבחון את ההשפעה של טיפול תרופתי בהטרוגניות קרצינומה של תאים של כליה ברורה.

Abstract

כיום לא קיים טיפול מרפא לטיפול בסרטן גרורתי של תאי הכליה ברור תא, הגרסה הנפוצה ביותר של המחלה. גורם מרכזי בעמידות לטיפול זה נחשב למורכבות המולקולרית של המחלה ^1. טיפול ממוקד כגון מעכבי טירוזין קינאז (TKI)-sunitinib כבר נוצל, אבל רק 40% מחולים יגיבו, עם הרוב המכריע של חולים אלו התקפיים בתוך שנת 1 ^2. כפי השאלה כזו של התנגדות פנימית ורכש בחולי סרטן תאי כליה היא רלוונטית מאוד ^3.

כדי ללמוד התנגדות לTKIs, עם המטרה הסופית של פיתוח טיפולים יעילים ומותאם אישית, רקמה רציפה לאחר תקופה מסוימת של טיפול ממוקד היא חובה, גישה שהוכיחה את הצלחתה ^ב4 לוקמיה מיאלואידית כרוניות. עם זאת יישום של אסטרטגיה כזו בקרצינומה של תאי כליות הוא מסובך בשל הרמה הגבוהה של both ההטרוגניות ובין intratumoral, בו היא תכונה של קרצינומה של תאים של כלית ^5,6, כמו גם גידולים מוצקים אחרים ^7. ההטרוגניות Intertumoral בשל הבדלים גנטיים transcriptomic ומבוססת היטב גם בחולים עם מצגת דומה, שלב ודרגה של גידול. בנוסף ברור שיש הטרוגניות רבה המורפולוגי (intratumoral) בRCC, שעשוי לייצג את ההטרוגניות מולקולרית גדולה עוד יותר. מיפוי וסיווג מפורט של גידולי RCC ידי ניתוח צורני משולב ודירוג Fuhrman מאפשרים בחירה של אזורים יציגים לניתוח proteomic.

ניתוח מבוסס חלבון של RCC ⁸ הוא אטרקטיבי בשל הזמינות הנרחבת שלה במעבדות פתולוגיה, עם זאת, יישומה עלול להיות בעייתי בשל הזמינות המוגבלת של נוגדנים ספציפיים ^9. בשל אופי נקודת הכתם של מערכי חלבון השלב ההפוכים (RPPA), סגולי נוגדנים ב חובהדואר מראש תוקף; כבקרת איכות קפדנית כל כך של נוגדנים המשמשים הוא בעלת חשיבות עליונה. למרות מגבלה זו פורמט כתם הנקודה אינו מאפשר מזעור assay, המאפשר הדפסה של מאה דגימות לשקופית ניטרוצלולוזה אחת. שקופיות מודפסות אז ניתן לנתח באופן דומה לניתוח מערבי עם השימוש בנוגדני היעד ספציפיים עיקריים ונוגדנים משניים שכותרתו fluorescently, המאפשרות ריבוב. ביטוי חלבון הפרש בכל הדגימות בשקופית אז ניתן לנתח בו זמנית על ידי השוואת הרמה היחסית של קרינה באופן יעיל, חסכוניים יותר ותפוקה גבוהה.

Protocol

1. זיהוי של ההטרוגניות גידול מורפולוגי והמולקולריות

1. גידולים הוסרו מ-80 ° C מקפיא ושמרו על קרח יבש.
2. מחלק גידולים למקטעים של כ 1 סנטימטר ^3. למפות את המיקום המקורי של כל סעיף יחסית לזה גידול ותווית עם שם ייחודיים. דגימות חנות ב cryovials הבודד ב-80 ° C עד מוכן לשימוש.
3. דגימות מעייל באוקטובר ולקצץ בcryostat ב-22 ° C.
4. דוגמאות מוכתמות באמצעות Hematoxylin ושיטת counterstaining Eosin.
5. הניתוח מיקרוסקופי של חלקים קפואים כדי לוודא שהם בטבע ccRCC, גידול בר קיימא ולדירוג (ציון נמוך, ציון נמוך / גבוה בכיתה או מעורב גבוה, המאתגרים להבחין Fuhrman ציוני 1-4 בקטע שהוקפא). איור 1 & b (צביעת H & E מדרגה נמוכה ומעורבת גבוהה).
6. בחר עד 4 דגימות מכל אזור מורפולוגית שונה בתוך כל גידול להפקת חלבון.

2. הפקת חלבון מדגימות גידול

1. חותך מדגם גידול מאוקטובר
2. מקום 50-75 מ"ג של רקמה לתוך 2 צינורות מ"ל עם 990 μl של חיץ תמוגה [50 mM טריס-HCl (pH 7.5), 5 המ"מ EGTA (pH 8.5), 150 המ"מ NaCl] השלים עם aprotinin (סיגמה A6279) (10 מ"ג / מ"ל), הקוקטייל phosphatase מעכב 2 (Sigma, P5716), קוקטייל מעכב phosphatase 3 (Sigma, P0044) וקוקטייל מעכב פרוטאז (Roche, 11836153001).
3. הוסף כדור פלדה אחת 5 מ"מ לכל צינור והומוגני ב50Hz במשך 5 דקות פעמים באמצעות TissueLyser, בודקות את הרמה של הומוגניזציה אחרי כל תקופה של 5 דקות.
4. העברת מדגם הומוגני לצינור החדש מ"ל 2 באמצעות פיפטה משאירה מאחורי כדור הפלדה.
5. הוסף 10 μl של טריטון X-100 לכל דגימה לפני צנטריפוגה ב XG 13000 למשך 30 דקות ב 4 ° C.
6. העברת supernatants לצינורות microcentrifuge טריים.
7. קביעת ריכוז חלבון באמצעות BCA assay (איור 2).
8. לנרמל ריכוזי חלבון ב1 מ"ג / מ"ל.

3. דודו נוגדן

1. הכן דגימות חלבון (המופק משורות תאים מתאימות או רקמות) לכתם מערבי ולהפעיל על 10% ג'ל SDS-PAGE.
2. העברת דגימות על קרום ניטרוצלולוזה הלילה ב 4 ° C.
3. חסום את הקרום במאגר חסימת אודיסיאה Li-קור (בדילול 50:50 בPBS) עבור 1 שעה בטמפרטורת חדר.
4. לדלל את הנוגדנים הראשוניים במאגר חסימת אודיסיאה Li-קור (בדילול 50:50 בPBS) ביצרנים מומלץ בדרך כלל דילול 1 ב1000.
5. דגירת קרום בנוגדני הלילה עיקריים ב 4 ° C.
6. איפור 0.1% PBS-Tween20 (PBS-T; 1 המ"ל Tween20 / 1L PBS).
7. שטוף את הקרום בPBS-T בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות (x3).
8. לדלל fluorescently שכותרתו נוגדנים משניים במאגר אודיסיאה חסימה (בדילול 50:50 בPBS) 0.01% SDS בדילול 1:10,000 (1.5 μl/15 מ"ל).
9. דגירת קרום בתיכוןנוגדנים בטמפרטורת חדר למשך 45 דקות עם טלטול עדין - חשוב להגן על הקרום מן האור עד לזמן שזה כבר סוף הסוף סרוק.
10. שטוף את הקרום בPBS-T בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות (x3), שמירה על הקרום בחושך.
11. שטוף את הקרום ב PBS בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות (x3) להסיר Tween20 שייר, שוב שמירת הקרום בחושך.
12. לשקר קרום שטוח על פיסת נייר סינון בחושך ולאפשר לייבוש באוויר - דבר המאפשר את הקרום להתייבש עשוי להגביר את האות ולהפחית רקע, אבל להפוך אותו חסר תועלת להפשטה ומחדש חיטוט-.
13. סרוק את הקרום בסורק אודיסיאה LiCor. שמור על הקרום בחושך עד למועד שבו נסרק.
14. בחר רק נוגדנים שיוצרים להקה שולטת יחידה במשקל המולקולרי הנכון. איור 3 מציג דוגמאות של נוגדנים מקובלים ולא מקובלים לשימוש עם RPPA.

4. RPPA פריnting

1. lysates החלבון נצפו על שקופיות זכוכית מצופית ניטרוצלולוזה (Fastslides-Whatman) באמצעות MicroGrid השני רובוטית משקיף. את השקופיות השתמשו הכילו 2 רפידות שעליו דגימות נכתמו. כל כרית הייתה מוכתמת בדגימות זהות, במקרה זה 100 דגימות. פורמטים נוספים זמינים כוללים 1, 8 ו 16 שקופיות כרית. המספר הגבוה יותר של רפידות קטנים יותר במספר הדגימות שניתן הבחין על גבי כל אחד.
2. סדרה של חמישה דילולים 2-קיפול נעשתה מכל מדגם וכל אחד היה אז הבחינה בשלושה עותקים (וכתוצאה מכך הסכום כולל של 15 נקודות לדגימה).

5. איתור החלבון RPPA

1. מגלשות רטובות במאגר חסימת LiCor עודף (בדילול 50:50 בPBS). לדגור על RT לשעה 1 בפלטפורמת נדנדה.
2. הכן 800 μl של נוגדנים עיקריים במאגר חסימת LiCor (בדילול 50:50 בPBS) בריכוזים הרצויים ולשמור על קרח.
3. הר את השקופיות באחת (אני) קליפ יפ מסגרת אחתאו (ii) החזיק שקופיות המפרץ "FastFrame '4, כך שחותם חזק נוצר בין השקופיות ותא הדגירה.
4. הסר חיץ השיורי מהבארות ולהוסיף נוגדן ראשוני 600 μl לבארות בהתאמה.
5. הנח את השקף והחדר לתוך קופסה אטומה רטובה ולדגור על הפלטפורמה מתנדנד בין הלילה ב 4 ° C.
6. איפור 0.1% PBS-Tween20 (PBS-T; 100 20 Tween μl / המ"ל PBS 100).
7. הסר שקופיות מהחדר הקר ולהסיר את הנוגדנים העיקריים בזהירות מכל באר.
8. הוסף 600 μl של PBS-T ולשטוף שקופיות על נדנדת פלטפורמה בRT למשך 5 דקות (X3).
9. הכן fluorescently שכותרתו נוגדנים משניים על ידי דילול במאגר אודיסיאה חסימה (בדילול 50:50 בPBS) 0.01% SDS ב1:2,000 דילול (μl 1/2 מ"ל) בערכאה הראשונה.
10. הסר חיץ מהבארות ולהוסיף 600 μl נוגדנים משניים שהכותרת-fluorescently לבארות בהתאמה. דגירת נוגדנים משניים בטמפרטורת חדר למשך 45 דקות עם טלטול עדין - זהחשוב להגן על הקרום מן האור עד לזמן שזה כבר סוף סוף הסריקה.
11. הסר נוגדנים משניים מלשטוף היטב ובקצרה (x3) ב600 μl PBS-T בטמפרטורת חדר. הסר שקופית ממנשא, להעביר למכל מתאים ולשטוף בעודף PBS-T במשך 15 דקות, תוך שמירה על הקרום בחושך.
12. הסר קרום נוסף לשטוף עם PBS בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות PBS-T ולהסיר-20 Tween השיורית, שוב מקפיד על הקרום בחושך.
13. ייבש את Fastslide בתנור 50 ° C למשך 10 דקות ולאחר מכן לסרוק בסורק אודיסיאה Li-הקור. שמור את השקופית בחושך עד שנסרק.
14. סרוק את השקופית ב680 ננומטר ו / או 800 ננומטר בהתאם הנוגדן / נוגדנים משמשים המשני. לאיתור שני צבעים תמיד להשתמש נוגדנים משניים החוצים adsorbed מאוד למזער תגובה צולבת. בחירה זהירה של נוגדנים ראשוניים ומשניים היא הכרחית לזיהוי בשני צבעים. חשיבות העיקרית היא הבחירה שלמינים שונים מארחים (ארנב ועכבר למשל) לשני הנוגדנים היסודיים. זה מאפשר אפליה על ידי נוגדנים משניים נגד ארנב ואנטי עכבר שכותרתו עם צבע בספקטרום פליטה להבחין בקלות.
15. קבצי תמונות נשמרים כקבצים. tiff. איור 4 (תמונה של קבצים סרוקים).

6. ניתוח נתונים

1. הפעל את תוכנת MicroVigene (VigeneTech, קרלייל, מסצ'וסטס, ארה"ב).
2. פתח. קובץ תמונת TIFF המכיל סריקה של שקופית RPPA.
3. בחר קובץ תבנית מוגדרת מראש שיהיה לו רשת לכיסוי על התמונה של שקופית RPPA.
4. לחץ על הגדרת אזורים של עניין כפתור (ROI), כדי להעלות את הרשת.
5. מקם את הרשת מעל נקודתי RPPA. איור 6 א (דמותה של רשת מעל תמונה).
6. לחץ על לחצן בחר הכל כדי לסמן את כל את ההחזר על ההשקעה.
7. לחץ מצא הכל. MicroVigene יהיה automatically למצוא את ההחזר על ההשקעה, מוצא את הנקודות, לחסר רקע, להסיר כל אבק וכתמים לכמת.
8. לחץ על הלחצן Curve הדילול צפו להעלות את התוצאות לכל הדגימות בשקופית RPPA.
9. לחץ על שמירת נתוני דילול.
10. ככל דגימה מודפסת על פני 5 נקודות כל דילול בשלושה עותקים יש 15 נקודות לניתוח, אשר מפחית את הסיכון לטעויות ומשפר את האיכות הולמת עקומה. MicroVigene מייצר לוגיסטי-4-יומן אלגוריתם פרמטר מודל "Supercurve" (איור 6 ב), המשלב את כל הנקודות כדי לייצר עקומת סיגמואיד של קינטיקה המחייבת אנטיגן נוגדן. ההנחה היא שקינטיקה המחייבת נוגדנים אנטיגן הזהה מתרחשת בכל מקום מדגם, אפילו בדגימות השונות, ולכן על ידי לקיחה כל הכתמים על מערך שיתאים לעקומת תגובה משותפת יכול להגביר את האמון של התאמת עקומות ^10,11
    Y = + (BA) (/ (1 + e (ג * D-ln (x)))
    כאשר x הוא dilution הגורם וY הוא עוצמת האות.
    דוגמאות ניתן לנתח יחסית באמצעות y0 הערך, אשר בניתוח שלנו תואם את ערך Y בנקודת האמצע של ערכי x לאחר מיפוי אלה על supercurve.
11. לייצא את הנתונים ב-Microsoft Excel ועלילת y0 כמו באיור 7.
12. שונות חלבון intratumoral חושבו בנפרד עבור מטופלים שלא טופלו ויטופלו במסגרת ניתוח שונה. הפצות שונות המשלבות נתונים מכל החלבונים נתחו הושוו על ידי מאן ויטני מבחן (MWT). סטיות intratumoral לחלבונים בודדים הושוו ע"י מבחן F שבו נחות של נורמליות וhomoscedasticity התקיימו, בהתאמה הוערכו באמצעות Lillefours ובדיקות Fligner; שיעור גילוי שקר (רוזוולט) תיקון יושם ^12. ביטוי חלבון הפרש בין דגימות חולה לא טופלו ומטופלים נבדק עבור כל חלבון באמצעות תלמיד מבחן t של נורמליות שבו והנחת homoscedasticityזה היה נפגש, אחרת MWT בוצע; רוזוולט היה מוחל על ערכי t-מבחן וMWT משולבים ^12. משמעותו של ביטוי חלבון ומתאם פירסון השונה של החלבונים נאמדה באמצעות גישה סטנדרטית [R התייחסות] ורוזוולט מיושם ^12.

תוצאות

דוגמה לשקופית RPPA סרוקה ניתן לראות באיור 4 (א) עם שני 680 ו 800 ערוצי ננומטר המוצגים. מפריד את התמונות על ידי אורך גל, איור 4 (ב) מאפשר לכל משטח על ביטוי חלבון בודד נקבע איור 4 (ג) שקופית RPPA להיות מנותחים. כפי שניתן לראות באיור 4 (ג) לביטוי של ח...

Discussion

שיטת RPPA מוצגת כאן מייצגת אלטרנטיבת תפוקה גבוהה לשימוש נרחב, אך נמוכה יחסית טכניקת הכתם מערבי תפוקה של ניתוח חלבון. השיטה מאפשרת מאת דגימות להיות חצי כמותית נתחו והשוואה בו זמנית מאפשר השוואה ישירה של חלבוני מפתח במגוון רחב של שורות תאים ודגימות רקמה. ריבוב עם מיני נו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים
aprotinin	סיגמא	A6279
קוקטייל מעכב phosphatase 2	סיגמא	P5726
קוקטייל מעכב phosphatase 3	סיגמא	P0044
קוקטייל מעכב פרוטאז	רוש	11836153001
טריטון X-100	טריטון-X	T8787
אודיסיאה Li-קור חסימת המאגר	Li-קור	927-40000
TissueLyser	Qiagen	85600
MicroGrid השני רובוטית טיווח	Biorobotics
4 החזיק שקופיות המפרץ "FastFrame	Whatman	10486001
שקופיות FAST - 2-Pad	Whatman	10485317
IRDye 680LT עיזים אנטי עכבר IgG	Licor	926-68020
IRDye 800CW עיזים נגד ארנב IgG	Licor	926-32211