הכנת תאי לבלב acinar לצורך סידן ההדמיה, פגיעה בתא המדידות, וזיהום adenoviral

Summary

אנו מתארים שיטת הכנה לשחזור של תאי לבלב acinar עכבר מעכבר לצורך בחינת אותות סיד סלולריים acinar ופציעה סלולרית עם גירויים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ופתולוגית. שיטה לזיהום adenoviral של תאים אלה היא גם סיפק.

Abstract

תא acinar הלבלב הוא תא parenchymal העיקרי של הלבלב אקסוקרינית וממלא תפקיד עיקרי בהפרשת אנזימי לבלב לתוך צינור הלבלב. זהו גם האתר לייזום של דלקת בלבלב. כאן אנו מתארים כיצד תאי acinar מבודדים מכל רקמת לבלב ואותות סידן תוך נמדדים. בנוסף, אנו מתארים את הטכניקות של transfecting תאים אלה עם מבני adenoviral, ולאחר מכן מדידת הדליפה של חומצת החלב דהידרוגנז, סמן של פגיעה בתא, בתנאים אשר יגרום לפגיעה בתא acinar במבחנה. טכניקות אלה מספקים כלי רב עוצמה כדי לאפיין acinar תא הפיסיולוגיה והפתולוגיה.

Introduction

שינויים דינמיים בסיד cytosolic נחוצים לאירועים סלולריים acinar הן פיסיולוגיים ופתולוגיים. תופעות אלה מסתעפות של סידן נחשבות לנבוע מדפוסי מרחב ובזמן שונים של סידן איתות ^1. לדוגמה, אנזים והפרשת נוזלים מתא acinar צמוד לקוצי סידן מאזור מוגבל של מוט הפסגה שבו ההפרשה מתרחשת ^2. לעומת זאת, גל סידן גלובלי ואחרי אותות סידן שאינה oscillatory האינטנסיביים קשור לאירועים פתולוגיים מוקדמים שמובילים לדלקת לבלב חריפה ^3,4. אלה כוללים הפעלת התוך acinar פרוטאז, הפרשת אנזים מופחתת, ופגיעה בתא acinar. המעבדה שלנו משתמשת מבודד לבלב acini ללמוד האירועים האלה תחילת פתולוגיים שיובילו למחלה גם in vivo ו במבחנה ^5-7. השיטות, כמפורט כאן לתאר בידוד של תאי acinar העיקריים לצורך מדידת CYרמות הסידן tosolic ופגיעה בתא. שיטה לזיהום adenoviral של תאים אלה היא גם סיפק.

Protocol

1. הכנת תאי לבלב acinar לסידן הדמיה

1. הכן את חיץ הדגירה HEPES המכיל 20 HEPES המ"מ, 95 מ"מ NaCl, 4.7 מ"מ KCl, 0.6 מ"מ MgCl _2, 1.3 מ"מ CaCl _2, גלוקוז 10 מ"מ, גלוטמין 2 מ"מ, ו1 × חומצות אמינו לא החיוניות בינוני מינימום של הנשר. התאם את הפתרון הסופי ל-pH 7.4 עם NaOH.
2. הכן את חיץ דגירה BSA על ידי הוספת BSA (1% w / v סופי) עד 25 מ"ל של חיץ הדגירה HEPES (כמתואר לעיל).
3. הכן את חיץ עיכול collagenase על ידי הוספת 1.1 מ"ג / מ"ל ​​(200 יחידות / מ"ל) מסוג 4 collagenase ו1 מ"ג / מיליליטר מעכבי טריפסין סויה עד 6 מ"ל של חיץ הדגירה BSA (שתואר לעיל).
4. coverslips מ"מ 22x22 חומצה לשטוף ידי טבילה בשני חלקי HNO ₃ וחלק HCl אחד במשך שעה 2. ואז למזוג מים ובאמצעות חנות DI ב70% אתנול.
5. להרדים את העכבר אחד בחנק CO _2. אוריינט בעלי החיים במצב שכיבה, ולהכין את שטח הבטן על ידי CLEaning עם 70% אתנול. בצע laparotomy לחשוף את חלל הבטן. לנתח את הלבלב ולשטוף באופן מיידי בסירה קטנה המכילה 6 שוקלים מ"ל של חיץ עיכול collagenase.
6. שם לנתח את כל חתיכות גדולות של כלי דם או שומן נראים לעין, ולאחר מכן להסיר 5 מ"ל של חיץ עיכול collagenase ולהוסיף אותו בחזרה לצינור חרוטי 15 מ"ל.
7. שימוש במספריים לנתיחה משובח טחון הלבלב בסירה הקטנה במשקל המכילה 1 מ"ל של חיץ עיכול collagenase. בשר טחון עד לפתרון שהתקבל מופיע מפוזר באופן שווה.
8. העבר את המוצר הטחון בבקבוק פלסטיק Erlenmeyer מ"ל 125, ולהוסיף 5 מ"ל הנותר של חיץ עיכול collagenase למכל. ודא הרקמה היא שקועה באופן מלא במאגר.
9. מניחים את הבקבוק באמבט מים 37 מעלות צלזיוס ולנער ב 90 סל"ד למשך 30 דקות. במהלך תקופה קצרה זו של השבתה, להכין אגוניסטים הפעלת סידן (למשל caerulein, carbachol) ולשטוף את מכסה חומצת שטף מ"מ 22x22התלושים עם מים די. יבש, ולאחר מכן למקם על גבי משטח שטוח בשורה של סרט מעבדה.
10. לאחר 30 דקות לעכל הושלם, להעביר את ההשעיה חזרה לצינור חרוטי 15 מ"ל ולאפשר לתאים להתיישב. פיפטה בזהירות את חיץ עיכול collagenase ולהחליף עם 6 מ"ל של חיץ הדגירה BSA. בתוקף ללחוץ את הצינור ביד למשך 10 שניות על מנת לפזר את התאים לקבוצות קטנות יותר. מייד עם רועד, להסיר כל פסולת גדולה, צוף מהתקשורת בלתי המוסדרת.
11. אפשר התאים שנותרו כדי להתיישב, ולהחליף את התקשורת עם חיץ הדגירה BSA טרי.
12. חזור על שלב 1.11 פעמיים, עד שההשעיה מורכבת רק קבוצות קטנות שהן רק דק גלויות לעין בלתי מזוינת. התאים צריכים להיות דומים לאלו שמתוארים באיור 1 א (בשורה העליונה).
13. הסר את חיץ הדגירה BSA ולהחליף עם חיץ הדגירה HEPES.
14. להכין 750 מיקרומטר, מניות 100X של Fluo-04:00 ב10% DMSO.
15. לטעון את התאים בצינור חרוטי 15 מ"ל המכיל את ההשעיה התא וחיץ הדגירה HEPES ללא BSA. כדי לעשות זאת, להוסיף נפח מתאים (1:100 דילול) של פתרון המניות להשעית התא. לאחר מכן צלחת μl 500 של השעיה זו על כל coverslip מ"מ 22x22.
16. שמור coverslips בחושך בטמפרטורת חדר. קח Ca ^{2 +} המדידות הראשון 30 דקות לאחר טעינה. הצבע יוסר באופן אוטומטי מהמדיום על התחלת זלוף, שאמור להתרחש 30 דקות לאחר טעינת צבע.

2. מדידת הסידן בתאי לבלב acinar

1. יש לשטוף את כל זלוף הגדרה עם מים די ולמלא עם כמות מתאימה של חיץ או אגוניסט. ראש כל מזרק עם חיץ או אגוניסט כדי להבטיח זרימה תקינה. הצמד מזרקים לטבעת עומד כ 1-2 מטרים מעל הבמה מיקרוסקופ.
2. השתמש בפינצטה העדינה לתפוס בזהירות מההשעיה שלו קצה אחד coverslip המכילה תא. הטה את המכסהלהחליק 45 °, ולאפשר למאגר העודף לברוח. מקם את coverslip על גבי אטם הגומי עם התאים על גבי coverslip, ולהרכיב את החדר (איורים 2 א ו -2).
3. אבטח את תא זלוף לבמה ולהכניס את הצינור המכיל חיץ לכניסה הראשונה של החדר (איור 2 ג). הפעל את המזרק המכיל חיץ על ולאפשר לחיץ perfuse על כל פני השטח של coverslip. ברגע שהמאגר שהגיע בקצה השני של החדר, להוסיף קו ואקום ליניקת הוואקום. הכנס את כל צינורות אחרים (המכיל אגוניסט, מעכבים, וכו ') למקומו המתאים שלהם לאורך החדר.
4. דמיינו את התאים או באמצעות, או אובייקטיבי 200X 400X 1.4 מספרי צמצם וארגון לייזר כדי לרגש את צבע Fluo-04:00 באורך גל של 488 ננומטר (איור 1 א, למטה). כוח ההגדרות של לייזר צריכים להיות מותאמות באופן שהצינור המכפיל (PMT) אינו רווי באור הנפלט. בנוסף, מתח על פני PMT צריך להיות מותאם לגילוי אור מרבי.
5. אותות פליטה ארוכים לעבור של 515 ננומטר> נאספים במהירויות מסגרת של 2-5 שניות / מסגרת להמחשה של דפוסי oscillatory איטיים ו0.2-0.3 שניות פריימים / המאפשר הדמיה מהירה יותר, גלי סיד הגלובליים (איורים 3 ו -4).
6. לאחר ההדמיה הושלמה, סגור את המזרקים ולהסיר את כל צינורות. לפרק את התא וחזור על שלבי 2.2-2.4.
7. איסוף נתונים כערכים מספריים של עוצמת הקרינה לאורך זמן והעברה לתמונת J (חבילת תוכנה המסופקת כתוכנה החופשית על ידי המכון הלאומי לבריאות וניתן למצוא בhttp://rsb.info.nih.gov/ij/).
8. צפה בתמונות סלולריות בזמן אמת ולזהות אזורים של עניין (ROIs, כלומר הפסגה, basolateral, גרעיני, וכו ')
9. רוכש את עוצמות הקרינה לROIs אלה וRepresent כעוצמת הקרינה בעוצמה / תחילת המחקר הקרינה (כלומר F/F0).
10. ליצור העתקים על ידי התוויית F f / ₀ לעומת זמן. בנוסף להעתקים, תמונות נציג מסופקות בדרך כלל ומוצגות באמצעות pseudocolor.

3. הכנת תאי לבלב acinar למבחני פגיעה בתא

1. תקשורת חמה DMEM-F-12 (ללא פנול האדום) ל 37 ° C.
2. הוסף BSA (0.1% w / v סופי), וHCl (50 מיקרומטר סופי) לתקשורת את ה-F-12 DMEM.
3. Aliquot 50 מ"ל של DMEM לתוך צינור חרוטי.
4. הכן את חיץ collagenase על ידי הוספת 0.5 מ"ג / מ"ל ​​(12 U / מ"ל) של collagenase הסוג IV עד 10 מ"ל של תקשורת בתוספת DMEM-F-12.
5. להרדים את העכבר אחד בחנק CO _2. אוריינט בעלי החיים במצב שכיבה, ולהכין את שטח הבטן על ידי ניקוי עם 70% אתנול. בצע laparotomy לחשוף את חלל הבטן. לנתח את הלבלב ולשטוף באופן מיידי בסירה קטנה במשקל גontaining 6 מ"ל של חיץ collagenase.
6. לרכך את הרקמה באמצעות מספריים לנתיחה קנס עבור 3-5 דקות או עד לפתרון שהתקבל מופיע מפוזר באופן שווה.
7. העבר את הרקמה הטחון בבקבוק 125 מ"ל Erlenmeyer עם 5 מ"ל של חיץ collagenase נוסף, ולאחר מכן למקום 37 ° C אמבט מים עם הרועד בסל"ד 90 למשך 5 דקות.
8. מרשימת שייקר, לאפשר לתאים להתיישב לזמן קצר, וחילופים עם 5 מ"ל של חיץ collagenase טרי. ואז דגירה של 35 דקות נוספות ב 37 ° C אמבט מים עם הרעד ב90 סל"ד.
9. במרץ resuspend לעכל באמצעות פיפטה העברה עד ההשעיה מופיעה הומוגנית ללא גושי תא ברורים. ואז בעדינות פיפטה ההשעיה התא דרך רשת ניילון מראש רטובה לתוך בקבוק חרוטי.
10. במרץ פיפטה 3 מ"ל נוסף של תקשורת ה-F-12 DMEM טרי (עם collagenase) מבעד לרשת, על מנת לכפות דרך כל תאים הנותרים.
11. הוסף 6-10 מ"ל נוסף של DMEM מדיה F-12 וllow התאים ליישוב במשך 2-3 דקות. חזור על פעולה זו פעמיים, ולהסיר את supernatant לאחר לשטוף הסופי.
12. הוסף מדיה טרי DMEM-F-12, resuspend התאים, ואת צלחת μl 500 של השעיה תא לתוך באר כל צלחת תרבית רקמת 48 היטב. התאים צריכים להיות דומים לאלו שמתוארים באיור 1.
13. לאפשר את הצלחת לשבת באמבט מים 37 מעלות צלזיוס ב 90 סל"ד במשך 5 דקות לפני הוספת אגוניסטים.
14. לגרות את התאים עם משתנה אגוניסטים במשך 2-4 שעות.
15. הטה את הצלחת בזווית כדי לאפשר לתאים להתיישב ופיפטה בזהירות aliquot של תקשורת (בדרך כלל 100 μl) והקפאת הבזק בחנקן נוזלי.
16. פלאש להקפיא את ההשעיה התא הנותרת. הקפאת פלאש היא לא חיונית למדידות LDH. כפי שניתן שמרו לדגימות אלטרנטיביות על קרח, אם הם יהיו assayed באותו היום או לאחסן -20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך.

4. מדידה דלף קטט דהידרוגנאז

דהידרוגנז דליפת חומצת החלב מדוד (LDH), תוך שימוש בעיקר בחומרים הכימיים וההנחיות שסופקו בערכת 96 Promega CytoTox ללא רדיואקטיבי Cytotoxicity assay (ראה טבלה של חומרים כימיים וחומרים ספציפיים).
1. מחדש את מצע LDH (המסופק בערכה) עם 12 מ"ל של חיץ assay (גם סיפק).
2. הפשירי השעיה תא קפוא ודגימות תקשורת באמבט מים בטמפרטורת חדר.
3. צלחת μl 50 של כל דגימת תקשורת בצלחת 96 היטב.
4. להשעית התא, להוסיף נפח ההכרחי של מאגר תמוגה 10X, כך שהריכוז הסופי הוא 1X. בקצרה מערבולת ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
5. צנטריפוגה דגימות lysed ב 250 XG במשך 4 דקות לפסולת תא גלולה.
6. לlysates התא, צלחת μl 50 של דילול 1:10 לבאר כל צלחת 96 באר.
7. הוסף 50 μl של מצע משוחזר היטב כל אחד, דגירה את הצלחת בחושך בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות.
8. לעצור את התגובה על ידיהוספת 50 μl של להפסיק פתרון (מסופק בערכה) זה טוב.
9. מדוד הספיגה ב 490 ננומטר.
10. השתמש בנוסחות הבאות לחישוב זליגת% LDH. הצפיפות האופטית מתחת מתוקנות על ידי הפחתה מתוך קריאת OD ריקה מהיטב המכיל רק PBS, מצע, ולהפסיק פתרון.

LDH בתקשורת = (מדיה OD492) X (גורם לדילול תקשורת) X (כרך של תקשורת) * מאז הוא בדרך כלל מיותר לדלל דגימות בתקשורת, גורם לדילול יהיה לרוב equal1.

סה"כ LDH = (X X (lysate OD ₄₉₀₎ (גורם לדילול lysate) (כרך א בהשעית תא)) + (X X (מדיה OD ₄₉₀₎ (גורם לדילול) (כרך של תקשורת aliquoted לדגימה))

5. הדבקה של תאי לבלב עם acinar Adenovirus

1. להכיןתאי לבלב acinar כאמור בסעיף 3.
2. בעקבות צעד 3.12, להוסיף 10 יחידות ⁷ זיהומיות (IFUs) של אדנווירוס להשעית תא דגירה למשך 30 דקות ב 37 ° C.
3. באופן שווה צלחת 2 מ"ל של השעיה תא בצלחת 6 באר.
4. עבור רוב בונה ביטוי, תאים צריכים להיות מספקת נגועים בתוך 18 שעות, ועבור חלק ממבני לוציפראז, רק בתוך 6 שעות.

תוצאות

דוגמה של מדידות סיד סלולריים acinar בתגובה לגירויים פיסיולוגיים מסופקת באיור 3. תאי acinar היו עמוסים הסיד לצבוע Fluo-4 וperfused עם אצטילכולין האנלוגי carbachol (CCH; 1 מיקרומטר)) ^8. תאים הגיבו בצורה של גל סיד אשר יוזם באזור הקודקוד ומתפשט לאזור basolateral ^3,9. העתקי נציג ה...

Discussion

שיטת בידוד התא והמבחנים שלאחר מכן מתוארות כאן מייצגים כלים רבי עוצמה שבה ללמוד את התכונות הפיזיולוגיות וpathophysiological של הלבלב אקסוקרינית. השיטה לבידוד תאי לבלב acinar מפוזר תוארה לראשונה על ידי אמסטרדם וג'יימיסון ¹¹ בשינה 1972. השיטות שהוצגו כאן הותאמו משיטות הבידוד...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Company	Catalogue Number	Comments
Mice	NCI	N/A	Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results.
HEPES	American Bioanalytical	AB00892
Sodium Chloride	J.T. Baker	3624-05
Potassium Chloride	J.T. Baker	3040-01
Magnesium Chloride	Sigma	M-8266
Calcium Chloride	Fischer	C79
Dextrose	J.T. Baker	1916-01
L-Glutamine	Sigma	G-8540
1X minimum Eagle's medium non-essential amino acid mixture	Gibco	11140-050
Sodium Hydroxide	EM	SX0593
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
Collagenase	Worthington	4188
Soybean Trypsin Inhibitor	Sigma	T-9003
Carbon Dioxide	Matheson Gas	124-38-9
125 ml Erlenmeyer plastic flask	Crystalgen	26-0005
Dissection kit	Fine Science Tools	14161-10
70% Ethanol	LabChem	LC222102
P1000, P100, P10 pipettes	Gilson	FA10005P
Weighing boat	Heathrow Scientific	HS1420A
Plastic transfer pipettes	USA Scientific	1020-2500
15 ml conical tubes	BD Falcon	352095
50 ml conical tubes	BD Falcon	352070
1.5 ml micro-centrifuge tube	Fisher	05-408-129
0.65 ml micro-centrifuge tube	VWR	20170-293
22 x 22 mm glass coverslips	Fisher	032811-9
Nitric Acid	Fischer	A483-212
Hydrochloric Acid	Fischer	A142-212
Deionized water	N/A	N/A
18 x 18 mm coverslips	Fischer	021510-9
Laboratory film	Parafilm	PM-996
Fluo-4AM	Invitrogen	F14201
Dimethylsulfoxide	Sigma	D2650
Luer lock	Becton Dickinson	932777
60 ml syringe	BD Bioscience	DG567805
23 ¾ gauge needle	BD Bioscience	9328270
PE50 tubing	Clay Adam	PE50-427411
Flat head screwdriver	N/A	N/A
DMEM F-12, no Phenol Red	Gibco	21041-025
30.5 gauge needle	BD Bioscience	305106
5 CC syringe	BD Bioscience	309603
25 ml Erlenmeyer flask	Fischer	FB50025
Nylon mesh filter	Nitex	03-150/38	150 μm pore size
48 well tissue culture plate	Costar	3548
96 well tissue culture plate	Costar	3795
6 well tissue culture plate	Costar	3506
Liquid nitrogen	Matheson Gas	7727-37-9
Cytotoxicity assay kit	Promega	G1782
Adeno-GFP	N/A	N/A	Gift from J. Williams
			Equipment
Ring stand with clamps	United Scientific	SET462
Perifusion chamber	N/A	N/A	Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University
Vacuum line	Manostat	72-100-000
Water bath with shaker	Precision Scientific	51220076
Confocal microscope	Zeiss	LSM 710
BioTek Synergy H1 plate reader	BioTek	11-120-534
Tissue culture hood	Nuaire	NU-425-600
Tissue culture Incubator	Thermo	3110