מיקרוסקופית גומלת לניתוח מבני 3D של אינטראקציות דינמיות

Summary

אנו מתארים שיטת מיקרוסקופיה מצטרפת שמשלבת מיקרוסקופית במהירות גבוהה 3D לחיות תאי ניאון אור וטומוגרפיה קריו אלקטרונים ברזולוציה גבוהה. אנחנו מדגימים את יכולתה של השיטה הגומלת על ידי הדמיה דינמית, חלקיקי אינטראקציה עם תאי הלה מארחות הקטנים HIV-1.

Abstract

Cryo-אלקטרון טומוגרפיה (cryoET) מאפשרת הדמיה 3D של מבנים הסלולר ברזולוציה מולקולרית במצב קרוב לפיסיולוגי ^1. עם זאת, להדמיה ישירה של מתחמים נגיפיים בודדים בסביבה התאית שלהם עם מארח cryoET מאתגרת ^2, בשל האופי נדיר ודינמי של כניסת ויראלי, במיוחד במקרה של HIV-1. בעוד לחיות תאי הדמיה זמן לשגות הניבה מידע רב על היבטים רבים של המחזור של ^3-7 HIV-1 החיים, המוענקת על ידי מיקרוסקופיה ברזולוציה לחיות תאים הוא מוגבל (~ 200 ננומטר). העבודה שלנו הייתה במטרה לפתח שיטת מתאם המאפשרת הדמיה ישירה של אירועים המוקדמים של HIV-1 זיהום על ידי שילוב של מיקרוסקופ אור ניאון לחיות תאים, מיקרוסקופיה קריו פלורסנט, וcryoET. באופן זה, ניתן להשתמש באותות בתאים חיים וcryo-ניאון כדי להנחות את הדגימה בcryoET במדויק. יתר על כן, מידע מבני מתקבל מcryoET יכול בהדואר השלים עם הנתונים הפונקציונליים הדינמיים שנרכש דרך לחיות תאי הדמיה של היעד מסומן ניאון.

במאמר זה וידאו, אנו מספקים שיטות ופרוטוקולים מפורטות לחקירה מבנית של HIV-1 ואינטראקציות מארח תאים באמצעות הדמיה 3D גומלת במהירות גבוהה תאי חיים וניתוח מבני ברזולוציה גבוהה cryoET. תאים הלה נגועים בחלקיקי HIV-1 אופיינו לראשונה על ידי מיקרוסקופיה confocal לחיות תאים, ובאזור המכיל אותו החלקיק הנגיפי נותח ולאחר מכן על ידי טומוגרפיה קריו אלקטרון לפרטים מבניים 3D. המתאם בין שני סטים של נתוני הדמיה, דימות אופטי ואלקטרוני הדמיה, הושג באמצעות שלב מיקרוסקופ אור cryo-הקרינה בבנייה עצמית. הגישה המפורטת כאן תהיה בעל ערך, לא רק למחקר של אינטראקציות תא מארח, וירוס, אלא גם עבור יישומים רחבים יותר בביולוגיה של תא, כגון, סחר בקולט קרום תא איתות, ועוד רבים תהליכים תאיים דינמיים אחרים. </ P>

Introduction

Cryo-אלקטרון טומוגרפיה (cryoET) היא טכניקת הדמיה רב עוצמה המאפשרת הדמיה (3D) תלת ממדית של תאים ורקמות ומספקת תובנות לארגון של האברונים ילידים ומבנים הסלולר ברזולוציה מולקולרית למצב פיסיולוגי קרוב ^1. עם זאת, בניגוד מיסוד הנמוך של דגימה קפוא התייבשות בלא כתם, בשילוב עם הרגישות לקרינה שלהם, הופך אותו לקשה לאתר תחומי העניין בתוך תא, ולאחר מכן ביצוע סדרת ההטיה בהצלחה מבלי לפגוע באזור היעד. על מנת להתגבר על בעיות אלה, גישה מצטרפת שמשלבת מיקרוסקופ אור ואלקטרונים היא הכרחית. תכונות ספציפיות מודגשות על ידי ניאון תיוג מזוהים וממוקמות על ידי מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי, ולאחר מכן את הקואורדינטות שלהן מועברות למיקרוסקופ האלקטרונים לרכישת נתונים 3D מבניים ברזולוציה גבוהה. שיטה זו מסייעת גומלת איתור היעדreas של עניין לטפל. בשל הגבלה על עובי מדגם עם cryoEM (<300 ננומטר), כיום רק את אזורי הפריפריה של התא מתאימים לניתוח מבנים על ידי 3D CryoET. בהמשך הפחתת העובי של דגימות קפוא hydrated על ידי זגוגית חתך ⁸ או על ידי cryo-אלומת יונים ממוקד (FIB) טחינה ⁹ הייתי להרחיב את היכולת של הדמיה גומלת.

בעבר, שיטות גומלות היו בשימוש בעיקר כדי להקל על רכישת cryoET נתונים למבנים גדולים וסטטי ^10-13. במחקרים אלה, cryo-שלבים יושמו לקבל רשתות cryoEM ולהתאים אותו גם מיקרוסקופ זקוף או מיקרוסקופ הפוכה ^10,11,14. למרות מיתוג רשתות נראה פשוט למדי בעיצובים שלהם, יש העברה נוספת מעורבים לרשת EM צעדים, מגדיל את הסיכוי שהרשת עשויה להיות מעוות, פגומות ומזוהמת. לאחרונה הפגינו התקדמות טכנית במיקרוסקופיה המצטרפת שמאפשרת לנו לדמיין באופן ישיר אירועים דינמיים במהותם קשה לתפוס, כגון אינטראקציות תא מארחות HIV-1 ובשלבים מוקדמים של זיהום ^15. אנחנו עשינו זאת על ידי תכנון ויישום שלב מדגם מיקרוסקופיה קריו אור שמתאים את עצמו מערכת מחסנית כדי למזער את נזק הדגימה עקב טיפול רשת, ובכך להקל מתאם. העיצוב שלנו כולל בעל מחסנית דגימה משולב, המאפשר גם מיקרוסקופיה קריו האור ואלקטרוני cryo-להתבצע, ברצף, באותו בעל דגימה, ללא העברת דגימה, ובכך לייעל את תהליך ההיווצרות. בנוסף, אנחנו גם יישמנו הליך התאמה מדויקת ואמין באמצעות חרוזים לטקס ניאון כסמני fiducial.

Protocol

1. תרבות הלה סלולרי על פחמן מצופה, זהב רשתות Finder EM

1. הפרשות זוהרות פחמן בצד של R2-200 רשת / 2 Quantifoil זהב EM Finder רשת מתחת לגיל 25 אמפר עבור 25 שניות.
2. מעיל רשת EM עם פיברונקטין, על ידי אותו צף, פחמן בצד למטה, על רביב μl 40 מ"ל של תמיסת פיברונקטין 50 מיקרוגרם /, ואחר כך לחטא אותו תחת אור UV במשך שעה 2 במכסת מנוע בתרבית רקמה.
3. פלייט תאי הלה על גבי רשת בצפיפות של 2 x 10 ⁴ תאים / מ"ל (סה"כ תרבות מ"ל 2) בצלחת תרבות זכוכית תחתונה ולגדל את התאים על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO _2, DMEM בתוספת 4.5 G / L L-גלוטמין וגלוקוז, 10% חום מומת עוברי עגל בסרום, 100 יחידות / מיליליטר פניצילין, וסטרפטומיצין מיקרוגרם / מ"ל ​​100, לכ -18 שעות. תאים הלה נגועים אחרי תרבות O / N.

2. הידבקות ב-HIV-1 ו-Live-תא הדמיה

1. הוסף גשש תא ניאון (אדום CMTPX, μl / 2 1 מ"ל) לתוך תרבות זכוכית התחתונהצלחת (משלב 1.3) ו דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, כדי לאפשר את קח של צבע פלואורסצנטי.
2. לשטוף את התאים עם PBS ולהוסיף 50 בינונית טרי מחומם מראש μl.
3. מניחים את הצלחת על החדר לחיות התאים, על 37 מעלות צלזיוס, של מיקרוסקופ סורק Confocal Swept שדה. לבחור שדות מרובים (10-15 עמדות) המכילים תאים / רבוע 1-3, עם התאים בין שני שלבי מיטוזה כאשר הם רוב ההתפשטות החוצה ושטוח (ראה איורים 2 ג ו 2d), שכן cryoEM דורש אזורים קטנים יחסית של מדגם. אחסן את העמדות הללו להדמית עתיד (שלב 2.5).
4. להדביק את התאים עם חלקיקי VSV-G פסאודו הוקלד HIV-1 המכילים GFP-VPR (אנו משתמשים 40 μl של מדגם המכיל 40 ng / ml של p24). כאשר מוסיפים את חלקיקי הנגיף לתחתית הצלחת, יש להיזהר שלא להפריע לרשת א"מ, שכן העמדות להדמיה כבר נבחרו ומאוחסן.
5. מייד לאחר תוספת של virions, לאסוף TIשלי לשגות תמונות במהירות גבוהה 3D confocal, בעמדות שנבחרו קודם לכן (משלב 2.3) דקות 20-40.
6. תמונות confocal נרכשו באמצעות MetaMorph ונותחו על ידי מעקב אחר חלקיקי 3D אוטומטי לדינמיקת חלקיק יחידה באמצעות תוכנת Imaris (ראה איור 1). מכיוון שאנו נמצאים correlating ההתנהגות הדינמית של השתברות מוגבלת HIV-1 חלקיקים בעלי ultrastructure סלולרי, לחיות תאי הדמיה זמן לשגות ומעקב אחר חלקיקי 3D הם קריטיים לתוצאות. עם זאת, למבנה גדול וסטטית, תמונת הקרינה פשוט (בלי לחיות תאים) תהיה מספיק לניתוח גומל.

3. לדוגמא הכנת EM קפוא התייבשות

כדי למזער את השהות בין האוסף של תמונת confocal האחרונה וcryo-הקיבעון של המדגם, Vitrobot פיי (או מכשיר vitrification אחר) צריך להיות יזם ומוכן לצעד-הקפאה באוסף של תמונות לחיות תאי confocal הקרינה.

1. הפעל את התקן vitrification ולהגדיר טמפרטורת האקלים שלה ל -22 מעלות צלזיוס, לחות היעד ל -100%, בפעם סופג עד 7 שניות, ואת ההמתנה ולנקז עת לשנייה 1.
2. הנח את תיבת האחסון ברשת דיואר הבוכנה ולהכין אתאן נוזל קר. הר דיואר על גבי מכשיר vitrification.
3. מייד לאחר לחיות תאי ההדמיה confocal (סעיף 2), מניח את צלחת התרבות על בלוק קרח נחושת מקורר ולהעביר אותו לחדר הכנת מדגם cryoEM. טען את רשת EM על גבי פינצטה מיוחדת ולמחוק במהירות את כל סוגי המדיה ברשת. סופג מתבצע באופן ידני, עם נייר סינון, שלאחריו 4 μl של פתרון חרוז זהב 15 ננומטר מעורבב עם 0.2 מיקרומטר microspheres ניאון ממוקמת מייד ברשת. את חרוזי הזהב משמשים כסמני fiducial לסייע אוסף טומוגרפית נתונים ויישור. Microspheres הניאון משמשות סיוע מתאם בין תמונות ניאון וcryoEM (ראה איורים 2 ג-2F).
4. טען את פינצטה על מכשיר vitrification ולהורות למכשיר למחוק ולצלול בהקפאת אתאן הנוזלי ^16. הפרמטרים הסופגים המותאמים להשגת התוצאה הטובה ביותר הם: זמן כתם, 7 שניות; כתם אופסט, 0; זמן ניקוז, 1 שניות; טמפרטורה, 22 מעלות צלזיוס, ולחות, 100%.
5. העבר את הרשת קפוא התייבשות לבעל cryoEM הדמיה cryoET מיידית, או לאחסון חנקן נוזלי דיואר לשימוש מאוחר יותר.

4. מיקרוסקופ אור Cryo-הקרינה

מערכת קאמרית בית בנוי, cryo-הקרינה מדגם ובמה (איור 3) נדרשה לבצע צעדים 4.1-4.10. התוכניות המפורטות והתיאור של השלב ניתן למצוא ביוני et al. ^-15.

1. מלא חנקן נוזלי דיואר עצמי דחוס עם חנקן נוזלי לפחות 2 שעות לפני תחילת מיקרוסקופ אור cryo-הקרינה (ראה איור 3 א).
2. הר cryo-F homebuiltשלב luorescence מדגם ¹⁵ (איור 3) על גבי מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי הפוכה, כגון אולימפוס IX 71.
3. חבר את כניסת החנקן הנוזלית של שלב cryo-המדגם לדיואר עצמי הדחוס ולמקם את שקע הגנת הצפת החנקן הנוזלי לתוך המכל מתאים. חבר קו גז חנקן יבש לשרוול ממוקם מעל עדשת המטרה לשמור על העדשה חמה וחופשי של כפור.
4. הנח פלטפורמת גוש נחושת (חץ שחור באיור 3) לתוך תא cryo-השלב לטעינת רשת המדגם קפוא התייבשות. להתקרר ולמלא את התא של נחושת cryo-הבמה עם חנקן נוזלי דרך קו היניקה מדיואר המילוי עצמי בלחץ.
5. כאשר cryo-השלב מגיע לטמפרטורת חנקן נוזלית (ב~ 4-6 דקות), להעביר את קופסא אחסון הרשת (משלב 3.5) לcryo-הבמה.
6. הנח את רשת המדגם קפוא התייבשות לתוך מחסנית דגימת EM ברחוב הנחושת וקליפ גרםלהיפטר במקום באמצעות C-טבעת (אם שימוש במחסנית מיקרוסקופ Polara), או למקם את טבעת נחושת מראש מקוררת על גבי (ראש החץ שחור באיור 3D), כדי לשמור את הרשת במקום וגם לאחזור קל של הרשת לאחר הדמיה cryo-הקרינה (אם למיקרוסקופ אלקטרונים cryo-הלא Polara).
7. הנח את המחסנית (משלב 4.6) בחדר הפנימי של cryo-השלב (לבן ראש החץ באיור 3).
8. לחפש ולמצוא את אותם חלקיקי וירוס מנתוני ההדמיה לחיות התאים. מאז רשת EM יש אינדקס, זה פשוט למקם אותו החלקיק על הרשת בשתי תמונות לחיות תאים ותמונות cryo-תפרחת.
9. לרכוש תמונות GFP cryo-DIC ובעמדות המזוהות תחת cryo-תנאי השימוש במיקרוסקופ אור עם עדשת מטרת עבודה ארוכה (2.7-4 מ"מ). במהלך ההדמיה cryo-הקרינה, מעת לעת לבדוק את רמת החנקן הנוזלית בcryo-הבמה ולמלא אותו, לפי צורך, כדי לשמור על הבמה המדגם מתחת -170° C.
10. עם השלמת ההדמיה cryo-הקרינה, יחזור בזהירות את מחסנית הדגימה לפלטפורמת בלוק הנחושת ולאחסן את המחסנית בחנקן נוזלי דיואר לניתוח cryoET עתיד עם מערכת Polara. אם באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים cryo-הלא Polara, להסיר את טבעת הנחושת, לאחזר את רשת המדגם, למקם אותו בתיבת אחסון רשת, ולאחסן את הדגימה בחנקן נוזלי עד דיואר הדגימה נבדקה על ידי cryoET.
11. לניתוח נתונים, חופף את תמונות cryo-DIC וGFP הנרכשים (מצעד 4.9, ראה איור 4) ולתאם את עמדותיהם של אותות ה-GFP בתמונת cryo-הקרינה עם אלה שהושגו בסדרה לחיות תאי ההדמיה.

5. Cryo-טומוגרפיה

1. טען את מחסנית המדגם לתחנת cryo-העברת מיקרוסקופ אלקטרונים מצוידים באקדח פליטת שדה, כגון מיקרוסקופ G2 Polara.
2. מצב במינון נמוך, חיפוש בהגדלה של 140X, IDEntify ולשמור את ריבועי הרשת הכלולות שלה (מצעד 4.11) לקובץ במה.
3. תחת מצב במינון נמוך, חיפוש בהגדלה של 3500 X, להוסיף 100 מיקרומטר אובייקטיבי צמצם, חיפוש ולשמור את כל העמדות המתואמות עם אותות GFP לתוך קובץ שלב שני.
4. תחת מצב במינון נמוכה, חשיפה, מוצא את אזור ריק כדי להתאים את עוצמת קרן למינון של דואר 1 או 2 ^- / a ² ולחדד את ציר ההטיה, באמצעות פונקצית y הבמה, על ידי שריפה משם הקרח באזור פחם לא חשוב עם כמה חרוזי זהב.
5. תחת מצב במינון נמוך, פוקוס, להתאים את מרחק המוקד ל~ 3 מיקרומטר ולהתאים את הזווית כדי ליישר את הכיוון של התמקדות להיות מקביל לציר ההטיה.
6. תחת מצב במינון נמוך, חיפוש, זוכרים עמדות נשמרו (משלב 5.3), להתאים את גובה eucentric דגימה ולבדוק את טווח ההטיה לאזור של עניין. לרכוש תמונת הקרנה עם אלקטרונים במינון נמוך מאוד (1 ~ דואר ^- / a ²⁾ בשעה 8 עד 10 מיקרומטר defocus, בexposמצב יור, כדי לאשר את חלקיקי נגיף בקורלציה לטומוגרפיה קריו אלקטרון.
7. לעבור למצב במינון נמוך, פוקוס. בתפריט פונקציות אוטומטי TEM, להקדים את גובה eucentric האוטומטי ולהתמקד בפונקציות את אזור המיקוד.
8. להגדיר את הפרמטרים לרכישה להטות-Series. לאיור 4 במאמר זה, זוויות הטיה החל ± 70 מעלות, מתחת ומעל 45 מעלות, בגיל 3 ו -2 ° ° מרווחי הטיה, בהתאמה, היו בשימוש, עם 6 מיקרומטר defocus וכ 70 דואר ^- מינון כולל של ² /.
9. חזור על שלבים 5.7 ו -5.8 לכל העמדות שנשמרו. תוכנת טומוגרפיה אצווה יכולה לשמש לאיסוף נתונים אוטומטי במספר עמדות כדי להגדיל את התפוקה.

6. שחזור תלת ממדי באמצעות IMOD ¹⁷

1. בדוק את הסדרה להטות הגולמית כדי להתאים את ערכי צפיפות המינימום ומקסימום ולקבוע אם יש כל תצוגה שלא להיכלל בשל שינוי תמונה גדול.
2. התחל eTomo ופנל tomogram התקנת שימוש בסוג ציר, גודל פיקסל, קוטר fiducial, וכו '. לאחר מכן ליצור תסריטי com.
3. הגדר את החלון הראשי כך שיכולים להיות מותאמים בכמה שלבים של חישוב tomogram / אחריו בו זמנית. שנה את הפרמטרים הדרושים ולבצע את התוכניות הספציפיות הנדרשות על ידי כל צעד בתהליך (ראה שיעור eTomo, http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html).
4. בשלב הסופי, ליצור ערימה מיושרת מלאה (עם שגיאת שיורי ממוצע פחות מ 0.6) ולשחזר tomograms באמצעות אלגוריתם בחזרה הקרנה משוקלל בIMOD.
5. Denoise אזורים פוטנציאליים של עניין באמצעות תכנית 3D קוי אניסוטרופי דיפוזיה קצה שיפור מיושמת בIMOD עם פרמטרים מתאימים כדי לשפר את החדות והבהירות.

תוצאות

כדי לאפיין את ההתנהגות הדינמית של חלקיקי הנגיף, תאי הלה עם HIV-1 היו צילמו על ידי מיקרוסקופ לחיות תאי confocal במהירות גבוהה ותנועות החלקיקים נותחו על ידי מעקב אחר חלקיקי 3D אוטומטי (איור 1). כדי להימנע מהפער הזמנים של כמה דקות שיכולים להתרחש בין אוסף של התמונה לחיות ...

Discussion

יש לנו הצגנו סדרה פשוטה של ​​פרוטוקולים כדי לספק גישה גומלת מתקדמת כדי לנתח את האירועים הסלולר דינמיים באמצעות זמן לשגות הדמיה confocal, לחיות תאי הקרינה ואחרי cryoET. ההתפתחות המתודולוגית שלנו כדי לתאם לחיות תאי ההדמיה 3D עם cryoET ברזולוציה גבוהה היא קריטית כדי לחקור בעיות ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine	Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA	12-604F
Fibronectin	Sigma, St. Louis, MO	F1141-1MG	HeLa cell culture on EM grids
Cell tracker	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	C34552	Red CMTPX
Protein A gold conjugates	Ted Pella, Inc., Redding, CA	15822-1	15 nm diameter
0.2 μm fluorescent microspheres	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	F8811	Yellow-green fluorescent
Heat-inactivated fetal calf bovine serum	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	10082-139
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	15140-122
Glass-bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Gold quantifoil finder EM grids	Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany	R2/2 Au NH2 200 mesh
PBS	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	70011-044
Equipment
Glow-discharge device 100X	EMS, Hatfield, PA
Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun	FEI, Hillsboro, OR		300 keV
Vitrobot Mark III	FEI, Hillsboro, OR
Olympus IX 71 microscope	Olympus America Inc., Center Valley, PA		LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens
Nikon TiE microscope	Nikon Instruments, Melville, NY		using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens
Sweptfield confocal microscope	Prairie Technologies, Middleton, WI
Tokai Hit live cell chamber	Tokyo, Japan
Cryo-fluorescence sample stage	Home-made		Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design.