Microscopie corrélative pour l'analyse structurale 3D des interactions dynamiques

Résumé

Nous décrivons une méthode de microscopie corrélative qui combine la microscopie à haute vitesse 3D de cellules vivantes fluorescent lumière et de haute résolution tomographie cryo-électronique. Nous démontrons la capacité de la méthode corrélative par imagerie dynamique, les petites VIH-1 particules en interaction avec des cellules HeLa d'accueil.

Résumé

Tomographie cryo-électronique (cryoET) permet la visualisation 3D des structures cellulaires à la résolution moléculaire dans un état ​​proche de l'physiologique ^1. Toutefois, la visualisation directe des complexes viraux individuels dans leur environnement cellulaire hôte avec cryoET est difficile ^2, en raison de la nature peu fréquente et dynamique de l'entrée virale, en particulier dans le cas de HIV-1. Tandis que l'imagerie des cellules vivantes time-lapse a donné beaucoup d'informations sur de nombreux aspects du cycle de vie du VIH-1 ^3-7, la résolution offerte par microscopie de cellules vivantes est limitée (~ 200 nm). Notre travail visait à développer une méthode de corrélation qui permet la visualisation directe des événements précoces de l'infection au VIH-1 en combinant microscopie fluorescente des cellules vivantes, la cryo-microscopie fluorescente, et cryoET. De cette manière, les signaux des cellules vivantes et cryo-fluorescent peuvent être utilisés pour guider avec précision l'échantillonnage en cryoET. En outre, des informations structurales obtenues cryoET peut be complétée avec les données fonctionnelles dynamiques acquises par imagerie des cellules vivantes de fluorescent cible marquée.

Dans cet article, vidéo, nous fournissons des méthodes et des protocoles détaillés de l'enquête structurelle du VIH-1 et interactions de la cellule hôte en utilisant l'imagerie des cellules vivantes 3D corrélative à grande vitesse et haute résolution cryoET analyse structurelle. Des cellules HeLa infectées avec des particules de VIH-1 ont été caractérisés d'abord par microscopie confocale de cellules vivantes, et la région contenant la même particule virale ont ensuite été analysées par tomographie cryo-électronique pour plus de détails structuraux 3D. La corrélation entre les deux ensembles de données d'imagerie, l'imagerie optique et l'imagerie électronique, a été réalisé en utilisant une étape de microscopie optique de fluorescence cryo-maison-bâti. L'approche décrite ici sera utile, non seulement pour l'étude des interactions virus-cellule hôte, mais aussi pour des applications plus larges de la biologie cellulaire, tels que la signalisation cellulaire, le trafic de récepteur membranaire, et de nombreux autres processus cellulaires dynamiques. </ P>

Introduction

Tomographie cryo-électronique (cryoET) est une puissante technique d'imagerie qui permet la visualisation en trois dimensions (3D) de cellules et de tissus et fournit un aperçu de l'organisation des organites indigènes et les structures cellulaires à la résolution moléculaire dans un proche de l'état physiologique ^1. Cependant, la nature, faible contraste de unstained spécimen congelé hydraté, combinée avec leur sensibilité aux rayonnements, il est difficile de localiser les zones d'intérêt à l'intérieur d'une cellule et effectuer ensuite la série inclinaison succès sans endommager la zone cible. Afin de surmonter ces problèmes, une approche corrélative qui combine la microscopie optique et électronique est nécessaire. Les caractéristiques spécifiques mis en évidence par un marquage fluorescent sont identifiés et localisés par microscopie optique à fluorescence, puis leurs coordonnées sont transférés à la microscopie électronique pour l'acquisition de la résolution des données structurelles élevées 3D. Cette méthode permet de localiser corrélative la cible d'unereas d'intérêt à traiter. En raison de la limitation de l'épaisseur de l'échantillon avec cryoEM (<300 nm), actuellement seules les régions périphériques de la cellule sont appropriés pour l'analyse structurale 3D par CryoET. Réduire encore l'épaisseur des échantillons congelés-hydratés par vitré coupe ⁸ ou par cryo-faisceau d'ions focalisé (FIB) fraisage ⁹ augmenterait la capacité de l'imagerie corrélative.

Auparavant, les méthodes corrélatives ont été principalement utilisés pour faciliter l'acquisition des données cryoET pour les grandes structures et statique ^10-13. Dans ces études, cryo-étapes ont été mises en place pour accepter les grilles de cryoEM et monter soit sur ​​un microscope droit ou d'un microscope inversé ^10,11,14. Bien que des grilles de commutation semble assez simple dans leurs conceptions, il existe d'autres étapes pour transférer la grille EM, qui augmente les chances que la grille peut être déformé, endommagé et contaminé. Nous avons récemment démontré un progrès technique dansmicroscopie corrélative qui nous permet de visualiser directement des événements dynamiques qui sont par nature difficiles à saisir, comme le VIH-1 et interactions de la cellule hôte à des stades précoces de l'infection ^15. Nous y sommes parvenus en concevant et réalisant une étape d'échantillonnage cryo-microscopie lumière qui adapte un système de cartouches pour minimiser les dégâts de l'échantillon due à la manipulation de la grille, facilitant ainsi la corrélation. Notre conception comprend un support de la cartouche d'échantillon intégré, permettant à la fois la cryo-microscopie lumineuse et cryo-électronique à effectuer, de manière séquentielle, sur le même porte-échantillon, sans transfert de l'échantillon, rationalisant ainsi le processus corrélatif. En outre, nous avons également mis en place une procédure d'établir une corrélation précise et fiable en utilisant des billes de latex fluorescentes comme marqueurs fiduciaires.

Protocole

1. HeLa culture cellulaire sur le carbone, plaquée or EM Finder Grids

1. La décharge luminescente du côté de carbone d'un R2 de 200 mesh / 2 Quantifoil or EM finder grille de moins de 25 mA pendant 25 sec.
2. Manteau de la grille EM avec de la fibronectine, par celle-ci, du côté de carbone flottant vers le bas, sur une gouttelette 40 ul de 50 pg / solution de fibronectine ml, puis désinfecter sous lumière UV pendant 2 h dans une hotte de culture de tissus.
3. Cellules plaque HeLa sur la grille à une densité de 2 x 10 ⁴ cellules / ml (culture totale de 2 ml) dans une boîte de culture à fond de verre et de croître les cellules à 37 ° C, avec 5% de CO _2, dans du DMEM supplémenté avec 4,5 g / L-glutamine et du glucose, 10% de sérum inactivé par la chaleur de veau foetal, 100 unités / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine pendant environ 18 heures. Des cellules HeLa sont infectées après O / N culture.

2. Infection VIH-1 et des cellules vivantes Imaging

1. Ajouter un tracker de cellules fluorescentes (Red CMTPX, 1 pl / 2 ml) à la culture à fond de verreAntenne (de l'étape 1.3) et incuber le plat à 37 ° C pendant 10 minutes, pour permettre la mise prennent du colorant fluorescent.
2. Laver les cellules avec du PBS et ajouter 50 ul du milieu frais préchauffé.
3. Placer la capsule sur la chambre de cellule vivante, à 37 ° C, d'un champ balayé microscope confocal du scanner. Sélectionner plusieurs champs (10-15 positions) qui contiennent 1-3 cellules / carrés, avec des cellules entre deux phases de la mitose quand ils sont plus étalée et plat (voir les figures 2c et 2d), depuis cryoEM exige régions relativement minces de l' échantillon. Conservez ces positions pour l'imagerie avenir (étape 2.5).
4. Infecter les cellules avec VSV-G particules pseudo-typés VIH-1 qui contiennent GFP-Vpr (nous utilisons 40 pl d'un échantillon contenant 40 ng / ml de p24). Lors de l'ajout des particules virales dans le fond du plat, faire attention de ne pas perturber le réseau EM, depuis les positions de l'imagerie ont déjà été sélectionnés et stockés.
5. Immédiatement après l'ajout de virions, recueillir timoi-lapse images confocale 3D à grande vitesse, aux positions précédemment sélectionnés (à partir de l'étape 2.3) pour 20-40 min.
6. Les images confocales ont été acquises à l'aide MetaMorph et analysées par suivi de particules en 3D automatisé pour la dynamique des particules simples en utilisant un logiciel Imaris (voir la figure 1). Puisque nous sommes corréler le comportement dynamique de diffraction limitée VIH-1 particules avec ultrastructure cellulaire, imagerie des cellules vivantes time-lapse et le suivi de particules en 3D sont essentiels pour les résultats. Cependant, pour une grande structure statique, une image de fluorescence simples (sans cellules vivantes) serait suffisante pour l'analyse corrélative.

3. Frozen-hydraté EM Préparation des échantillons

Pour réduire au minimum le délai entre le prélèvement de la dernière image confocale et cryo-fixation de l'échantillon, le FEI Vitrobot (ou autre dispositif de vitrification) doit être initié et préparé pour plonger de congélation lors de la collecte des images des cellules vivantes confocale de fluorescence.

1. Allumez le dispositif de vitrification et définir sa température climatique à 22 ° C, l'humidité de l'objectif de 100%, le temps buvard à 7 sec, et le temps d'attente et le temps s'écouler à 1 sec.
2. Placez la boîte de rangement de grille dans le plongeur Dewar et préparer l'éthane liquide froid. Monter le vase de Dewar sur le dispositif de vitrification.
3. Immédiatement après imagerie des cellules vivantes confocal (section 2), placez la boîte de culture sur un bloc de cuivre refroidi à la glace et de la transférer à la salle de préparation des échantillons cryoEM. Chargez la grille EM sur les pinces spécialisées et rapidement effacer loin des médias sur la grille. Le buvard est fait manuellement, avec un papier filtre, puis 4 pi de solution de perle d'or de 15 nm mélangé avec 0,2 um microsphères fluorescentes est immédiatement placé sur la grille. Les perles d'or sont utilisés comme marqueurs de référence pour faciliter la collecte des données de tomographie et d'alignement. Les microsphères fluorescentes sont utilisées pour faciliter la corrélation entre les images fluorescentes et cryoEM (voir les figures 2c-2F).
4. Chargez les pinces sur le dispositif de vitrification et de charger le dispositif d'effacer et de plonger gel dans l'éthane liquide ^16. Les paramètres buvards optimisés pour obtenir le meilleur résultat sont les suivants: temps de transfert, 7 sec; blot offset, 0; temps de vidange, 1 sec, la température, 22 ° C et humidité de 100%.
5. Transférer la grille congelés hydraté à un titulaire cryoEM pour l'imagerie cryoET immédiat, ou à un stockage d'azote liquide Dewar pour une utilisation ultérieure.

4. Cryo-microscopie de fluorescence lumière

Un système de fabrication artisanale, la chambre de l'échantillon cryo-fluorescence et le stade (figure 3) est nécessaire pour réaliser les étapes 04.01 au 04.10. Les spécifications détaillées et la description de la scène se trouvent à Jun et al. ^15.

1. Remplissez un azote liquide auto-pressurisé Dewar d'azote liquide au moins 2 heures avant de commencer la microscopie cryo-lumière de fluorescence (voir Figure 3a).
2. Monter une fabrication artisanale cryo-fétage d'échantillon luorescence ¹⁵ (figure 3) sur un microscope optique inversé à fluorescence, tel qu'un Olympus IX 71.
3. Relier l'entrée de l'azote liquide de l'étage cryogénique d'échantillon du vase de Dewar auto-pressurisé et placer la sortie de trop-plein d'azote liquide dans un récipient approprié. Raccorder une conduite de gaz d'azote sec à une douille placée sur la lentille d'objectif afin de maintenir la lentille chaud et exempt de gel.
4. Placer une plate-forme de bloc de cuivre (flèche noire sur la figure 3b) dans la chambre de cryo-étape pour charger la grille d'échantillon congelé-hydraté. Refroidir et remplir la chambre de cuivre de la cryo-étape avec de l'azote liquide au travers de la conduite d'entrée de l'auto-pression de remplissage de Dewar.
5. Lorsque le cryo-étape atteigne la température de l'azote liquide (à ~ 4-6 min), transférer le récipient de stockage de grille (de l'étape 3.5) pour la cryo-étape.
6. Placer la grille d'échantillon congelé-hydraté dans la cartouche d'échantillon EM sur le bloc de cuivre et de couper le gdébarrasser en place en utilisant un C-anneau (si vous utilisez une cartouche de microscope Polara), ou placer un anneau de cuivre pré-refroidi en haut (flèche noire sur la figure 3d), pour maintenir le réseau en place et aussi pour faciliter la récupération de la grille après imagerie cryo-fluorescence (si un microscope cryo-électronique non Polara).
7. Placer la cartouche (de l'étape 4.6) dans la chambre intérieure de la cryo-étape (tête de flèche blanche sur la figure 3b).
8. Cherchez et trouvez les mêmes particules virales à partir des données d'imagerie des cellules vivantes. Depuis la grille EM a un indice, il est facile de localiser la même particule sur la grille dans les deux images des cellules vivantes et des images cryo-florescence.
9. Acquérir cryo-DIC et images GFP dans les postes identifiés sous cryo-état à l'aide d'un microscope optique avec un long travail (2.7-4 mm) d'objectif. Au cours de l'imagerie cryo-fluorescence, vérifier périodiquement le niveau d'azote liquide dans la cryo-stade et le remplir, au besoin, pour maintenir la phase d'échantillonnage ci-dessous -170° C.
10. A l'issue de l'imagerie cryo-fluorescence, retourner avec précaution la cartouche d'échantillon de la plate-forme de bloc de cuivre et de stocker la cartouche dans un vase de Dewar d'azote liquide pour l'analyse de cryoET futur d'un système Polara. Si vous utilisez un microscope cryo-électronique non Polara, retirer l'anneau de cuivre, de récupérer la grille d'échantillonnage, placez-le dans une boîte de rangement de grille, et stocker l'échantillon dans de l'azote liquide jusqu'à ce que le vase de Dewar échantillon est examiné par cryoET.
11. Pour l'analyse des données, chevaucher les cryo-DIC et GFP images acquises (de l'étape 4.9, voir la figure 4b) et de corréler les positions des signaux de GFP dans l'image cryo-fluorescence avec ceux obtenus dans la série imagerie des cellules vivantes.

5. Tomographie cryo-électronique

1. Charger la cartouche de prélèvement dans le poste de transfert de cryo-microscopie électronique équipé d'un canon à émission de champ, telles que Polara G2 microscope.
2. Mode sous faible dose recherche à un grossissement de 140X, identifier et enregistrer les cases de la grille associés (provenant de l'étape 4.11) dans un fichier de scène.
3. Dans le mode à faible dose recherche à un grossissement de 3500 X, insérez un 100 um objectif d'ouverture, de recherche et de sauvegarder toutes les positions en corrélation avec les signaux GFP dans un second fichier de scène.
4. En mode dose-exposition faible, trouver un espace vide pour ajuster l'intensité du faisceau à une dose de 1 ou 2 e ^- / A ² et affiner l'axe de basculement, en utilisant la fonction y en scène, en brûlant la glace dans une région de carbone sans importance avec plusieurs perles d'or.
5. Dans le mode à faible dose au point, régler la distance de mise au point ~ 3 um et ajuster l'angle d'aligner la direction de se concentrer pour être parallèle à l'axe de basculement.
6. Dans le mode à faible dose recherche, rappelons positions enregistrées (de l'étape 5.3), ajuster la hauteur de eucentrique des échantillons et vérifier la plage d'inclinaison de la zone d'intérêt. Acquérir une image de projection avec une dose d'électrons très faible (~ 1 e ^- / a ²⁾ à 8 à 10 um défocalisation, en expositionMode ure, afin de confirmer les particules virales corrélées pour la tomographie cryo-électronique.
7. Passez en mode faible dose-focus. En TEM menu des fonctions auto, faites précéder la hauteur eucentrique automatisé et des fonctions se concentrer sur la zone de mise au point.
8. Définissez les paramètres pour l'acquisition d'une inclinaison de la série. Pour la figure 4 dans le présent document, les angles d'inclinaison allant ± 70 °, en dessous et au-dessus de 45 °, au 3 ° et 2 ° par incréments d'inclinaison, respectivement, ont été utilisés, avec un 6 um défocalisation et environ 70 e ^- / A ² dose totale.
9. Répétez les étapes 5.7 et 5.8 pour toutes les positions enregistrées. Logiciel Batch tomographie peut être utilisé pour la collecte automatisée de données à de multiples positions pour augmenter le débit.

6. Reconstruction en trois dimensions à l'aide IMOD ¹⁷

1. Contrôler la série d'inclinaison brut pour ajuster les valeurs minimale et maximale et la densité de déterminer s'il existe une vue d'être exclus à cause de grand décalage de l'image.
2. Commencez eTomo et le panneau de configuration à l'aide de tomographie type d'axe, la taille du pixel, diamètre de repère, etc. Ensuite, créer des scripts de com.
3. Configurez la fenêtre principale de telle sorte que plusieurs étapes du calcul de tomographie peuvent être ajustés / suivis simultanément. Modifiez les paramètres nécessaires et exécuter les programmes spécifiques qui sont requis par chaque étape de traitement (voir eTomo tutoriel, http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ).
4. Lors de la dernière étape, créer une pile complète alignée (avec une erreur résiduelle moyenne inférieure à 0,6) et de reconstruire tomographies en utilisant un algorithme de rétro-projection pondérée dans IMOD.
5. Denoise domaines d'intérêts potentiels en utilisant un programme d'amélioration de la diffusion anisotrope non linéaire 3D de pointe mises en œuvre dans IMOD avec les paramètres appropriés pour améliorer le contraste et la clarté.

Résultats

Pour caractériser le comportement dynamique des particules virales, des cellules HeLa infectées par le VIH-1 ont été imagées par microscopie confocale de cellules vivantes à grande vitesse et les mouvements de particules ont été analysés par suivi de particules en 3D automatisé (Figure 1). Pour éviter le laps de temps de plusieurs minutes qui peuvent survenir entre la collecte de la dernière image confocale des cellules vivantes et plongez-gel (qui peut être assez long pour perdre corrélé...

Discussion

Nous avons présenté un ensemble simple de protocoles pour fournir une approche corrélative de pointe pour analyser les événements cellulaires dynamiques en utilisant time-lapse imagerie confocale de fluorescence, des cellules vivantes suivie par cryoET. Notre développement méthodologique de corréler imagerie des cellules vivantes 3D à haute résolution cryoET est essentiel d'étudier de nombreux problèmes biologiques complexes, telles que la visualisation rares dynamiques et diffraction des particules vira...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine	Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA	12-604F
Fibronectin	Sigma, St. Louis, MO	F1141-1MG	HeLa cell culture on EM grids
Cell tracker	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	C34552	Red CMTPX
Protein A gold conjugates	Ted Pella, Inc., Redding, CA	15822-1	15 nm diameter
0.2 μm fluorescent microspheres	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	F8811	Yellow-green fluorescent
Heat-inactivated fetal calf bovine serum	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	10082-139
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	15140-122
Glass-bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Gold quantifoil finder EM grids	Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany	R2/2 Au NH2 200 mesh
PBS	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	70011-044
Equipment
Glow-discharge device 100X	EMS, Hatfield, PA
Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun	FEI, Hillsboro, OR		300 keV
Vitrobot Mark III	FEI, Hillsboro, OR
Olympus IX 71 microscope	Olympus America Inc., Center Valley, PA		LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens
Nikon TiE microscope	Nikon Instruments, Melville, NY		using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens
Sweptfield confocal microscope	Prairie Technologies, Middleton, WI
Tokai Hit live cell chamber	Tokyo, Japan
Cryo-fluorescence sample stage	Home-made		Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design.