פלטפורמת הקרנה מבוססת לוציפראז Multiplexed לחקירת מלחמה בסרטן הקשורים להעברת אותות בתאים בתרבית

Summary

השגת הבנה ברמת מערכות של תהליכים תאיים היא מטרה של ביולוגיה של התא המודרנית. אנו מתארים כאן אסטרטגיות לכתבי לוציפראז ריבוב של תפקוד תאי שונים נקודות קצה לחקור את תפקוד גן באמצעות הגנום בקנה מידה ספריות RNAi.

Abstract

חקירת הגנום בקנה מידה של תפקוד גן באמצעות התערבות RNA (RNAi) טומנת בחובו הבטחה עצומה לזיהוי המהיר של נקודות תורפה של תאי סרטן כימי ממושמע. הגבלת הפוטנציאל של טכנולוגיה זו היא חוסר היכולת לשרטט במהירות את הבסיס המכאני של תוצאות פנוטיפי ובכך להודיע ​​לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות ממוקדות מולקולרי. אנו מתארים כאן שיטות לפרק פנוטיפים סלולריים הנגרמים על ידי גן RNAi בתיווך מיקוד באמצעות מערכות כתב מרובבות המאפשרות ניטור של סרטן מפתח תא תהליכים הקשורים. המתודולוגיה גבוהה הקרנת תוכן זה היא תכליתית וניתן להתאים בקלות להקרנה של סוגים אחרים של ספריות מולקולריות גדולות.

Introduction

מגוון של כתבים מבוססי לוציפראז לניטור מערך מגוון של תהליכים ביולוגיים סלולריים זמין באופן מסחרי. רוב ה-DNA מקודדים חלבונים אלה בונה לוציפראז הנגרמים על ידי גירויים להביע תאים ספציפיים, טרידות. הכתבים מבוססי תעתיק החזקים ביותר למקם את הביטוי של אנזים לוציפראז תחת השליטה של אלמנטים משפר סינטטיים או אזורי גנים האמרגן מבוססים היטב לאמינות שלהם בדיווח ^1,2 אירוע תעתיק רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. ישנן גם מערכות טרנס כתב לוציפראז לנצל GAL4-כטב"מ לנהוג ביטוי לוציפראז חלבון. Gal4 הוא שמרי activator תעתיק ואת כטב"מ הוא משפר לGal4 שנקשר באופן ספציפי כדי להפעיל את השעתוק של רצפי גנים שהונחו במורד זרם שלו ^3. של מערכות לוציפראז סוגים אלה נתמכים בדרך כלל על ידי שני פלסמידים DNA - אחד מקודד את חלבון GAL4 התמזג regulatoחלק ר"י של חלבון של עניין, והשנייה מקודדת חלבון לוציפראז להציב תחת שליטתו של אחד או יותר רצפי כטב"מ. לפיכך, אות לוציפראז הסלולרית משקפת את רמת הפעילות של החלבון של עניין. שימוש נפוץ נוסף של כתבים מבוססי לוציפראז הוא לניטור יציבות חלבון לפי חלבון של עניין הוא קבע את אנזים לוציפראז ^4. ללא קשר לסוג של כתב, ייזהר קונה יצוין כאן כאחד לא יכול להניח את הספציפיות של כל כתב שנחקר היטב. לפיכך, נדרשת בדיקה נאותה בשילוב של כתב בונה חדשה בכל אסטרטגית מחקר.

הבחירה של האנזים לקריאה מתוך לוציפראז יכולה להיות חשובה כמו האמינות של מרכיבי ה-DNA השולטים הביטוי שלה. בעוד גחלילית לוציפראז (פלורידה) הוא האנזים הנפוץ ביותר במבנים מסחריים זמינים, הופעתו של כתב בלוציפראז מערכות חדשות שאינם דורשות ATP (כמו במקרהשל תגובות מבוססות FL) או שישלבו אנזימים יציבים יותר שפולטים אותות חזקים יותר מבטיחים לשפר את היעילות והאמינות של פלטפורמת מחקר זה. הערה חשובה בנוגע לבחירה של כתבי לוציפראז במחקרים כימיים היא הרגישות של פלורידה לעיכוב כימי שעלולים לגרום לדיווח כוזב. מניסיוננו, אנזימים אחרים כגון Renilla או Gaussia לוציפראז (RL וGL, בהתאמה) המנצלים coelenterazine כמצע הם פחות בקלות מעוכב על ידי מולקולות קטנות ^5.

הפורמט הנפוץ ביותר לקריאת פסקי לוציפראז ריבוב כרוך בשימוש בפלורידה וRL במידה רבה ניתנה זמינות של ערכות קלות לשימוש, עם היכולת לאמוד את הפעילות אנזימטית ברצף ממדגם יחיד. ברוב ערכות, דגימות ראשונה נחשפות לluciferin כדי לחשוף רובדי פעילות פלורידה ואחריו מגיב מרווה שהופקדה בו זמנית עם coelenterazine להניב seconאות RL Dary. עם התוספת של luciferases אחר שיכול להיות מופרש כמו GL או שימוש שעוד מצע כגון Cypridina לוציפראז (CL), מספר רב יותר של אפשרויות ליצירת תוכן נתונים גבוהים באמצעות luciferases צמחו. ניתן למצוא דוגמה למסך הגנום RNAi באמצעות טכניקה זו כאן ^6. יש התקדמות הטכנולוגית אלה בתורו דרבן את הפיתוח של מנגנונים ספציפיים כדי להרוות כל סוג של אנזים לוציפראז על מנת להגביל צולבת שיחה ^7. בידיים שלנו, נציין, תדירות גבוהה יותר של "השפעות קצה" (מגמות בלתי מוסברות בפעילות תאית קשורה לקצה של תרבות צלחות כייל נוגדנים גבוהות), עם luciferases המופרש כמו GL או CL. מצד השני, luciferases מופרש כאלה הם שימושיים עבור מבחני קינטיים כפי שהם מאפשרים דגימה של אות ללא adulterating כדאיות תא.

לצורך המחקר שלנו הציג כאן, אנחנו בו זמנית יהיו לפקח על הפעילות של שלושה סרטן רלוונטיתהליכים תאיים: p53, KRAS, ומסלולי העברת אותות Wnt. הכתבים שולבו במחקר שלנו הם כתב pp53-ת"א לוק פלורידה מClontech (יקרא להלן ככתב p53-FL) ^8, מערכת כתב Elk1-GAL4/UAS-CL (להלן כתב Elk-1; Agilent), וכתב 8X TCF RL שמשלב אלמנטים משפר סינטטיים מרובים המוכרים על ידי הרגולטורים תעתיק Wnt המסלול הידועים כגורמי T-cell (או TCFs) ^9-11.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הפרוטוקול כולו נמשך כ 4 ימים.

1. הכנת התאים לsiRNA וכתב Transfection

אנו מציגים כאן פרוטוקול לחקירת ספריות siRNA באמצעות קבוצה קטנה של siRNAs (384 מערך שונה הבריכות siRNA בפורמט גם 96 עם כל בריכת בהיקף של siRNAs 4x מיקוד גן יחיד) מספריית siRNA הגנום לשם המחשה. לצורך המחקר המסוים הזה, אנו לנצל HCT116 תאים כי תערוכת איתות Wnt וKras סוטה ופעילות p53. שורת התאים המתאימה במחקרים שמטרתם לחקור את התהליכים תאיים אחרים של עניין תהיה חייב להיות מזוהות ומוערך באופן דומה.

1. שטוף ס"מ 5 10 x ² צלחות של 80-90% HCT116 תאי מחוברות עם לאחר מכן תאי קציר PBS על ידי trypsinization באמצעות 1 מ"ל של פתרון / צלחת trypsinization אחרי נטרול עם 10 מ"ל של נשר עדכון הבינוני של Dulbecco (DMEM) המכיל 2% Feטל סרום שור (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין / צלחת.
2. העברת תאים מושעים לצינור חרוטי 50 מ"ל וcentrifugate ב ~ 130 XG במשך 5 דקות, להסיר supernatant, מחדש להשעות תא גלולה ב 10 מ"ל של DMEM / 2% FBS / 1% פניצילין / סטרפטומיצין.
3. לספור את מספר התא עם דלפק תא, ולאחר מכן להפוך את פתרון תא עם 10 ⁵ תאים / מ"ל, לשמור על 150 מיליליטר השעיה תא לשלב הבא. פלייט 10 ⁴ תאים (100 μl) בכל אחד גם צלחת תרבית תאים גם 96 באמצעות מתקן נוזלי אוטומטי Multidrop (להלן Multidrop). ההשעיה התא צריכה להיות מספיק במקרה זה לציפוי 12 96 צלחות גם x.
4. דגירה הצלחות עם תאים על 37 מעלות צלזיוס באינקובטור עם 5% CO ₂ בעת הכנת תערובת transfection.

2. הכנת פתרון מניות Construct הכתב

1. לבודד את הכתב באיכות גבוהה לבנות דנ"א באמצעות תקן midiprep ערכות (NucleoBond Xtra מידי המיוצר על ידיClontech) ולדלל את ה-DNA לריכוז סופי של 1 מ"ג / מ"ל ​​לכל עיתונאי.
2. הכן 100 μl של כתב לבנות פתרון מניות על ידי שילוב של 30 μl של p53-FL, 30 μl של 8X TCF-RL, 30 μl של Elk1-Gal4, 6 כטב"מ-CL μl ו4 μl של H ₂ O להשיג תמהיל DNA עם 1:1:1:0.2 יחס סופי של הכתבים. ריכוז ה-DNA סופי של פתרון מניות שילוב ה-DNA הזה הוא 0.3 מ"ג / מ"ל.

3. הכנה מערבבים transfection siRNA / ה-DNA

בחלק זה של הפרוטוקול, אנחנו נכין את תערובות transfection siRNA / ה-DNA שיהיו מספיק לtransfecting 12 96 צלחות גם x. לבדיקה זו של ספרייה 4 צלחת 96 היטב x של siRNAs, אנו transfect כל בריכת siRNA בשלושה עותקים. מגיב transfection אנו נשתמש נקרא Effectene (Qiagen). בידיים שלנו זה מגיב היחיד שעובד עבור המשלוח בו זמני של siRNA וה-DNA לתוך תאים בתרבית.

1. לדלל 80 μl של כתב לבנות מניית סולution ב8 מ"ל של חיץ EC (Effectene קיט) כדי להשיג פתרון ה-DNA בריכוז סופי של 3 מיקרוגרם / מ"ל. באופן כללי, להכין את תערובת פתרון ה-DNA מספיק לשימוש מיידי.
2. צלחת μl 20 של פתרון ה-DNA זה היטב בכל 96 גם / צלחת. מספר 96 צלחות גם יהיה תלוי בכמה ייבחנו הבריכות siRNA. לדוגמה, במקרה זה אנו צריכים 4 96 צלחות גם x להעריך 384 הבריכות siRNA שונות.
3. את siRNAs להיבדק צריך להיות בריכוז מניות של 5 מיקרומטר. אם לא, הם יכולים להיות העתק מצופה ובדילול לריכוז זה באמצעות חיץ הדילול המומלץ משויכים לכל ספרייה.
4. העבר 2 μl של כל מנית siRNA 5 מיקרומטר למקביל גם של צלחת PCR DNA המכילה את המניות בדילול מלא עם מטפל נוזל אוטומטי Biomek. בהתאם לקנה המידה של המחקר, pipettor רב ערוצית יכול להספיק.
5. עכשיו, אוסיף μl 1 של Enhancer פתרון (Effectene ערכה) זה טוב של ה-DNA / siRNA PLAטה. זה שוב יכול להתבצע גם עם מטפל נוזל אוטומטי או pipettor רב ערוצי.
6. אפשר תגובת Enhancer להתרחש ב RT למשך 5 דקות ולאחר מכן להוסיף 3 μl של מגיב transfection Effectene היטב כל אחד ולדגור על RT במשך 10 דקות נוספות.
7. כדי לעצור את היווצרות מורכבת transfection, להוסיף 10 μl של DMEM / 2% FBS / 1% פניצילין סטרפטומיצין / היטב בכל צלחת ה-PCR.
8. העבר את 10 μl של תמהיל transfection היטב בכל הצלחת גם 96 (המכילה את התאים שנלקחו מתא החממה). כמו כל transfection תבוצע בשלושה עותקים, באותו התמהיל יחול על שתי צלחות גם 96 נוספות המכילות תאים.
9. דגירה התאים עם תערובות transfection נוספו על 37 מעלות צלזיוס בסביבת humidified עם 5% CO _{2 למשך} 36 שעות.

4. לקבוע פעילויות לוציפראז מדגימות תאים

לאחר 36 שעות, פעילויות לוציפראז מוכנות למדידהבתאי transfected. נקודת הסיום צריך להיקבע על בסיס לכל ניסוי. במחקר שלנו, זמן דגירה 36 שעות הניבו בעבר אות חזקה מספיק למשמעות קביעת תוצאה. כפי שמחקר זה משלב כתבים מרובים (אחד מופרש למדיום התרבות, ושניים אחרים הביעו בציטופלסמה התא), אנו להשיג מדידות הן מהתרבות בינונית, כמו גם lysate סלולרי.

1. זיהוי של פעילות CL במדיום התרבות:
   1. 20 μl של מדיום התרבות הוא העתק מצופה בצלחת גם לבנה אטומה 96 (או באמצעות הנדלר הנוזלי Biomek או pipettor רב ערוצי).
   2. הוסף 20 μl של חיץ assay CL (מיקוד מערכות) זה טוב.
   3. הוסף 10 μl של מצע luciferin Cypridina (מיקוד מערכות) זה טוב ולזהות פעילות CL באמצעות luminometer (קורא צלחת Pherastar מיוצר על ידי BMG לדוגמה).
2. זיהוי של פלורידה ופעילות RL:
   1. Lyse גאמות על ידי הסרת מדיום התרבות הראשונה. ניתן להשיג זאת במהירות על ידי סיבוב צלחת הפוכה ומשליך בינוניות בכיור. מדיום שנותר ניתן להסיר בעדינות על ידי הקשה במורד הצלחת ההפוכה על מגבות נייר. הוסף 30 μl של 1X חיץ תמוגה פסיבי (Promega) היטב בכל תאים באמצעות Multidrop ומניח על כיסא נדנדה פלטפורמה (בלו היא חברה אחת שעושה את אלה) להגדיר מהירות בינונית במשך 5 דקות בRT.
   2. הוסף 20 μl של assay מגיב השני לוציפראז (חלק מקיט לוציפראז הכפול Promega) באמצעות פעילות פלורידה Multidrop ומייד למדוד באמצעות luminometer. לאחר מכן, להוסיף ותפסיק מגיב Glo (Promega) שיהיה להרוות את פעילות פלורידה ויאפשר מדידה של פעילות RL. הערה: אלא אם כן אתה משתמש בתערובות מצע המאפשרים משך אות מורחב (כגון ערכות לוציפראז Dual-זוהרות מPromega), השימוש בפלאש ערכות דורש מדידה מהירה על מצע בנוסף (בתוך 5 דקות).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

למרות התקדמות במיפוי נוף מוטאציות של סוגי הסרטן שונים באמצעות מאמצי רצף הגנום מסיביים ^12-14, אנחנו עדיין לא צריכים במקום גישה שיטתית לתרגום תצפיות אלה לאסטרטגיות התערבות. בסרטן המעי הגס (CRC), מוטציות שהם חזו משפיעים על מרכיבים של שלושה תהליכים תאיים - Wnt / β-catenin, p53, ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ישנם מספר ספקים של מערכות כתב המבוססים על לוציפראז (כגון Promega, מיקוד מערכות, ניו אינגלנד Biolabs, ותרם פישר) המספקים משאבים מקוונים שימושיים עבור אלה משעשעים מסך תפוקה גבוהה בפעם הראשונה. בנוסף, מספר ביקורות מצוינות לגבי ייעול השימוש במסכי תפוקה גבוהה לגילוי הגן ואיך RNAi מ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
PathDetect Elk1 Trans-Reporting System	Agilent Technologies Inc.	219005
Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector	Clontech Lab Inc.	631914
Effectene Transfection Reagent	Qiagen Inc.	301427
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega Corp.	E1960
Cypridina Luciferase Assay reagent	Targeting Systems	VLAR-1
HCT116 cells	ATCC	CCL-247
CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay	Promega Corp.	G9260
EQUIPMENT
MultiFlo Microplate Dispenser	Labsystems Inc.	Model 832
Biomek FXP Laboratory Automation Workstation	Beckman Coulter Inc.	A31842
PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader	BMG Labtech Inc.	0471-101A
Bright-Line Reichert Hemacytometers	Hausser Scientific Company	1490