Mikro Kan akış hızı Profil ölçümleri için mikro-parçacık imaj velosimetri

Özet

Mikro-parçacık görüntü velosimetri (μPIV) doğru bir hız profili vermek için çapraz ilişkili olan kan akışındaki numaralı seribaşı mikro parçacıklar eşleştirilmiş görüntüleri görselleştirmek için kullanılır. Klinik uygulama için, her biri kesme hızı, maksimum hız, hız profili şekil ve akış hızı, bu ölçümler elde edilebilir.

Özet

Mikro-parçacık görüntü velosimetri (μPIV) kan akımlarında numaralı seribaşı mikro parçacıklar eşleştirilmiş görüntüleri görselleştirmek için kullanılır. Görüntüler doğru bir hız profili vermek için çapraz ilişkili bulunmaktadır. Bir protokol mikro kan akımlarının μPIV ölçümleri için sunulmuştur. Mikro ölçeğinde, kan plazma, Newton tipi bir sıvıda asılı esnek parçacıkların bir süspansiyon olarak, homojen bir sıvı olarak kabul edilemez. Kayma hızı, maksimum hız, hız profili şekil ve akış hızı bu ölçümler elde edilebilir. Bu odak derinliği, partikül konsantrasyon ve sistem uyum gibi çeşitli anahtar parametreleri, çeşitli hematokrit ve akış koşulları için örnekler ve temsilcisi sonuçları ile birlikte doğru, yararlı veriler sağlamak için sunulmuştur.

Giriş

İnsan vücudu kan ve doku arasındaki temel değişim sitesi olan çapları az 50 mikron, ile çok sayıda gemi içerir. Bu damarlarda kan akımı çalışma ölçümlerin ölçek ve kanın sıvı özellikleri hem nedeniyle önemli bir sorun teşkil etmektedir. Basınç farkı, duvara kesme ve arteriol ve venüllerdeki hız profilleri dahil Bu ölçümler, fizyolojik yanıtlar ile bağlantılı önemli faktörlerdir. Bu ölçüm zorlukları çözmek için eşi görülmemiş fırsatlar, mikro çalışma ve bu ölçek sorunu çözmek için mikro ölçekte yeni deneysel teknikler sayesinde artık vardır.

Mikro-parçacık görüntü velosimetri (μPIV) çapraz korelasyon ile mikro kan akım hızı profilleri değerlendirmek için kullanılan bir parçacık tabanlı akış görüntüleme tekniğidir. İlk Santiago ve ark. tarafından geliştirilen μPIV, Hemoreoloji ile kullanılmışSugii ve arkadaşları bu yana çalışmaları. 2001 yılında 100 mikron yuvarlak cam tüplerde ^1,2 kan akışını ölçmek için tekniği kullanılmıştır. ΜPIV varlığını farklı yaklaşımlar. Yüksek hızlı kameralar kırmızı kan hücrelerinin (RBC) hareketi ilişkilendirmek için kullanılabilir, ve darbeli görüntü izleme partiküllerin hareketi ilişkilendirmek için kullanılabilir. Bu seçeneklerden herhangi birini uygulamaya bağlı olarak, dik ya da ters bir mikroskop ile birleştiğinde olabilir. Her iki durumda da, sonuç 2B hız profilidir. Diğer bir yaklaşım, 2D ve 3D profil elde etmek için bir konfokal mikroskop kullanmaktır. Bu yöntem, kan ^3,4,5 uygulanmıştır.

Makro PIV ile karşılaştırıldığında mikro ölçekli PIV çeşitli komplikasyonlar vardır. Makro PIV verileri ışık yaprak ile tek bir düzleme sınırlı olabilir, ancak mikro ölçekli ses aydınlatma de gereklidir. Eritrositler kendilerini C ile karşılaştırmalı olarak büyük olduğu gibi Cilt aydınlatma, mikro kan akışı görüntüleme için daha büyük bir sorundurhannels ve izleyici parçacıklar olarak kırmızı kan hücreleri ile önemli ölçüde çapraz-bağıntı sonuçları ^6,7,8 doğruluğu azaltabilir korelasyon derinliğe (DOC) yol açar. 1 mikron izleyici parçacık ile DOC 6.7 mikron iken izleyiciler olarak RBC ile 40 mikron boyunda kanal için Wereley et al. (1998) DOC ardından, 8.8 mm. Kanal yüksekliği ve büyütme değiştirirken bu fark daha belirgin hale gelir. Buna ek olarak, RBC opak ve akış eritrositlerde yoğunluğu artan görüntüleme problemlere yol açmaktadır. Mümkün olan en küçük parçacıklar kullanırken ilk Santiago ve ark. (1998) tarafından kullanılan floresanlama izleyici parçacıklar, out-of-odak parçacıkların etkisi azaltmak için bir araç olarak savunulmuştur. 1 mikron çaplı Florasanl kullanarak lazer ile birleştiğinde mikropartiküller mikro kan akımı görüntüleme ¹⁰ odak sorunun derinliğini azaltabilir bir yaklaşımdır. ΜPIV tec eyaletinin çeşitli güncel yorum varkan akım çalışmaları ^11,12 için μPIV önemini vurgulamaktadır her biri hnology,. Kan μPIV kullanıldığında birkaç önemli hususlar dikkate alınmalıdır. Mikro düzeyde, mikro ölçekte, kan, bir Newton tipi sıvı (plazma) içinde süspansiyon haline esnek kırmızı kan hücrelerinin (RBC), geniş, beyaz kan hücreleri, trombositler ve diğer proteinlerden bir süspansiyon olarak, homojen bir sıvı olarak kabul edilemez .

Burada ölçülen hız profilleri mikro kan akımları belirli özelliklerini ölçmek için kullanılabilir. Microhemorheology en önemli faktörler, kan akış hızı, hız profilinin şeklini, ve kabın duvarına kesme stres vardır. Mikro vücutta besin alışverişi için site olduğu için bu bilgiler, klinik etkileri vardır, ve bu değişim kesme bağımlıdır. Mikro araştırma durumuna birkaç mevcut gözden geçirme ^{çalışmaları,} hem de ¹³ vardır14,15.

Burada sunulan polidimetilsiloksan (PDMS) mikro kan akımlarının μPIV ölçümleri için bir protokoldür. PDMS kanalları protokol 1. bölümde kaynakları takip içi hazırlandı. Domuz kan örnekleri akredite bir mezbaha elde edilen ve protokol bölümünde 2 sonra temizlendi. Tüm veriler gibi protokol bölüm 3'te tarif LaVision MİTAŞ μPIV sistemi kullanılarak elde edilmiştir. YAG lazer (New Wave Araştırma, ABD) ve CCD kamera (Resim Yoğun, Lavision) programlanabilir bir tetikleme ünitesi, 3 eksende hareket eden bir sahne ile birleştiğinde bir floresan mikroskop ve bir bilgisayar tarafından kontrol,: set-up bir Nd oluşur yüksek hızlı bir kamera (Dalsa 1M150, Hollanda) ek olarak kırmızı kan hücreleri kendileri görselleştirilmesi için ilave edildi. Her iki fotoğraf makinesi, 2 port optik kutusu (Zeiss Özel, Almanya) bağlanır. Kan akımı in vivo ölçümleri tipik olarak, dik bir mikroskop kırmızı kan hücreleri izlemek için kullanılırmselves, in vitro uygulamalarda tipik bir ters bir mikroskop izleyici parçacıkları izlemek için kullanılır ise. Set-up Bu benzersiz çift olarak, optik kutusu hem izleyiciler ters bir mikroskop kullanılarak görüntülü sağlar. Kan bir yüksek hassasiyetli şırınga pompası (Nexus3000, Chemyx Inc, ABD) ile mikroçip girmiştir. Sistemin bir diyagramı Şekil üst kısmı PDMS işlenmiş 40 um dikdörtgen kanallar 140 mikron temsil Şekil 1 'de gösterildiği üzere, ve alt kısmında iki kamera, lazer, şırınga pompası ve bir de dahil olmak üzere tüm sistemi temsil eder mikroskop.

Güncel μPIV set-up mevcuttur, genellikle özel yazılım ile, TÜİK, Dantec Dinamiği ve LaVision içerir. Standart çapraz korelasyon algoritmaları MATLAB gibi birçok yazılım seçenekleri, ile elde edilebilir. Yazılım diyalog kutuları matematiksel kullanımı hizmet edecek karşılık anlama, anahtar değilr çok daha iyi. Bu protokol Davis, LaVision tescilli yazılım veya MATLAB kullanılmaktadır. Protokol özel yazılım değil, menü seçenekleri farklı yazılım paketleri farklı yerlerde olabilir.

Protokol

1. Microchip Fabrikasyon

İlk adım Mikrokanallı oluşturmak veya satın almaktır. Mikroçip malzeme için birçok seçenek vardır.

Seçilen en yaygın malzemelerden biri (PDMS) (dimetilsiloksan) poli. Yumuşak litografi ^16,17,18 ile PDMS üretim için yönde birçok yayın bulunmaktadır.

PDMS kanal imal edildiğinde, çeşitli yüzey işlemleri, doğal hidrofob tersine çevirmek için mevcut bulunmaktadır. Oksijenli plazma tedavi ortak bir seçenektir.

Zhou, Ellis ve Voelcker (2009) yüzey işlemleri bir eleştiri vermek ve PDMS nasıl etkilediğini. Bu sonuçlar, ancak su, ve kan farklı özelliklere sahiptir. Bu yüzey işleme kan için ne anlama geldiği konusunda bir çalışma Pitts ve ark. (2012A) tarafından yapılmıştır.

Sonuçları burada sunulan için, mikroçip yüzeyler ve cam slaytlar onlar45 saniye için oksijenli plazmaya maruz kalan ve daha sonra sıkı bir kalıcı bir bağ ile sonuçlanan, her ikisi de bir arada basılı bağlanmıştır.

2. Kan Hazırlık

1. Akredite bir tesis kan örnekleri toplayın. Örneğin domuz kan bir pıhtılaşma önleyici olarak etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile birlikte kullanılabilir. Su 4 ml 'si ile 1 gr EDTA ekleyin ve yavaşça karıştırılarak 10x, tam kan, 1 L çözeltisi ekleyin.

Kan örnekleri kaldırmak istediğinizde, onları RT yavaş yavaş soğumasını bekleyin. Kan örnekleri taze ve ideal onlar kan reolojik özelliklerini korumak için toplanır gün kullanılan gerekir.

Örnekler oda sıcaklığında bir kez buzdolabında olabilir; antikoagülan olmadan ancak tam kan soğutma sonra kullanılamaz hale gelecektir. Antikoagülan bağlı olarak, en fazla 42 gün için eritrositler buzdolabında tutulabilir, ve tam kan 35 gün boyunca buzdolabında muhafaza edilebilir, ancak kirlenme olmayan bir m mümkün olacaktıredical tesisi ^21.

Ayrıca, sığır veya domuz örnekleri ile toplama yöntemi dikkatli olun ve kemik iliği tarafından kirlenmesini önlemek.

2. 10 dakika her zaman için 3.000 rpm'de 3x kan örnekleri santrifüj. İlk Santrifüj sonra, plazma ve buffy coat çıkarın atın. İlk plazma kaldırmak için genellikle en kolay, ve daha sonra tek başına buffy coat kaldırmak için daha sonra, atmak veya ileride kullanılmak üzere tutun.

Kana geri buffy coat karıştırmayın şekilde, yavaşça pipet tanıtmak. Buffy coat çıkardıktan sonra, fosfat yaklaşık 20 ml (PBS) tamponlu tuzlu su ve hafifçe recentrifuge karıştırın. Son adımı yineleyin. Üçüncü Santrifüj sonra, PBS ve kalan buffy coat çıkarın atın.

Bu kan toplayarak özelliklerini tutmak istiyorsanız yerine PBS yerli plazma kullanmak da mümkündür. Herhangi bir buffy coat veya beyaz karıştırmayın emin olunplazma içine kan hücreleri.

3. Temizlenmiş kırmızı kan hücreleri (eritrositler) alın ve istenen konsantrasyonları (hematokrit) PBS veya plazma askıya. Bir mikrosantrifüj (CritSpin FisherSci, ABD) ile hematokrit kontrol edin.

10 ila 20% hematokrit kan 40 ya da% 50 (fizyolojik hematokrit) daha görselleştirmek için kolay olmalıdır. Mikro, kan genellikle makro sirkülasyon yarısı hematokrit, bu nedenle H = 20 ¹⁵ yeterlidir.

4. Kan numuneleri istenen konsantrasyonda izleme parçacıklar floresanlama ekleyin. Genel bir kural olarak önceden hesaplanabilir bir ilişki pencerede 10 parçacıklar sahip olmaktır.

Örneğin, partiküllerin 30 ul video tasvir ayarlama için kan solüsyonu, 1 ml ilave edilir. Alternatif olarak, kırmızı kan hücreleri kendilerini floresan etiketli olabilir.

5. Ayrıca, su ve grip ile bir kalibrasyon çözüm yapmakparçacıklar orescing. Bu, bir Newton çözeltisi ile kalibre sistem için gerekli olacaktır.

Örneğin, 100 mikron ölçekte bir kanalı olan 10X objektif kullanarak, uygun bir konsantrasyon damıtılmış su, 15 ml ile karıştırılır parçacıkların 300 ul. Başka bir seçenek, kan makro viskozitesi daha yakın olan 3Cp, bir viskoziteye kadar damıtılmış su ile seyreltildi gliserol kullanmaktır.

3. μPIV Ölçümler

1. Lazer güvenlik: sıcaklık ve nem kontrol edin. Uygun lazer güvenlik gözlükleri takın. Lazer perde kapatmak veya laboratuvar kapı maruz korunmaz engellemek için üzerine lazer işareti açın.
2. Davis yazılımı ile Prosedür video gösterilir. Belirli bir sistemin kullanım kılavuzuna bakın daha fazla bilgi için.
3. Veri çekmeden önce, kamera ölçekli bir mikrometre kullanılarak kalibre edilmesi gerekmektedir.
4. Sistemin uygun azaltmak için, boru, en kısa sürede bir kullanımıD bir 15 ya da 50 ul Hamilton Gaz geçirmez şırınga gibi, mümkün olan en küçük katı şırınga. Sistem içine kan ya da hava emme sızmasını azaltmak için, şırınga ve çipe boru mühür. Bu tutkal, PDMS veya vazelin (kan kontamine için dikkatli olmak) ile yapılabilir.

Mikro şırınga hacmi genellikle doldurmak için hacimden çok daha az olduğu için, izleyici parçacıkları ile bezenmiş su ile mikro şırınga doldurmak için geri akış yöntemi.

Bizim akış yöntem, bir ikincil plastik şırınga kullanılarak kanalın çıkışı ile birlikte mikro şırınga ve kanalı doldurmak için oluşur. Tüm mikro kabarcıklar mikro şırınga, tüp ya da dışarı kadar bunun için, ilk olarak mikro şırınga piston kaldırmak, daha sonra kanalın çıkışına bağlı klasik plastik şırınga kullanılarak sıvı itme, mikro şırınga üzerinden sıvı akışı sağlar çip, son olarak piston geri koymak ve plastik şırınga çıkarın. O varlığımikro kabarcık r yokluğu bir mikroskop ile kontrol edilebilir.

5. Yatay boru elde etmek için şırınga pompası Seviye. Istenen debi için şırınga pompası programlayın.

Rijit sistemi veya gerçek akış hızı değiştirmek sistemin uyum için "darboğaz etkisi", gibi olası geçici etkileri, farkında olun. Bir sistemin karakteristik zamanlar, sistemin malzeme ve boyutlarda bir fonksiyonu olarak tahmin edilebilir. (Bölüm 2, s 77-81, Tabeling, 2005)

6. Mikroskop sahnede mikroçip yerleştirin ve pompa başlar. Orta hız profili için sistem kalibre ve dT (darbeli görüntüler arasındaki zaman) kalibre etmek için parçacıkları ile su kullanın.

Parçacıklar ¹¹ için iyi bir korelasyon çerçeveler arasında 5 ila 10 piksel hareket etmelidir. Kalibre ederken, kanalın ortasında ölçmek için dikkatli olun. Ortasında odak düzlemi en yüksek olanhızı ^8.

Yuvarlak bir kanal kullanıyorsanız, etkileri gölgeleme dikkatli olun.

Örnek bir görüntü En iyi görüntü ilk sinyalin ve alt görüntü ikinci darbe ise, darbeli bir kamera kullanılarak, Şekil 2 'de gösterilmiştir. Bu parlak noktaları (floresan parçacıkların)-odak en olduğu şekilde görülebilir.

7. İSTEĞE BAĞLI: farklı yüksekliklerde veri alarak bir 3D hız profili tek bir görüntü içine farklı vektörleri ekleyerek yeniden inşa edilebilir. Video sürecinin otomasyonu için geliştirilen bir rutin sunulur.
8. Kan ile veri çekerken, su ile aynı yöntemle kan istenilen miktarda şırınga doldurun. Istenen debi için şırınga pompası programı ve istenen verileri almak. Elde edilen ham görüntüleri bir örnek Şekil 2'de gösterilmiştir. De RBC sedimantasyon dikkatli olun. Şırınga doldurma her çalıştırma veya herdiğer çalışma eritrosit yerleşim azaltacaktır.
9. Görüntüleri aldıktan sonra, çapraz korelasyon görüntüler arasında hız vektör alanları elde etmek için görüntü çiftleri üzerinde gerçekleştirilir. İyi bir ilişki için iyi görüntü olması önemlidir. Ilişkilendirerek önce, ön işleme arka plan gürültü kaldırmak için yapılabilir.

Çapraz korelasyon boyutu ve korelasyon etkileme şekli değiştirilebilir bitişik görsel pencereler arasında yapılır. Çapraz korelasyon sonra, görüntü işleme hatalı vektörler veya aykırı kaldırmak için yapılabilir.

Farklı seçenekler ve doğrulukları ayrıntılı bir açıklama Pitts ve ark bulunabilir. (2012b), kan için en iyi işleme pencere uzunluğunda uzatılmış ile "görüntü örtüşen" yöntemi bulundu ve akışı ile uyumlu nerede . Bu işlemler MATLAB gibi, ya da sistemi ile yazılım paketi içinde bir programda elle yapılabilir. yazılım önemli değil, işlemleri arkasında matematik daha önemlidir ve her işlem son hız profili doğruluğunu etkileyebilir.

Ortaya çıkan vektörleri ortalama, temsilcisi hız profili elde etmek için anlık hız profilleri elde, ve zaman içerisinde yeniden ortalama için kanal boyunca uzayda ortalama olabilir. Kloosterman ve arkadaşları. (2011) alan derinliğini büyük μPIV ölçümlerde hata bir açıklama. Burada sunulan veri işleme hata üzerine tartışmalar yüksek hızlı ölçümler için darbeli ölçümleri ve Chayer ve ark. (2012) için Pitts ve ark. (2012b) bulunabilir.

Hız profilleri örnekleri, Şekiller 3 ve 4'te gösterilmektedir. Şekil 3H de RBC 10 ul / saat akış merkez için tek bir hız profili, bir 140 mikron genişliğinde kanal = 10 sunulur.

çadır "> Bu tek bir profil bir hız profili almak için kanal boyunca ilişkili vektörleri ortalama elde, ve sonra bir temsilci ölçüm almak için zaman içinde ortalama olarak. Bu durumda, 100 çift görüş alanı genelinde sürede ortalaması alınmıştır.

30 ul / sa 'lik bir akış hızı ile programlanmış bir 100 mikron kare kanallı bir su akışı için kalibrasyon alınan 3D yeniden profilinin bir örneği Şekil 4' de bulunur. Şekil 4'te, profiller 1 mikron aralıklarla ölçülür.

10. İSTEĞE BAĞLI: set-up tasvir yüksek hızlı görüntülerde geçiş kameralar (ve veri toplama sistemleri) ile aynı koşullar alınabilir. Bu kanal hücre içermeyen katman görselleştirmek için ve toplama miktarının belirlenmesi için yararlı olabilir. Veri analizi (Chayer ve ark., 2012) biraz daha farklıdır.

Ve RBC toplama olmadan beyaz ışık görüntü örnekleri prese olanH = 20, Şekil 5 nted. Üst görüntüleri agrega için eritrosit yeteneğini kaldırır PBS, H = 20 1 ul / saat de gösterir. Alt görüntü 0.5 ul / saat de yerli plazma H = 20'dir. Alt resimde, toplama görülebilir.

11. Ölçümleri tamamlanmış zaman güvenli bir şekilde sistemini kapatın. Lazer güç kaynağı tamamen kapatılacak kadar uygun lazer güvenlik prosedürleri kullanın.

Sonuçlar

Tüm rakamlar olarak, akış ham görüntüleri ve hız profilleri yukarı doğru doğru bırakılır. Hematokrit H = 10 10 ml / st 'de akan kan ile elde edilen ham verilerin bir örneği, Şekil 2'de gösterilmiştir. Ham veri hız profilleri elde etmek için herhangi bir veri işleme olmadan çapraz korelasyon olabilir. Ön işleme ve veri işleme yöntemlerinin etkisi Pitts, et al., (2012b) tarafından tartışılmıştır. Hematorcrit H, 2 Şekil l'e benzer veri...

Tartışmalar

Mikro ölçeğinde kan akımı ölçümleri için μPIV kullanarak ilgili, mekanik biyomedikal ve kimya mühendisliği süreçlerinin çok sayıda fikir verebilir. Için hesap için önemli faktörlerden bazıları RBC kendilerini, floresanlama mikro parçacıkların RBC, toplama ya da hareketin toplama ve deforme ve kanallarda eritrosit yerleşim yoğunluğu bulunmaktadır. Tüm bu yukarıda belirtilen genel kurallar takip eğer açıklanabilir. Bu sistemi kullanarak iyi bir ölçüm için akılda tutulması gereken te...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
poly(dimethylsiloxane) (PDMS), i.e. Sylgard-184	Dow-Corning	3097358-1004
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	E9884-100G
poshpate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
fluorescing micro particles	Microgenics/FisherSci	R900
glycerol (OPTIONAL)	Sigma Aldrich	G6279-500 ml
microcentrifuge, i.e. CritSpin	FisherSci	22-269-291
syringe, i.e. 50 μl Gastight	Hamilton	80965
camera, i.e. Imager Intense, high speed	LaVision, Dalsa	Imager Intense
microscope, i.e. MITAS	LaVision	MITAS
Nd:YAG laser	New Wave Research	Solo-II
syringe pump, i.e. Nexus3000	Chemyx, Inc.	Nexus-3000
flexible tubing, i.e. Tygon	FisherSci	14-169-1A
data processing software, i.e. DaVis	LaVision	DaVis
centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2	Thermo Scientific	004260F