Der Einsatz von Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) an Protein Expression Variation innerhalb der einzelnen Renal Cell Cancers erkunden

Zusammenfassung

RPPA ermöglicht die Proteinexpression von Hunderten von Proben auf Nitrozellulose Folien gedruckt, um gleichzeitig abgefragt werden, mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern. Diese Technik angewendet worden ist, um die Wirkung der medikamentösen Behandlung Heterogenität innerhalb klarzelligen Nierenkarzinom studieren.

Zusammenfassung

Derzeit gibt es keine kurative Behandlung für metastasierten klarzelligen Nierenzellkarzinoms, der häufigsten Variante der Krankheit. Ein wichtiger Faktor in diesem Therapieresistenz wird gedacht, um die molekulare Komplexität der Erkrankung ¹ sein. Gezielte Therapie wie die Tyrosinkinase-Inhibitor (TKI)-Sunitinib genutzt wurden, aber nur 40% der Patienten reagieren, mit der überwältigenden Mehrheit dieser Patienten schubförmig innerhalb von 1 Jahr ^2. Als solche ist die Frage der intrinsischen und erworbenen Resistenz in Nierenzellkrebskranken ist höchst relevant ^3.

Um den Widerstand gegen TKI zu studieren, mit dem Ziel der Entwicklung wirksamer, individuell abgestimmte Behandlungen wird sequentielle Gewebe nach einer bestimmten Zeit der gezielten Therapie erforderlich, ein Konzept, das sich bewährt bei chronischer myeloischer Leukämie ⁴ hatte. Doch die Anwendung einer solchen Strategie in Nierenzellkarzinom ist durch das hohe Niveau der b kompliziertoth inter-und intratumorale Heterogenität, die ein Merkmal des Nierenzellkarzinoms ^5,6 sowie anderen soliden Tumoren ⁷ ist. Intertumoral Heterogenität aufgrund der Transkriptom-und genetische Unterschiede ist gut, auch bei Patienten mit ähnlichen Präsentation, Stadium und Grad des Tumors festgestellt. Darüber hinaus ist es klar, dass es große morphologische (intratumorale) Heterogenität in RCC, die wahrscheinlich noch größere molekulare Heterogenität repräsentieren. Detaillierte Kartierungen und Kategorisierung von RCC Tumoren durch kombinierte morphologische Analyse und Fuhrman Einstufung ermöglicht die Auswahl von repräsentativen Flächen für Proteomanalyse.

Protein-basierte Analyse der RCC ⁸ ist attraktiv wegen seiner breiten Verfügbarkeit in Pathologie-Laboratorien, aber ihre Anwendung problematisch sein kann aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von spezifischen Antikörpern ^9. Aufgrund der Dot-Blot Art der Reverse Phase Protein Arrays (RPPA), Antikörper-Spezifität muss be vorvalidierten, als solche strengen Qualitätskontrolle von Antikörpern verwendet wird, ist von größter Bedeutung. Trotz dieser Einschränkung der Dot-Blot-Format nicht zulässt Assay Miniaturisierung, so dass für den Druck von Hunderten von Proben auf einen einzelnen Nitrocellulose Folie. Bedruckte Folien können dann in einer ähnlichen Weise wie Western-Analyse werden unter Verwendung von Ziel-spezifischen primären Antikörper und fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper analysiert, so dass für Multiplexing. Differential Proteinexpression in allen Proben auf einer Folie kann dann gleichzeitig durch Vergleichen der relativen Pegel der Fluoreszenz in einer kostengünstigeren und Weise mit hohem Durchsatz untersucht werden.

Protokoll

Ein. Identifizierung von morphologischen und molekularen Tumorheterogenität

1. Tumore von -80 ° C Gefrierschrank entfernt und auf Trockeneis aufbewahrt.
2. Dividieren Tumoren in Abschnitte von etwa 1 cm ^3. Karte die ursprüngliche Position von jedem Tumor Abschnitts relativ zu einander und das Etikett mit einem eindeutigen Namen. Lagern Sie die Proben in den einzelnen Kryoröhrchen bei -80 ° C bis zur Verwendung.
3. Coat Proben in Oktober und schneiden in einem Kryostaten bei -22 ° C.
4. Proben gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin Gegenfärbung Methode.
5. Mikroskopie Analyse von Gefrierschnitten, um sicherzustellen, sie sind von klarzelligen Natur, lebensfähige Tumorzellen und Planieren (low grade, high grade oder gemischte low / high grade, schwierig zu unterscheiden, Fuhrman Klassen 1 bis 4 auf gefrorenen Abschnitt). Abbildung 1 a & b (H & E-Färbung der hoch niedrig und gemischte Klasse).
6. Wählen Sie bis zu 4 Proben von jeder morphologisch unterschiedliche Regionen innerhalb der einzelnen Tumor-Protein-Extraktion.

2. Protein Extraction aus Tumorproben

1. Cut Tumorprobe vom Oktober
2. Ort 50-75 mg Gewebe in 2 ml-Röhrchen mit 990 ul Lysepuffer [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EGTA (pH 8,5), 150 mM NaCl] mit Aprotinin (Sigma A6279) (10 mg ergänzt / ml), 2-Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (Sigma, P5716), Phosphatase-Inhibitor-Cocktail 3 (Sigma, P0044) und einem Protease-Inhibitor-Cocktail (Roche, 11836153001).
3. Hinzufügen eines einzelnen 5 mm Stahlkugel in jedes Röhrchen und homogenisieren bei 50Hz für 5 min zweimal mit einem TissueLyser, die Überprüfung der Höhe der Homogenisierung nach jeder 5 min Zeit.
4. Übertragen homogenisierte Probe auf neue 2-ml-Tube mit Pipette Verlassen der Stahlkugel hinter sich.
5. Fügen Sie 10 ul Triton X-100 zu jeder Probe vor dem Zentrifugieren bei 13.000 × g für 30 min bei 4 ° C.
6. Übertragen Überstände an die frische Mikrozentrifugenröhrchen.
7. Bestimmen Proteinkonzentration mit BCA-Assay (Abbildung 2).
8. Normalisieren Proteinkonzentrationen von 1 mg / ml.

3. Antikörper Validation

1. Planen Proteinproben (extrahiert aus geeigneten Zelllinien oder Gewebe) für Western Blot und auf einem 10% SDS-PAGE-Gel.
2. Übertragen Proben auf Nitrozellulosemembran Nacht bei 4 ° C.
3. Sperrung der Membran in Li-Cor Odyssey Blocking Buffer (50:50 verdünnt in PBS) für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
4. Verdünnen Sie die primären Antikörper in Li-Cor Odyssey Blocking Buffer (verwässert 50:50 in PBS) bei den Herstellern empfohlenen Verdünnung typischerweise 1 in 1.000.
5. Inkubieren Membran in primären Antikörper über Nacht bei 4 ° C.
6. Make-up 0,1% PBS-Tween20 (PBS-T, 1 ml Tween20 / 1L PBS).
7. Waschen Membran in PBS-T bei Raumtemperatur für 5 min (x3).
8. Verdünnten Sekundärantikörper in Odyssey Blocking Buffer (verwässert 50:50 in PBS) 0,01% SDS bei 1:10,000 Verdünnung (1,5 μl/15 ml) fluoreszenzmarkierten.
9. Inkubieren Membran in sekundärenAntikörper bei Raumtemperatur für 45 min unter leichtem Schütteln - es ist wichtig, um die Membran von dem Licht, bis zu dem Zeitpunkt, zu schützen, wie er letztlich gescannt wurden.
10. Waschen Membran in PBS-T bei Raumtemperatur für 5 min (x3), Halten der Membran in der Dunkelheit.
11. Waschen Membran in PBS bei Raumtemperatur für 5 min (x3), um restliche Tween20 zu entfernen, wieder Halten der Membran in der Dunkelheit.
12. Lie Membran flach auf einem Stück Filterpapier in der Dunkelheit und an der Luft trocknen - so die Membran zu trocknen kann das Signal zu verbessern und reduzieren Hintergrund, aber unbrauchbar machen zum Abisolieren und wieder Sondieren.
13. Scannen Sie die Membran auf der Licor Odyssey Scanner. Halten der Membran in der Dunkelheit, solange es abgetastet wurde.
14. Nur auswählen Antikörpern, die eine einzelne Bande bei der überwiegenden korrekten Molekulargewicht zu erzeugen. 3 zeigt Beispiele für akzeptable und inakzeptable Antikörper zur Verwendung mit RPPA.

4. RPPA Printing

1. Protein-Lysate wurden auf Nitrocellulose-beschichtete Glasobjektträger (Fastslides-Whatman) mit einem MicroGrid II Roboter spotter gesichtet. Die Folien verwendet wurden, enthielten 2 Pads, auf die die Proben wurden gesichtet. Jedes Pad wurde mit identischen Proben entdeckt, in diesem Fall 100 Proben. Andere verfügbare Formate sind 1, 8 und 16 Pad gleitet. Je höher die Anzahl von Pads je kleiner die Anzahl von Proben, die auf die jeweils gesichtet werden kann.
2. Eine Reihe von fünf 2-fache Verdünnungen wurden von jeder Probe hergestellt und jedes wurde dann in dreifacher gesichtet (was zu insgesamt 15 Flecken pro Probe).

5. RPPA Protein-Erkennung

1. Feuchten Präparate im Überschuß Licor Blocking Buffer (50:50 verdünnt in PBS). Inkubation bei RT für 1 Stunde auf einem schaukelnden Plattform.
2. Planen 800 ul Primärantikörper in Licor Blocking Buffer (50:50 verdünnt in PBS) in den gewünschten Konzentrationen und auf Eis.
3. Montieren Sie die Folien in entweder (i) der einzelnen Frame Chip Clipoder (ii) die "FastFrame 'vier Bucht Objektträgerhalter so dass eine Abdichtung zwischen dem Schieber und der Inkubationskammer gebildet.
4. Reste von Waschpuffer aus Brunnen und fügen Sie 600 ul primären Antikörper in die jeweiligen Vertiefungen.
5. Legen Sie die Folie und Kammer in einem verschlossenen nassen Box und inkubieren on rocking-Plattform über Nacht bei 4 ° C.
6. Make up 0,1% PBS-Tween20 (PBS-T; 100 ul Tween 20/100 ml PBS).
7. Objektträger aus kalten Raum und entfernen Sie vorsichtig die primären Antikörper aus jeder Vertiefung.
8. Fügen Sie 600 ul PBS-T und waschen Dias on rocking-Plattform bei RT für 5 min (X3).
9. Planen fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper durch Verdünnung in Blockierungspuffer Odyssey (verdünnt in PBS 50:50) 0,01% SDS bei 1:2000 Verdünnung (1 ul / 2 ml) in der ersten Instanz.
10. Entfernen Puffer aus Brunnen und fügen Sie 600 ul fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper die jeweiligen Vertiefungen. Sekundärantikörper Inkubieren bei Raumtemperatur für 45 min unter leichtem Schütteln - esWichtig ist, die Membran von dem Licht, solange es endgültig abgetastet schützen.
11. Entfernen Sekundärantikörper aus gut waschen und kurz (x3) in 600 ul PBS-T bei Raumtemperatur. Objektträger vom Träger, in einen geeigneten Behälter übertragen und waschen über PBS-T für 15 min, halten die Membran in der Dunkelheit.
12. Entfernen PBS-T und ferner Waschen Membran mit PBS bei Raumtemperatur für 15 min, um restliche Tween-20 zu entfernen, wieder Halten der Membran in der Dunkelheit.
13. Trocknen Sie die Fastslide in 50 ° C Ofen für 10 min und dann scannen auf dem Li-Cor Odyssey Scanner. Halten Sie die Folie in der Dunkelheit, bis es gescannt wurde.
14. Scannen die Folie bei 680 nm und / oder 800 nm in Abhängigkeit von der sekundären Antikörper / Antikörper verwendet. Für zweifarbige Detektion immer hochvernetzten adsorbierten Sekundärantikörper an Kreuzreaktivität minimieren. Eine sorgfältige Auswahl der primären und sekundären Antikörper ist notwendig für Zweifarb-Detektion. Von vorrangiger Bedeutung ist die Auswahl derHost verschiedenen Spezies (z. B. Kaninchen-und Maus) für die beiden primären Antikörper. Dies ermöglicht Diskriminierung durch Anti-Kaninchen und Anti-Maus-Sekundärantikörper, der mit Farbstoff mit leicht unterscheidbare Emissionsspektren markiert sind.
15. Bilddateien werden als. Tiff-Dateien gespeichert. Abbildung 4 (Bild der gescannten Dateien).

6. Data Analysis

1. Starten Sie die MicroVigene Software (VigeneTech, Carlisle, MA, USA).
2. Zu öffnen. Tiff Bilddatei mit dem Scan des RPPA Folie.
3. Auswählen eines vordefinierten Vorlagendatei, die ein Gitter auf dem Bild des Schiebers RPPA überlagern erhalten wird.
4. Klicken Sie auf das Definieren Regions of Interest (ROI)-Taste, um das Grid.
5. Positionieren Sie den Grid über die RPPA Flecken. 6a (Bild Raster über Bild).
6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Alle auswählen, um alle ROI markieren.
7. Klicken Sie auf Alle. MicroVigene wird autommatisch finden ROI, finden Sie die Flecken, subtrahieren Sie den Hintergrund, entfernen Sie Staub und quantifizieren Flecken.
8. Klicken Sie auf die Ansicht Verdünnungskurve Taste, um die Ergebnisse für alle Proben auf der RPPA Folie.
9. Klicken Sie auf Speichern Dilution Data.
10. Da jede Probe über 5 Verdünnung Punkten gedruckt wird jeweils dreimal gibt es 15 Punkten zu analysieren, wodurch die Gefahr von Fehlern vermindert und verbessert die Qualität der Kurvenanpassung. MicroVigene erzeugt eine 4-Parameter logistic-log-Modell "Supercurve"-Algorithmus (6b), die alle Spots eine Sigmoid-Kurve von Antigen-Antikörper-Bindung Kinetik produzieren enthält. Die Annahme ist, dass die gleichen Antikörper-Antigen-Bindungskinetik findet in jeder Probe vor Ort, auch in den verschiedenen Proben, also, indem alle Punkte auf einem Array eine gemeinsame Antwort-Kurve passen, das Vertrauen der Kurvenanpassung ^10,11 zu erhöhen
    Y = a + ((ba) / (1 + e (c * d-ln (x)))
    wobei x der dilution Faktor und Y ist die Signalintensität.
    Proben können unter Verwendung der vergleichsweise y0-Wert, der in der Analyse zu der y-Wert entsprach am Mittelpunkt der x-Werte nach dem Mappen denjenigen auf den supercurve analysiert werden.
11. Exportieren Sie die Daten in Microsoft Excel und Grundstück y0 wie in Abbildung 7.
12. Intratumorale Protein Varianz wurde getrennt für unbehandelte und behandelte behandelten Patienten in einer ANOVA Rahmen berechnet. Varianz Verteilungen Kombinieren von Daten aus allen analysierten Proteine ​​wurden durch einen Mann-Whitney-Test (MWT) verglichen. False discovery rate (FDR) Korrektur wurde ^12; Intratumorale Abweichungen für einzelne Proteine ​​wurden durch einen F-Test, bei denen Annahmen von Normalität und Homoskedastizität statt, jeweils mit den Lillefours und Fligner Tests beurteilt verglichen. Differential Proteinexpression zwischen unbehandelten und behandelten Patienten Proben wurde für jedes Protein unter Verwendung des Student-t-Test, bei dem Normalität und Homoskedastizität Annahmes erfüllt sind, sonst MWT durchgeführt wurde; FDR wurde über kombinierten t-Test und MWT Werte ¹² angelegt. Bedeutung der Proteinexpression und Varianz Pearson-Korrelation für die Proteine ​​wurden mit Hilfe eines Standard-Ansatz [R Referenz] und FDR angewendet ^12.

Ergebnisse

Ein Beispiel eines gescannten RPPA Schieber kann in 4 (i) sowohl mit 680 und 800 nm dargestellt Kanäle erkennen. Trennen der Bilder durch Wellenlänge, Abbildung 4 (ii) kann jedes Pad auf der RPPA Schieber zu analysierenden und individuelle Proteinexpression bestimmt Abbildung 4 (iii). Wie in 4 gesehen werden kann, (iii) die Expression von Proteinen in den Proben ist einzigartig mit Gelsolin mit einem hohen Grad der Expression auf den ...

Diskussion

Die RPPA hier vorgestellte Methode stellt einen hohen Durchsatz Alternative zu den weit verbreiteten, aber vergleichsweise geringen Durchsatz Western-Blot-Technik von Protein-Analyse. Das Verfahren erlaubt Hunderte von Proben werden semiquantitativ ausgewertet und gleichzeitig zur direkten Vergleich der wichtigsten Proteine ​​in einem breiten Auswahl von Zelllinien und Gewebeproben. Multiplexen mit unterschiedlichen Antikörperspezies weiter erhöht die Leistung der Technik so dass mehrere Antikörper gleichzeitig e...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer
Aprotinin	Sigma	A6279
Phosphatase-Inhibitor-Cocktail 2	Sigma	P5726
Phosphatase-Inhibitor-Cocktail 3	Sigma	P0044
Proteaseinhibitorcocktail	Roche	11836153001
Triton X-100	Triton-X	T8787
Li-Cor Odyssey Blocking Buffer	Li-Cor	927-40000
TissueLyser	Qiagen	85600
MicroGrid II Roboter spotter	Biorobotics
FastFrame "vier bay Diahalter	Whatman	10486001
FAST Slide - 2-Pad	Whatman	10485317
IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG	Licor	926-68020
IRDye 800CW Ziege anti-Kaninchen IgG	Licor	926-32211