배양 세포에서 암과 연관된 신호 전달을 심문위한 멀티 플렉스 루시 페라 기반 스크리닝 플랫폼

요약

세포 프로세스의 시스템 수준의 이해를 달성하는 것은 현대 세포 생물학의 목표입니다. 우리는 여기에서 다양한 세포 기능의 다중 루시 페라 제 기자에 대한 전략을 설명하는 엔드 포인트 게놈 규모의 RNAi 라이브러리를 사용하여 유전자 기능을 심문.

초록

RNA 간섭 (RNAi의)를 사용하여 유전자 기능의 게놈 규모의 심문은 화학적으로 취급하기 쉬운 암 세포 취약점의 신속한 식별을위한 엄청난 약속을 보유하고 있습니다. 이 기술의 잠재력을 제한하면 신속하게 표현형 결과의 기계론의 기초를 묘사함으로써 분자 표적 치료 전략의 개발을 알리는 무능력이다. 우리는 주요 암 세포 관련 프로세스를 모니터링 할 수 있도록 다중 기자 시스템을 사용하여 대상 RNAi를 매개 유전자에 의한 세포의 표현형을 해체하기 위해 여기 방법을 설명합니다. 이 높은 콘텐츠 심사 방법은 다재다능하고 쉽게 큰 분자 라이브러리의 다른 종류의 검사를 위해 적용 할 수 있습니다.

서문

세포 생물 학적 과정의 다양한 배열을 모니터링 루시퍼 기반 기자의 다양한 상업적으로 사용할 수 있습니다. 이러한 DNA의 대부분은 특정 세포 자극이나 교란에 의해 표현하는 유도 루시퍼 단백질을 인코딩 구성합니다. 가장 강력한 transcriptionally 기반 기자 합성 증강 요소 또는 유전자의 프로모터 영역 생리학 관련 전사 이벤트 ^1,2를보고 자신의 신뢰성을 잘 확립의 제어하에 루시 페라 제 효소의 발현을 배치합니다. 루시 페라 제 단백질 발현을 유도하는 GAL4-UAS를 활용 횡단 기자 루시퍼 시스템도 있습니다. GAL4는 효모 전사 활성과 UAS는 GAL4은 특별히 ^3의 하류에 배치 유전자 서열의 전사를 활성화하기 위해 바인딩을 증강이다. 루시퍼 시스템의 이러한 유형은 일반적으로 두 개의 DNA 플라스미드에 의해 지원됩니다 - 하나는 조절기와 융합 GAL4 단백질을 인코딩스피 관심의 단백질의 부분, 두 번째는 하나 이상의 UAS 시퀀스의 제어 아래에 배치 루시 페라 제 단백질을 인코딩합니다. 따라서, 세포 루시 페라 제 신호가 관심의 단백질의 활동 수준을 반영합니다. 루시 페라 기반 기자의 또 다른 일반적인 사용은 그 단백질 루시 페라 제 효소 ⁴ 융합 그것에 의하여 단백질의 안정성을 모니터링합니다. 하나의 잘 심문 한 어떤 기자의 특이성을지지 않습니다 수에 관계없이 기자의 종류,주의 위험 부담이 여기에 기록됩니다. 따라서, 실사가 어떤 연구 전략의 새로​​운 리포터 구조의 결합이 필요합니다.

루시 페라 제 효소 읽기 중 선택의 발현을 제어하는​​ DNA 요​​소의 신뢰성만큼 중요 할 수 있습니다. 반딧불 루시 페라 제 (FL)에 시판 구조에서 가장 일반적으로 사용되는 효소 반면, (경우와 같이 ATP를 필요로하지 않는 새로운 루시 페라 제 리포터 시스템의 출현FL-기반 반응) 또는 그이 연구 플랫폼의 효율성과 안정성을 개선 할 것을 약속 강한 신호를 방출 안정 효소를 통합합니다. 화학 연구에서 루시 페라 제 기자의 선택에 관한 중요 사항을 거짓보고에 상승을 줄 수있는 화학 물질 억제 FL의 감수성이다. 우리의 경험에서, 기판으로 coelenterazine 활용 등 Renilla의 또는 Gaussia 루시 페라 제 (각각 RL 및 GL) 등의 효소가 덜 쉽게 작은 분자 ^5에 의해 억제합니다.

다중 루시 페라 읽기 아웃에 대한 가장 일반적인 형식은 주로 순차적으로 하나의 샘플에서 효소 활동을 측정 할 수있는 기능을 사용하기 쉬운 키트의 가용성을 부여 FL과 RL의 사용을 수반한다. 대부분의 키트에 샘플을 먼저 동시에 secon를 산출하기 coelenterazine에 기탁되어 담금질 시약 다음 FL 활동의 수준을 나타 내기 위해 루시페린에 노출되는dary RL 신호. 이러한 GL하거나 사용하는 등 Cypridina 루시 페라 제 (CL), luciferases를 사용하여 높은 콘텐츠 데이터를 등장 생성을위한 가능성의 큰 번호와 같은 또 다른 기질로 분비 될 수있는 다른 luciferases의 추가와 함께. 이 기술을 사용하여 게놈 전체의 RNAi 화면의 예는 다음 ⁶ 찾을 수 있습니다. 이러한 기술적 진보는 차례가 크로스 토크 ^7을 제한하기 위해 루시 페라 제 효소의 각 유형을 냉각하는 특정 메커니즘의 개발에 박차를 가했다. 우리 손에, 우리는 GL 또는 CL 등의 분비 luciferases와 "가장자리 효과"(높은 역가 문화 접시의 가장자리와 관련된 세포 활동의 설명 할 수없는 경향)의 큰 주파수를 확인합니다. 그들은 세포 생존을 adulterating없이 신호 샘플링을 가능으로, 다른 한편으로는, 이러한 분비 luciferases은 운동 분석에 유용합니다.

여기에 제시된 연구를 위해, 우리는 동시에 세 개의 암 관련의 활동을 모니터링 할세포 과정 : p53의, 크라스, 그리고 Wnt의 신호 전달 경로. ,, 우리의 연구에 통합 기자 Clontech 사에서 pp53-TA-뤽 FL 기자 (이제부터는 p53의-FL 기자라고도 함) ⁸ Elk1-GAL4/UAS-CL 기자 시스템 (애질런트 이제부터는 엘크-1 기자)입니다 와 T-세포 인자 (또는 TCFS) ^9-11로 알려진 Wnt의 경로 전사 규제에 의해 인식 여러 합성 증강 요소를 통합 8X TCF RL 기자.

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프로토콜

전체 프로토콜은 약 사일 소요됩니다.

1. siRNA를 및 기자 형질에 대한 세포의 준비

우리는 여기에서 설명을위한 게놈 전체의 siRNA 라이브러리에서 siRNAs에의 작은 집합 (하나의 유전자를 대상으로 배 siRNAs에 구성된 각 풀에 96도 형식으로 384 가지의 siRNA 풀 배열)을 사용하여 siRNA의 라이브러리를 심문하기위한 프로토콜을 소개합니다. 이 특정 연구를 위해, 우리는 HCT116 비정상적인 Wnt의와 크라스 신호를 전시 세포와 p53의 활동을 이용합니다. 관심의 다른 세포 프로세스를 심문을 목표로 연구에 적절한 셀 라인은 식별 유사한 방식으로 평가해야합니다.

1. 2 % 철을 함유 Dulbecco의 수정 이글 배지 (DMEM) 10 mL로 중화 한 다음 트립신 솔루션 / 판 1 ㎖를 사용하여 트립신에 의해 PBS 다음 수확 세포와 80 % ~ 90 % 합류 HCT116 세포 5 × 10cm ² 판을 씻어탈 소 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 판.
2. DMEM / 2 % FBS / 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 10 ㎖에 50 ML 원뿔 튜브에 정지 세포를 전송하고 5 분 ~ 130 XG에서 centrifugate, 상층 액을 제거하고 다시 중단 세포 펠렛.
3. 셀 카운터와 세포 수를 계산 한 다음, 10 ⁵ 세포 / ml의 세포 솔루션을 만들어 다음 단계를위한 150 ML의 세포 현탁액을 유지합니다. 멀티 드롭 자동화 된 액체 디스펜서 (이제부터는 멀티 드롭)를 사용하여 96도 세포 배양 플레이트의 각 우물 판 (10) ⁴ 셀 (100 μL). 세포 현탁액은 도금 12 × 96 웰 플레이트이 경우 충분합니다.
4. 5 % CO _2와 37 ° 인큐베이터에서 C에서 세포와 번호판을 품어의 transfection 혼합물을 준비하는 동안.

2. 기자 구문 재고 솔루션을 준비

1. 분리 고품질 기자는 표준 midiprep 키트 (NucleoBond 엑스트라 미디가 제작하여 사용하여 DNA를 구성그리고 Clontech 사)는 각 기자 1 MG / ML의 최종 농도로 DNA를 희석.
2. 기자는 p53의-FL 30 μL, 8X TCF-RL, Elk1-GAL4의 30 μL, 10 μL UAS-CL과 함께 DNA의 혼합을 달성하기 위해 H ₂ O 4 μL의 30 μL를 결합하여 주식 솔루션을 구축의 100 μl를 준비 기자의 최종 1:1:1:0.2 비율입니다. 이 DNA 혼합 원액의 최종 DNA 농도는 0.3 ㎎ / ML입니다.

3. siRNA를 / DNA 형질 믹스를 준비

프로토콜의이 부분에서, 우리는 12 × 96 잘 접시를 형질에 대한 충분합니다 siRNA의 / DNA 형질 믹스를 준비합니다. siRNAs는 4 X 96 웰 플레이트의이 테스트 라이브러리, 우리는 세중의 각 siRNA의 풀을 형질 것입니다. 우리가 사용하는 형질 시약 Effectene (Qiagen의)이라고합니다. 우리의 손이 배양 세포에의 siRNA 및 DNA의 동시 배달을 위해 작동하는 전용 시약이다.

1. 기자 구조 주식 졸의 80 μl를 희석3 μg / ML의 최종 농도로 DNA 솔루션을 달성하기 위해 EC 버퍼 (Effectene 키트)의 8 ML의 ution. 일반적으로, 즉시 사용을위한 충분한 DNA 솔루션 믹스를 준비합니다.
2. 96도 / 플레이트의 각 웰이 DNA 솔루션의 플레이트 (20) μL. 96 잘 플레이트의 수는 siRNA의 풀 테스트 할 얼마나 많은에 따라 달라집니다. 예를 들어,이 경우에 우리는 384 다른 siRNA의 풀을 평가하는 4 × 96 웰 플레이트가 필요합니다.
3. 테스트 할 siRNAs는 5 μM의 주식 농도에 있어야합니다. 하지 않으면, 그들은 복제가 도금 및 각 라이브러리와 연관된 권장 희석 버퍼를 사용하여이 농도로 희석 할 수 있습니다.
4. 잘 Biomek 자동 액체 처리기와 희석 DNA 주식을 포함하는 PCR 플레이트의 해당 각 5 μm의 siRNA의 주식의 2 μl를 전송합니다. 연구의 규모에 따라 멀티 채널 피펫은 충분합니다.
5. 이제, 우리는 DNA / siRNA의 PLA의 각 웰에 증강 용액 (Effectene 키트) 1 μl를 추가합니다테. 이것은 다시 자동 액체 핸들러 또는 멀티 채널 피펫으로도 수행 할 수 있습니다.
6. 각 well에 Effectene 형질 시약의 3 μl를 추가하고 추가로 10 분 동안 RT에서 품어 증강 반응이 5 분 RT에서 발생 할 수 있습니다.
7. 형질 복잡한 형성을 중지하려면, PCR 플레이트의 각 웰에 10 ㎕의 DMEM / 2 % FBS / 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 추가합니다.
8. 세포 (세포 배양기에서 검색)을 포함하는 96 잘 플레이트의 각 웰에 형질 믹스의 10 μl를 전송합니다. 각 형질은 세중의에서 수행되므로, 동일한 믹스 세포를 포함하는 두 개의 추가 96 잘 접시에 적용됩니다.
9. 36 시간 동안 5 % CO ₂ 가습 환경에서 37 ° C에 추가 형질 혼합물로 세포를 품어.

4. 세포 샘플에서 루시 페라 제 활동을 결정

36 시간 후, 루시퍼 활동 측정을위한 준비형질 세포합니다. 엔드 포인트 당 실험 방식에 의해 결정해야한다. 본 연구에서는 36 시간의 배양 시간 이전 결과 결정 의미를 충분히 강력한 신호를 굴복했다. 이 연구는 여러 기자 (세포 세포질에서 발현 배지, 두 사람으로 분비 한) 통합으로, 우리는 모두 배양 배지뿐만 아니라 세포 파쇄물에서 측정 값을 얻을 것이다.

1. 문화 매체 CL 활동의 탐지 :
   1. 배양액 20 μL은 복제 도금 흰색 불투명 96 웰 플레이트 (중 Biomek 액체 처리기 또는 멀티 채널 피펫을 사용)합니다.
   2. 각 well에 CL 분석 버퍼 20 μl를 (시스템 대상)를 추가합니다.
   3. 각 well에 Cypridina 루시페린 기판 (시스템 대상)의 10 μl를 추가하고 luminometer (예를 들어 BMG에 의해 생성 된 Pherastar 플레이트 리더)를 사용하여 CL 활동을 감지합니다.
2. FL 및 RL 활동 감지 :
   1. C를 용해먼저 문화 매체를 제거하여 ELL 학생. 이것은 거꾸로 판을 켜고 싱크 매체를 던지기에 의해 신속하게 수행 할 수 있습니다. 나머지 매체는 부드럽게 종이 타월에 거꾸로 판을 눌러 제거 할 수 있습니다. 플랫폼 로커에 멀티 드롭과 장소를 사용하여 세포의 각 웰에 1X 수동 용해 버퍼 (Promega 사)의 30 μl를 추가 RT에서 5 분 중간 속도를 설정합니다 (Bellco이가 만드는 한 회사입니다.)
   2. luminometer를 사용하여 멀티 드롭 즉시 측정 FL 활동을 사용 루시 페라 제 분석 시약 II (프로 메가 듀얼 루시 페라 키트의 일부)의 20 μl를 추가합니다. 다음으로, 추가 및 중지 FL 활동을 담금질하고 RL 활동의 측정을 허용합니다 저런 형광 시약 (Promega 사). 참고 : 확장 된 신호 지속 시간 (예 : 프로 메가에서 이중 글로 루시 페라 키트 등)을 허용 기판 믹스를 사용하지 않는 플래시 키트의 사용은 기판뿐만 아니라시 신속한 측정 (5 분 이내)이 필요합니다.

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결과

대규모 게놈 시퀀싱 노력 ^12-14를 사용하여 다양한 암의 돌연변이 풍경을 매핑의 발전에도 불구하고, 우리는 여전히 그 자리에 개입 전략에 이러한 관측을 번역하기위한 체계적인 접근 방법을 가지고 있지 않습니다. / Wnt는 β-catenin 신호, p53의, 그리고 크라스 신호 - - 대장 암 (CRC), 세 가지 세포 프로세스의 구성 요소에 영향을 미칠 것으로 예상되는 돌연변이들은 창자의 세포 변화의 주요 ?...

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토론

처음으로 높은 처리량 화면을 접대하는 데 유용에 대한 온라인 리소스를 제공 루시퍼 기반 기자 시스템의 여러 조달업자 (예 : Promega 사 등, 대상 시스템, 뉴 잉글랜드 Biolabs가, 그리고 써모 피셔)가 있습니다. 또한, 유전자 발견 방법 및 RNAi의 기반 검사 결과는 다른 - 오 믹스 기반 데이터 셋과 통합 될 수 높은 처리량 스크린의 사용을 최적화에 대한 훌륭한 리뷰의 숫자는 도움 ^{15,16해야합니다.<...}

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
PathDetect Elk1 Trans-Reporting System	Agilent Technologies Inc.	219005
Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector	Clontech Lab Inc.	631914
Effectene Transfection Reagent	Qiagen Inc.	301427
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega Corp.	E1960
Cypridina Luciferase Assay reagent	Targeting Systems	VLAR-1
HCT116 cells	ATCC	CCL-247
CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay	Promega Corp.	G9260
EQUIPMENT
MultiFlo Microplate Dispenser	Labsystems Inc.	Model 832
Biomek FXP Laboratory Automation Workstation	Beckman Coulter Inc.	A31842
PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader	BMG Labtech Inc.	0471-101A
Bright-Line Reichert Hemacytometers	Hausser Scientific Company	1490