Velocimetry תמונת מיקרו חלקיקים למדידות בפרופיל מהירות של מיקרו זורם דם

Summary

velocimetry תמונת מיקרו חלקיקים (μPIV) משמש כדי לחזות תמונות לזווג של חלקיקי מיקרו נזרעו בזורם דם אשר חוצה קורלציה לתת פרופיל מהירות מדויקת. שיעור גזירה, מהירות המרבית, צורת פרופיל מהירות, וקצב זרימה, כל אחד מהם יש יישומים קליניים, ניתן לגזור ממדידות אלה.

Abstract

velocimetry תמונת מיקרו חלקיקים (μPIV) משמש כדי לחזות תמונות לזווג של חלקיקי מיקרו נזרעו בדם זורם. התמונות הן בין קורלציה לתת פרופיל מהירות מדויקת. פרוטוקול מוצג למדידות μPIV של דם זורם בmicrochannels. בקנה המידה של זרימת הדם, אינו יכול להיחשב דם נוזל הומוגני, כפי שהוא השעיה של חלקיקים המרחפים גמישים בפלזמה, נוזל הניוטונית. שיעור גזירה, מהירות המרבית, צורת פרופיל מהירות, וקצב זרימה יכולים לנבוע ממידות אלו. כמה פרמטרים מרכזיים כגון עומק מוקד, ריכוז חלקיקים, ותאימות מערכת, מוצגים כדי להבטיח נתונים מדויקים ושימושיים יחד עם דוגמאות ותוצאות עבור נציג hematocrits השונים ותנאי זרימה.

Introduction

גוף האדם מכיל כלי רבים עם הקוטר פחות מ 50 מיקרומטר, שהם אתר הבורסה הראשי בין דם וברקמות. המחקר של זרימת דם בכלים האלה מייצג אתגר משמעותי הן בשל קנה המידה של מדידות ואת המאפיינים של נוזל דם. מדידות אלה, כוללים שיפוע הלחץ, הגזירה בקיר, ופרופילי מהירות בעורקים קטנים וvenules, הם גורמים מרכזיים הקשורים בתגובות פיסיולוגיות. כיום יש הזדמנויות חסרות תקדים לפתרון אתגרי מדידה אלה, הודות לניסיוני בטכניקות חדשות בקנה מידת מיקרו כדי ללמוד את זרימת הדם ולפתור את הבעיה multiscale זה.

velocimetry תמונת מיקרו חלקיקים (μPIV) הוא טכניקת הדמיה המבוססת על זרימת חלקיקים המשמש להערכת פרופילי מהירות זרימת דם בmicrochannels באמצעות מתאם צלב. μPIV, פותח לראשונה על ידי סנטיאגו et al., כבר בשימוש עם hemorheologyמחקרים מאז Sugii et al. בשנת 2001 השתמשו בטכניקה כדי למדוד את זרימת דם ב100 מיקרומטר צינורות זכוכית עגול ^1,2. קיימות גישות שונות לμPIV. מצלמות מהיר יכולות לשמש כדי לתאם את תנועתם של תאי דם אדומים (RBCs), ותמונות פעמו יכולות לשמש כדי לתאם את תנועתם של חלקיקים נותבים. אחת מהאפשרויות אלה יכולים להיות בשילוב עם מיקרוסקופ זקוף או הפוך, בהתאם ליישום. בשני המקרים, התוצאה היא פרופיל מהירות 2D. גישה אחרת היא להשתמש במיקרוסקופ confocal להשיג פרופילי 2D and 3D. שיטה זו יושמה לדם ^3,4,5.

יש מיקרו בקנה מידה PIV כמה סיבוכים בהשוואה למאקרו PIV. במאקרו PIV יכולים להיות מוגבלים את הנתונים למטוס בודד באמצעות גיליונות של אור, אבל בקנה מידת מיקרו נפח התאורה הוא הכרחי. תאורת נפח היא בעיה גדולה יותר להדמיה של זרימת דם מיקרו, כמו את RBCs עצמם הם גדולים בהשוואה לגhannels, והשימוש בRBCs כמו החלקיקים נותב מוביל עד לעומק של מתאם (DOC) אשר יכול להפחית באופן משמעותי את הדיוק של התוצאות חוצות קשר ^6,7,8. בעקבות Wereley et al. (1998) DOC לערוץ 40 מיקרומטר גבוה עם RBC כקליעים נותבים הוא 8.8 מיקרומטר, ואילו עם חלקיקים נותב 1 מיקרומטר DOC הוא 6.7 מיקרומטר. הבדל זה הופך להיות בולט יותר בעת שינוי גובה ערוץ וגדלה. בנוסף, RBCs הם אטומים, והגדלת הצפיפות של RBCs בזרימה גורמת לקשיי הדמיה. חלקיקים נותב fluorescing, שימוש לראשונה על ידי סנטיאגו et al. (1998), כבר דגלו ככלי כדי להקטין את ההשפעה של חלקיקים מחוץ למיקוד, בעת שימוש בחלקיקים הקטנים ביותר האפשריים. שימוש fluorescing קוטר 1 מיקרומטר microparticles יחד עם לייזר הוא גישה אחת שעשוי להקטין את עומק הבעיה במיקוד מיקרו זרימת דם הדמיה ^10. ישנן מספר ביקורות שוטפות של מדינת μPIV טקhnology, כל אחד מהם מדגיש את החשיבות של μPIV למחקרי זרימת דם ^11,12. כמה שיקולים חשובים חייבים להילקח בחשבון בעת ​​שימוש μPIV לדם. ברמת המיקרו, בקנה המידה של זרימת הדם, אינו יכול להיחשב דם נוזל הומוגני, כפי שהיא השעיה של תאים גמישים דם אדום (RBCs), תאי דם לבנים גדולים, טסיות דם וחלבונים אחרים המצויים בנוזל הניוטונית (פלזמה) .

את פרופילי המהירות שנמדדו כאן ניתן להשתמש כדי למדוד את מאפיינים מסוימים של את הדם זורם מיקרו. הגורמים החשובים בmicrohemorheology הם קצב הזרימה של הדם, את הצורה של פרופיל המהירות, ומאמץ הגזירה בקיר של כלי השיט. מידע זה יש השלכות קליניות, כמו זרימת הדם הוא האתר להמרת חומרי מזון בגוף, וחילופי הדברים הוא גזירה תלויה. ישנם מספר מחקרי סקירה שוטפים על מצב מחקר בזרימת הדם, כמו גם ^13,14,15.

מוצג כאן הוא פרוטוקול למדידות μPIV של דם זורם בpolydimethylsiloxane (PDMS) microchannels. ערוצי PDMS היו מפוברקים בתוך הבית בעקבות המקורות בסעיף 1 לפרוטוקול. דגימות דם נלקחו מחזיריים מטבחיים מוכר וניקו סעיף 2 לפרוטוקול הבא. כל הנתונים הושגו באמצעות LaVision Mitas μPIV המערכת, כפי שתוארה בסעיף 3 לפרוטוקול. ההגדרה מורכבת מNd: YAG לייזר (גל חדש מחקר, ארה"ב) ומצלמת CCD (תמונה אינטנסיבית, Lavision) הנשלט על ידי יחידה לתכנות מפעילה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי יחד עם שלב 3 שנע בצירים, ומחשב, בנוסף למצלמה במהירות גבוהה (DALSA 1M150, הולנד) נוספה להדמיה של RBCs עצמם. שתי המצלמות מחוברות לתיבה אופטית יציאת 2 (מותאם אישית על ידי Zeiss, גרמניה). בטיפוסי במדידות vivo של זרימת דם, משמש מיקרוסקופ זקוף כדי לעקוב אחר RBCsmselves, ואילו ביישומים טיפוסיים במבחנה משמשת מיקרוסקופ הפוכה כדי לעקוב אחר החלקיקים נותבים. בייחודי כפולה זו ההגדרה, תיבת אופטיקה מאפשרת לשני קליעים נותבים להיות צילמו באמצעות מיקרוסקופ ההפוך. דם הוכנס לשבבים באמצעות משאבת מזרק דיוק גבוהה (Nexus3000, Chemyx Inc, ארה"ב). תרשים של המערכת מוצג באיור 1, שבו החלק העליון של הדמות מייצג את 140 מיקרומטר ידי 40 ערוצים מלבניים מיקרומטר מפוברק של PDMS, ואת החלק התחתון מייצג את המערכת כולה כולל שתי המצלמות, לייזר, משאבת המזרק ו מיקרוסקופ.

μPIV הנוכחי להגדיר קופצים זמין, בדרך כלל עם תוכנת קניינית, כולל TSI, Dynamics Dantec, וLaVision. ניתן להשיג אלגוריתמים חוצים קשר רגילים דרך אפשרויות תוכנה רבות, כולל MATLAB. התוכנה היא לא המפתח, להבין מה את תיבות הדיאלוג מתאימות לבחינה מתמטית ישמשו שימושR הרבה יותר טוב. בפרוטוקול זה דיוויס, תוכנת הקניינית של LaVision או MATLAB מנוצלות. הפרוטוקול הוא לא תוכנה ספציפית, אבל האפשרויות בתפריט יכולות להיות במקומות שונים בחבילות תוכנה שונות.

Protocol

1. שבב ייצור

הצעד הראשון הוא ליצור או לרכוש microchannel שלך. ישנן אפשרויות רבות עבור חומר שבב אלקטרוני.

אחד החומרים הנפוצים ביותר שנבחרו הוא פולי (dimethylsiloxane) (PDMS). ישנם פרסומים רבים על הכיוונים לPDMS ייצור באמצעות יתוגרפיה הרכה ^16,17,18.

ברגע שערוץ PDMS הוא מפוברק, ישנם מספר טיפולי שטח העומדים לרשות להפוך hydrophobicity הטבעי שלה. טיפול פלזמה חומצן הוא אפשרות נפוצה.

ואו, אליס, וVoelcker (2009) נותנים סקירה של טיפולי שטח וכיצד הם משפיעים על PDMS. תוצאות אלו הן למים לעומת זאת, ויש לו דם מאפיינים שונים. מחקר על מה שאומר על טיפול במשטח דם נעשה על ידי פיטס et al. (2012a).

לקבלת התוצאות שהוצגו כאן, משטחי שבבים ושקופיות הזכוכית הם היוערובה לשניהם נחשפו לפלזמת חומץ למשך 45 שניות ולאחר מכן לחץ יחד כתוצאה היטב בקשר קבוע.

2. הכנת דם

1. לאסוף דגימות דם ממתקן מוכר. לדוגמא דם חזירי ניתן להשתמש בחומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) כנוגד קרישה. הוסף 1 גרם EDTA עם 4 מ"ל של מים, ולאחר מכן להוסיף את הפתרון לכל 1 ליטר של הדם, ערבוב בעדינות 10x.

כשתרימו את דגימות דם, לאפשר להם להתקרר באיטיות לRT. דגימות דם צריכה להיות טריות, ומשמשות באופן אידיאלי היום הם נאספים כדי לשמר את מאפייני rheological של הדם.

דגימות עשויות להיות בקירור פעם אחת ב RT; דם כל זאת ללא נוגד קרישה יהיה שמיש לאחר קירור. בהתאם לנוגד הקרישה, יכול להישמר בקירור RBCs לתקופה של עד 42 ימים, וכולו דם יכול להישמר בקירור במשך 35 ימים, אך הזיהום יהיה אפשרי שבאינם מ 'מתקן edical ^21.

בנוסף, יש להיזהר משיטת איסוף דגימות עם שור או חזיריות, ולמנוע זיהום על ידי מח עצם.

2. צנטריפוגה דגימות דם 3x בסל"ד 3000 למשך 10 דקות בכל פעם. לאחר צנטריפוגה הראשונה, הסר את הפלזמה ומעיל באפי, זורקים. זה בדרך כלל הקל ביותר כדי להסיר את הפלזמה ראשונה, ולאחר מכן למחוק או לשמור לשימוש עתידי, ולאחר מכן להסיר את מעיל באפי לבד.

להציג את פיפטה לאט, כדי שלא לערבב את מעיל באפי חזרה אל הדם. לאחר הסרת מעיל באפי, להוסיף כ -20 מ"ל של בופר פוספט (PBS) ומערבבים בעדינות, recentrifuge. חזור על השלב אחרון. לאחר צנטריפוגה השלישית, הסר את מעיל באפי PBS ונותר, זורקים.

כמו כן ניתן להשתמש בפלזמת היליד במקום PBS אם אתה רוצה לשמור את מאפייני הצבירה של הדם. הקפד לא לערבב כל אפי מעיל או לבןתאי דם לתוך הפלזמה.

3. קח את תאי דם אדומים (RBCs ניקו) ולהשעות בPBS או פלזמה בריכוזים רצויים (hematocrits). בדקו hematocrits עם microcentrifuge (CritSpin FisherSci, ארה"ב).

דם ב -10 עד 20% המטוקריט צריך להיות קל יותר לדמיין מאשר 40 או 50% (המטוקריט פיסיולוגי). בזרימת הדם, הדם הוא בדרך כלל חצי המטוקריט של מחזור מאקרו, ולכן H = 20 הוא נאות ^15.

4. הוסף fluorescing חלקיקים נותבים בריכוז הרצוי לדגימות הדם. הכלל הוא שיש 10 חלקיקים בחלון מתאם, אשר יכול להיות מחושבים מראש.

לדוגמה, 30 μl של חלקיקים מתווספים ל1 מ"ל של תמיסת דם להגדרה המתוארת בסרטון. לחלופין, את RBCs עצמם יכולים להיות מתויג fluorescently.

5. בנוסף לכך, להפוך את פתרון כיול עם מים ושפעתorescing חלקיקים. יהיה צורך לכייל את המערכת עם פתרון הניוטונית.

לדוגמה, בעת שימוש במטרת 10X עם ערוץ בקנה המידה של 100 מיקרומטר, ריכוז מתאים הוא 300 μl של חלקיקים מעורבבים עם 15 מ"ל של מים מזוקקים. אפשרות נוספת היא להשתמש בגליצרול מדולל במים מזוקקים לצמיגות של 3cP, שהוא קרוב יותר לצמיגות המאקרו של הדם.

3. מדידות μPIV

1. בטיחות לייזר: בדקו טמפרטורה ולחות. להרכיב משקפיים בטיחות לייזר מתאימים. סגור את וילון לייזר או להדליק את סימן לייזר על דלת המעבדה על כדי למנוע מאנשים אינם מוגנים מלהיות חשוף.
2. הליך עם תוכנת דייוויס מוצג בסרטון. לפרטים נוספים עיין במדריך למשתמש של מערכת ספציפית.
3. לפני שלקח את הנתונים, היקף המצלמה צריך להיות מכויל באמצעות מיקרומטר.
4. כדי להקטין את התאימות של המערכת, השתמש בכמות הקצרה ביותר של צינורותד המזרק הנוקשה הקטן ביותר האפשרי, כגון מזרק 15 או 50 μl המילטון gastight. כדי להפחית זליגה של דם או צריכת אוויר למערכת, לאטום צינור למזרק ולשבב. ניתן לעשות זאת עם דבק, PDMS או וזלין (נזהר שלא לזהם את הדם).

כדי למלא את מזרק מיקרו עם מים מהולים חלקיקים נותב להשתמש בשיטת backflow מכיוון שעוצמת השמע של מזרק מיקרו היא בדרך כלל הרבה יותר קטנה מאשר הנפח למלא.

השיטה שלנו מורכבת backflow למלא את מזרק מיקרו וערוץ יחד באמצעות הפלט של הערוץ באמצעות מזרק פלסטיק משני. לשם כך, תחילה להסיר את מזרק מיקרו הבוכנה, ואז לדחוף את הנוזל באמצעות מזרק הפלסטיק הקלסית שצורף ליציאה של הערוץ, לאפשר את זרימת הנוזל מתוך מזרק מיקרו עד שכל microbubbles נמצא מחוץ למייקרו מזרק, צינורות או שבב, סוף סוף החזיר את הבוכנה, ונתק את מזרק הפלסטיק. נוכחות oהיעדר R של microbubbles ניתן לאמת עם מיקרוסקופ.

5. רמת משאבת המזרק כדי להשיג צינורות אופקי. לתכנת את משאבת המזרק לקצב זרימה רצויה.

להיות מודע להשפעות המעבר האפשריות, כמו "אפקט צוואר הבקבוק", למערכת נוקשה או התאימות של המערכת שמשנה את קצב הזרימה בפועל. פעמים אופייניות של מערכת יכולות להיות מוערכות כפונקציה של החומרים והממדים של המערכת. (פרק 2, עמ '77-81, Tabeling, 2005)

6. הנח שבב על הבמה מיקרוסקופ ולהתחיל את המשאבה. השתמש במים עם חלקיקים לכייל את המערכת לפרופיל המהירות הבינונית ולכייל את dT (הזמן בין תמונות פעמו).

החלקיקים צריכים לנוע בין 5 ל 10 פיקסלים בין מסגרות למתאם טוב ^11. כאשר הכיול, להיות זהיר כדי למדוד באמצע הערוץ. מטוס ההתמקדות באמצע יש הגבוה ביותרמהירות ^8.

אם להשתמש בערוץ עגול, להיות זהיר של הצללה אפקטים.

תמונת מדגם מוצגת באיור 2, תוך שימוש במצלמת פעם, ואילו בתמונה העליונה היא הדופק הראשון והתמונה התחתונה היא הדופק השני. ניתן לראות באיור שהנקודות הבהירות (fluorescing חלקיקים) הן הכי בפוקוס.

7. אופציונלי: על ידי לקיחת נתונים בגבהים שונים ניתן לשחזר פרופיל מהירות 3D על ידי הוספת הווקטורים השונים לתמונה אחת. הווידאו מציג את שגרה שפותחה עבור האוטומציה של התהליך.
8. כאשר לוקחים נתונים עם הדם, למלא את המזרק עם כמות רצויה של דם באותה השיטה כמו מים. לתכנת את משאבת המזרק לקצב הזרימה הרצויה, ולקחת את הנתונים רצויים. דוגמה לתמונות גולמיות המתקבלות מוצגת באיור 2. היזהר של שקיעת RBC גם כן. מילוי במזרק כל ריצה או כלריצה אחרת תפחית את יישוב RBC.
9. לאחר רכישת תמונות, מתאם הצלב מבוצע על זוגות התמונה לקבל שדות וקטור מהירות בין תמונות. זה חשוב לנו תמונות טובות שיש מתאם טוב. לפני תתאים, אפשר לעשות עיבוד מראש כדי להסיר רעשי רקע.

מתאם הצלב נעשה בין חלונות בתמונות הסמוכות, אשר יכולה להיות מגוונות בגודל ובצורה להשפיע על הקשר. לאחר מתאם צלב, אפשר לעשות את עיבוד תמונה להודעה להסיר וקטורים או חריגים שגויים.

ניתן למצוא תיאור מפורט של האפשרויות הזמינות השונות ודיוקיהם בפיטס et al. (2012b), שבו העיבוד הטוב ביותר עבור דם נמצא כי השיטה של "תמונת חפיפה" עם החלונות הוארך באורך ומיושר עם הזרם . ניתן לעשות פעולות אלו באופן ידני בתכנית כמו MATLAB, או בתוך חבילת תוכנה עם המערכת שלך. תוכנה היא לא חשובה, את המתמטיקה שמאחורי הפעילות היא חשובה יותר וכל פעולה יכולה להשפיע על הדיוק של פרופיל המהירות הסופי.

יכולים להיות בממוצע הווקטורים וכתוצאה מכך השטח מעבר לתעלה כדי להשיג פרופילי מהירות רגעיים, ולאחר מכן שוב בממוצע בזמן כדי להשיג את פרופיל מהירות ממוצע, נציג. Kloosterman et al. (2011) נותן הסבר לשגיאה במדידות μPIV בי עומק השדה הוא גדול. ניתן למצוא דיונים על השגיאה של עיבוד נתונים שהוצג כאן בפיטס et al. (2012b) למדידות ופעמו Chayer et al. (2012) למדידות במהירות הגבוהות.

דוגמאות לפרופילי מהירות מוצגות באיורים 3 ו -4. איור 3 מציג פרופיל מהירות אחת לאמצע של זרימת 10 μl / שעה של RBC ב-H = 10 בערוץ 140 מיקרומטר רחב.

אוהל "> פרופיל יחיד זו מושגת על ידי חישוב ממוצע וקטורי קורלציה מעבר לתעלה כדי לקבל פרופיל מהירות, ולאחר מכן בממוצע בזמן כדי לקבל מדידה מייצגת. במקרה זה, 100 זוגות היו בממוצע בזמן על פני שדה הראייה.

דוגמה לפרופיל המשוחזר 3D נלקח לכיול זרימת מים בערוץ מרובע 100 מיקרומטר עם קצב זרימה מתוכנת של 30 μl / שעה נמצאת באיור 4. באיור 4, את הפרופילים נמדדים במרווחים של 1 מיקרומטר.

10. אופציונלי: בתמונות המתוארות הגדרת המהירות הגבוהות שניתן לנקוט באותם תנאים על ידי מיתוג מצלמות (ורכישת מערכות מידע). זה יכול להיות שימושי עבור לדמיין את שכבת תא ללא בערוץ, וצבירה לכימות. ניתוח הנתונים הוא שונה במקצת (Chayer et al., 2012).

דוגמאות של תמונות אור לבנות עם ובלי RBC צבירה הן presented באיור 5 ב-H = 20. את התמונות למעלה מראה H = 20 ב-PBS, אשר מסיר את היכולת של RBC לצבירה, בμl 1 / שעה. התמונה התחתונה היא H = 20 בפלזמה האם ברמה של 0.5 μl / שעה. בתמונה התחתונה, הצבירה גלויה.

11. לסגור את המערכת בצורה בטוחה כאשר הושלמו מדידות. השתמש בנהלי בטיחות לייזר מתאימים עד לייזר מקור כוח הוא לסגור לחלוטין.

תוצאות

בכל הדמויות, זרימה היא משמאל לימין בתמונות גולמיות, ומעלה במהירות פרופילים מחושבים. דוגמה של הנתונים הגולמיים שהושגו בדם במטוקריט H = 10 זורמים ב10 μl / שעה מוצגת באיור 2. הנתונים גולמיים ניתן לחצות-מתואמים ללא כל עיבוד נתונים כדי להשיג פרופילי מהירות. ההשפעה של ?...

Discussion

שימוש μPIV למדידות זרימת דם בקנה המידה של זרימת הדם יכול לתת תובנה מספר רב של תהליכי הנדסה ביו רפואית, מכאני וכימיים הנוגעים בדבר. חלק מגורמי המפתח לחשבון להוא הצפיפות של RBC עצמם, וצבירת deformability של RBC, הצבירה או התנועה של חלקיקי מייקר fluorescing, ויישובם של RBC בערוצים. כל אלה י?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
poly(dimethylsiloxane) (PDMS), i.e. Sylgard-184	Dow-Corning	3097358-1004
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	E9884-100G
poshpate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
fluorescing micro particles	Microgenics/FisherSci	R900
glycerol (OPTIONAL)	Sigma Aldrich	G6279-500 ml
microcentrifuge, i.e. CritSpin	FisherSci	22-269-291
syringe, i.e. 50 μl Gastight	Hamilton	80965
camera, i.e. Imager Intense, high speed	LaVision, Dalsa	Imager Intense
microscope, i.e. MITAS	LaVision	MITAS
Nd:YAG laser	New Wave Research	Solo-II
syringe pump, i.e. Nexus3000	Chemyx, Inc.	Nexus-3000
flexible tubing, i.e. Tygon	FisherSci	14-169-1A
data processing software, i.e. DaVis	LaVision	DaVis
centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2	Thermo Scientific	004260F