칼슘 이미징의 목적, 세포 상해 측정 및 아데노 바이러스 감염 췌장 포상 세포의 준비

요약

우리는 생리 학적 및 병리학 관련 자극에 포상 세포 칼슘 신호와 세포의 손상을 검사의 목적을 위해 마우스에서 마우스의 췌장 포상 세포를 제조하는 재생 방법을 설명합니다. 이러한 세포의 아데노 바이러스 감염 방법도 제공됩니다.

초록

췌장 포상 세포 외분비 췌장의 주요 실질 세포이며, 췌장 덕트로 췌장 효소의 분비에 주요 역할을한다. 또한 췌장염의 시작을위한 사이트입니다. 여기에서 우리는 전체 췌장 조직과 세포 내 칼슘 신호의 포상 세포가 고립되는 방법을 설명하는이 측정됩니다. 또한, 우리는 체외에서 포상 세포 손상을 유발 조건에서, 아데노 바이러스 구조와 이들 세포를 형질, 이후 젖산 탈수소 효소, 세포 손상의 마커의 누설을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 포상 세포 생리학 및 병리학의 특성을 수있는 강력한 도구를 제공합니다.

서문

세포질 칼슘의 동적 변화는 생리적, 병리 모두 포상 세포 이벤트가 필요합니다. 칼슘이 발산 효과는 ¹ 신호 칼슘의 독특한 공간과 시간적 패턴의 결과로 생각된다. 예를 들어, 포상 세포에서 효소 액의 분비는 분비 ^{곳이 소요} 혀끝 극의 제한된 지역에서 칼슘 스파이크로 연결됩니다. 대조적으로, 강한 비 진동 칼슘 신호에 의해 다음 글로벌 칼슘 파 급성 췌장염 ^3,4로 이어질 초기 병리학 적 사건과 연관됩니다. 이러한 내부 포상 단백 분해 효소 활성 감소, 효소 분비 및 포상 세포 손상이 (가) 있습니다. 우리 연구실은 생체 내 ^5-7 체외에서 두 질병으로 이어질 이러한 초기 병적 인 이벤트를 공부 고립 췌장암 acini를 사용합니다. 여기에 설명 된 방법은 CY 측정의 목적을 위해 기본 포상 세포의 분리 기술tosolic 칼슘 수준과 세포 손상. 이러한 세포의 아데노 바이러스 감염 방법도 제공됩니다.

프로토콜

1. 칼슘 이미징을위한 췌장 포상 세포를 준비

1. 20 MM의 HEPES 95 mM의 NaCl을 4.7 mM의 KCl을, 0.6 mM의 MgCl _2, 1.3 MM의 _{염화칼슘,} 10 mM의 포도당, 2 MM의 글루타민, 1 × 최소 이글의 중간 비 필수 아미노산을 포함하는 HEPES 배양 버퍼를 준비합니다. NaOH를 pH를 7.4로 최종 솔루션을 조정합니다.
2. HEPES 배양 버퍼 (위에서 설명)의 25 ML에 BSA (1 % W / V 최종)를 추가하여 BSA 배양 버퍼를 준비합니다.
3. 1.1 MG / ML (/ 200 단위 ML) 타입 4 콜라게나 제 1 MG / ML 대두 트립신 억제제 6 BSA 배양 버퍼 (위에서 설명)의 ML을 추가하여 교원질 소화 버퍼를 준비합니다.
4. 두 부분 HNO _3과 2 시간 동안 한 부분 염산에 침지하여 산 세척 22x22 mm의 coverslips를. 그런 다음 70 % 에탄올에 DI 물과 저장소를 사용 가만히 따르다.
5. CO ₂ 질식하여 한 마우스를 안락사. 동양 앙와위에서 동물, 그리고 CLE으로 복부 표면을 준비70 % 에탄올로 aning. 복강을 노출하는 개복술을 수행합니다. 췌장을 해부하고 즉시 교원질 소화 버퍼 6 ML을 포함하는 작은 무게 보트 헹구십시오.
6. 지방이나 눈에 보이는 혈관의 큰 조각을 멀리 해부, 다음 콜라 소화 버퍼의 5 ML을 제거하고 15 ML 원뿔 관에 다시 추가합니다.
7. 미세 해부 가위를 사용하면 콜라게나 소화 버퍼 1 ML을 포함하는 작은 무게 보트 췌장을 말하다. 용액이 균일하게 분산 나타날 때까지 말하다.
8. 125 ML 삼각 플라스틱 플라스크에 다진 제품을 전송하고 컨테이너에 콜라 소화 버퍼의 나머지 5 ML을 추가합니다. 조직이 완전히 버퍼에 빠져들되어 있는지 확인합니다.
9. 37 ° C의 물을 욕조에 플라스크를 놓고 30 분 동안 90 rpm으로 흔들어. 다운 타임이 짧은 기간 동안, 칼슘 활성화 작용제 (예 : caerulein, carbachol)를 준비하고 22x22 mm 산 세척 커버를 씻어DI 물에 미끄러 져. 건조하고 실험실 필름으로 늘어선 평평한 표면 위에 놓습니다.
10. 30 분 다이제스트가 완료되면, 15 ML 원뿔 튜브로 현탁액을 전송하고 세포가 정착 할 수 있습니다. 조심스럽게 콜라게나 소화 버퍼를 피펫 BSA 부화 버퍼 6 ML로 교체합니다. 적극적으로 작은 클러스터로 세포를 분산하기 위해 10 초 동안 손으로 튜브를 흔들. 즉시 동요에, 불안 매체에서 어떤 큰 부동 파편을 제거합니다.
11. 나머지 세포가 정착하고 신선한 BSA의 배양 버퍼 미디어를 교환 할 수 있습니다.
12. 서스펜션은 육안으로 만 정교하게 볼 수 있습니다 만 작은 클러스터로 구성 될 때까지 두 번 1.11 단계를 반복합니다. 세포는 그림 1A (맨 윗줄)에 묘사 된 사람들과 비슷합니다.
13. BSA 배양 버퍼를 제거하고 HEPES 부화 버퍼로 교체합니다.
14. 10 % DMSO에 750 μM, 플루오 오전 4시의 100X 재고를 준비합니다.
15. 세포 현탁액과 BSA없는 HEPES 배양 버퍼를 포함하는 15 ML 원뿔 튜브에 세포를로드합니다. 이 작업을 수행하려면 세포 현탁액의 주식 솔루션의 적절한 볼륨 (1:100 희석)를 추가합니다. 각 22x22 mm의 coverslip에 위에이 정지 다음 접시에 500 μL.
16. 상온에서 어둠 속에서 coverslips를 보관합니다. 첫 번째 칼슘 ^{2 +} 측정을 넣은 후 30 분 소요. 염료가 자동으로 염료로드 후 30 분 발생해야 관류를 시작할 때 중간에서 제거됩니다.

2. 췌장 포상 세포에서 칼슘을 측정

1. DI 워터와 각 관류 셋업을 씻어 버퍼 또는 작용제의 적절한 금액으로 채 웁니다. 적절한 흐름을 확실히하기 위하여 버퍼 또는 작용제와 주요 각 주사기. 링에 주사기를 고정하면 현미경 스테이지 위의 약 1 ~ 2 발을 서있다.
2. 조심스럽게 가장자리 한 coverslip을 포함하는 세포 현탁액에서 파악하는 미세 집게를 사용합니다. 덮개를 기울45 ° 슬립, 그리고 여분의 버퍼가 도망 할 수 있습니다. coverslip을 상단에 세포와 고무 개스킷의 상단에 커버 슬립을 배치하고 챔버 (그림 2A와 2B)를 조립합니다.
3. 단계로 재관류 챔버를 확보하고 챔버 (그림 2C)의 제 1 입구에 버퍼를 포함 튜브를 삽입합니다. 에 버퍼를 포함하는 주사기를 돌려 버퍼가 커버 슬립의 전체 표면을 통해 붓는다 할 수 있습니다. 버퍼 챔버의 반대편에 도달하면, 진공 흡입으로 진공 라인을 삽입합니다. 챔버에 따라 적절한 위치에 다른 튜브 (포함 작용제, 억제제 등)를 삽입합니다.
4. 488 nm의 (그림 1A, 아래)의 파장 플루오 오전 4시 염료를 자극하는 하나 200X 나 400X, 1.4 조리개 수치 목표와 아르곤 레이저를 이용하여 세포를 시각화. 레이저의 전원 설정을 조정해야하도록 광전 튜브 (PMT) 방출되는 빛에 의해 포화되어 있지 않습니다. 또한, PMT의 전압은 최대의 광 검출을 위해 최적화해야합니다.
5. > 515 nm의 긴 패스 방출 신호는 2-5의 프레임 속도로 수집 된 초 빠른 글로벌 칼슘 파도 (그림 3, 4) 시각화를위한 느린 진동 패턴과 0.2 ~ 0.3 초 / 프레임을 시각화 / 프레임.
6. 영상이 완료된 후, 주사기를 닫고 모든 튜브를 제거합니다. 챔버 단계를 반복 2.2-2.4를 분해한다.
7. 이미지 J에 시간이 지남에 형광 강도의 수치 (건강의 국립 연구소에 의해 프리웨어로 제공하고에서 찾을 수있는 소프트웨어 패키지와 데이터 수집 http://rsb.info.nih.gov/ij/를 ).
8. 실시간 세포 영상을 볼 수 있고 관심 영역 (ROI에, 즉 핵, 기저, 정점 등)를 식별
9. 이러한 ROI를 및 R에 대한 형광 강도를 확보형광 강도 / 기준선 형광 강도 (즉, F/F0)로 epresent.
10. F / F ₀ 대를 플로팅하여 표목을 생성 시간입니다. 트레이싱에 더하여, 대표 이미지는 일반적으로 제공하고 사색을 사용하여 표시됩니다.

3. 세포 상해 분석 실험을위한 췌장 포상 세포의 준비

1. 따뜻한 DMEM F-12 미디어 (페놀 레드없이) 37 ° C.
2. DMEM F-12 미디어 BSA (0.1 % W / V 최종) 및 염산 (50 μM 최종)를 추가합니다.
3. 원뿔 튜브로 나누어지는 DMEM 50 ML을.
4. 보충 DMEM F-12 매체 10 ML에 콜라게나 유형 IV의 0.5 MG / ML (12 U / ㎖)을 첨가하여 콜라 버퍼를 준비합니다.
5. CO ₂ 질식하여 한 마우스를 안락사. 동양 앙와위에서 동물, 70 % 에탄올로 세척하여 복부 표면을 준비합니다. 복강을 노출하는 개복술을 수행합니다. 췌장을 해부하고 즉시 작은 무게 보트 C로 씻어콜라게나 버퍼의 6 mL를 ontaining.
6. 3-5 분 동안이나 용액이 균일하게 분산 나타날 때까지 미세 해부 가위를 사용하여 조직을 말하다.
7. 5 분 동안 90 rpm으로 흔들어 37 ° C의 물을 욕조에 추가 콜라 버퍼, 그 장소 5 ㎖와 125 ML 삼각 플라스크에 다진 조직을 전송합니다.
8. 뿌리에서 제거, 세포가 간단히 해결 할 수 있도록하고, 신선한 콜라 버퍼의 5 ML과의 교류. 다음 90 rpm으로 흔들어 37 ° C의 물을 욕조에 추가 35 분 동안 품어.
9. 서스펜션은 명백한 세포 대단히 짧은 시간에 균일 나타날 때까지 적극적으로 전송 피펫을 사용하여 다이제스트를 resuspend을. 그런 다음 부드럽게 삼각 플라스크에 사전에 젖은 나일론 메쉬를 통해 세포 현탁액을 피펫.
10. 적극적으로 남아있는 세포를 강제하기 위해 메쉬를 통해 신선한 DMEM F-12 미디어 (콜라 포함)의 추가 3 mL를 피펫.
11. 또 다른 6-10 DMEM F-12 미디어 mL를 추가2 ~ 3 분 동안 정착 세포를 노래 졌을. 두 번이 단계를 반복하여 최종 세척 후 상층 액을 제거하십시오.
12. 48 잘 조직 배양 플레이트의 각 우물에 신선한 DMEM F-12 미디어 세포를 resuspend을하고, 세포 현탁액의 플레이트 500 μl를 추가합니다. 세포는 그림 1B에 묘사 된 사람들과 비슷합니다.
13. 플레이트 작용제를 추가하기 전에 5 분 동안 90 rpm에서 37 ° C의 물을 욕조에 앉아 할 수 있습니다.
14. 2-4 시간 동안 작용제의 변화와 세포를 자극한다.
15. 세포가 정착주의 깊게 미디어 나누어지는 (일반적으로 100 μL)와 액체 질소에 플래시 동결을 피펫 할 수 있도록 각도에서 접시를 기울이십시오.
16. 플래시가 남아있는 세포 현탁액을 동결. 플래시 동결 LDH 측정을 위해 필수적인 없습니다. 그들은 같은 날 assayed 또는 장기 저장을 위해 -20 ° C에 저장 될 경우 다른 샘플은 얼음에 보관하실 수 있습니다로.

4. 젖산 탈수소 효소의 누설을 측정

측정 젖산 탈수소 효소 (LDH) 누설 주로 프로 메가 CytoTox 96 비 방사성 세포 독성 분석 키트 (특정 시약 및 재료의 표 참조)에 제공 시약 및 지침을 사용하여.
1. 재구성 LDH 기판 (키트에 제공되는) 분석 버퍼의 12 ML로 (또한 제공).
2. 상온에서 물을 욕조에서 냉동 세포 현탁액 및 미디어 샘플을 해동.
3. 96 - 웰 플레이트에 각 미디어 샘플의 접시에 50 μL.
4. 최종 농도가 1X되도록 세포 현탁액을, 10X 용해 버퍼의 필요한 볼륨을 추가합니다. 60 분 37 ° C에서 소용돌이 짧게 품어.
5. 펠렛 세포 파편 4 분 250 XG에 용해 샘플을 원심 분리기.
6. 세포 용 해물을 위해, 96 웰 플레이트에 1:10 희석 플레이트 50 μL.
7. 각각의 well에 재구성 기판의 50 μl를 추가하고, 30 분 동안 상온에서 어둠 속에서 접시를 품어.
8. 하여 반응을 정지각각의 well에 스톱 솔루션 (키트에 포함)의 50 μl를 추가 할 수 있습니다.
9. 490 nm에서 흡광도를 측정한다.
10. % LDH 유출을 계산하려면 다음 공식을 사용합니다. 아래의 광학 밀도는 잘 만있는 PBS, 기판에서 빈 OD 읽기를 빼서 수정 및 솔루션을 중지 할 수 있습니다.

미디어 =있는 LDH (미디어 OD492) × (미디어 희석 계수) × (미디어 권)는 미디어 샘플을 희석하는 것이 필요하기 때문에 *, 희석 요인을 가장 자주 equal1.

총 LDH = ((해물 OD ₄₉₀₎ × (lysate의 희석 계수) × (세포 현탁액의 권)) + ((미디어 OD ₄₉₀₎ × (희석 계수) × (샘플링 분주 미디어 권))

5. 아데노 바이러스로 췌장 포상 세포를 감염

1. 준비췌장 포상 세포는 3 장에서 설명했다.
2. 단계 3.12에 따라 세포 현탁액에 아데노 바이러스 10 ⁷ 전염성 단위 (IFUs) 추가 37 30 분 품어 ° C.를
3. 6 - 잘 접시에 세포 현탁액의 균등 판 2 ㎖.
4. 대부분의 표현 구조의 경우, 세포가 적절하게 18 시간 내에 감염되어야하고, 단지 6 시간 내에 몇 루시퍼 구조를 위해.

결과

생리적 자극에 응답 포상 세포의 칼슘 측정의 예는 그림 3에 나와 있습니다. 포상 세포는 칼슘에 의해로드 된 염료 플루오 4 아세틸 콜린 아날로그 carbachol (CCH, 1 μM)로 관류) ^8. 세포는 혀끝의 지역에서 시작하고 기저 영역 ^3,9에 전파 칼슘 파의 형태로 반응했다. 그림 3b에서와 같이 대표 표목은 일반적으로 1 μM의 carbachol 관찰 전형적인 피크 고원 패턴을 보?...

토론

세포 분리 방법과 이후의 분석은 외분비 췌장의 생리적 및 병리 적 특징을 연구하는 강력한 도구를 나타냅니다 여기 아닙니다. 분산 췌장 포상 세포를 분리하는 방법은 1972 년 ¹¹ 암스테르담 제이미 슨에 의해 설명되었다. 여기에 제시된 방법은 반 애커와 동료 ^(12)에 의해 설명 최근 분리 방법에서 적응되었다. 이러한 기술은 높은 재현성 쉽게 배울 수 있지만, 정확하게 수행해야합...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Company	Catalogue Number	Comments
Mice	NCI	N/A	Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results.
HEPES	American Bioanalytical	AB00892
Sodium Chloride	J.T. Baker	3624-05
Potassium Chloride	J.T. Baker	3040-01
Magnesium Chloride	Sigma	M-8266
Calcium Chloride	Fischer	C79
Dextrose	J.T. Baker	1916-01
L-Glutamine	Sigma	G-8540
1X minimum Eagle's medium non-essential amino acid mixture	Gibco	11140-050
Sodium Hydroxide	EM	SX0593
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
Collagenase	Worthington	4188
Soybean Trypsin Inhibitor	Sigma	T-9003
Carbon Dioxide	Matheson Gas	124-38-9
125 ml Erlenmeyer plastic flask	Crystalgen	26-0005
Dissection kit	Fine Science Tools	14161-10
70% Ethanol	LabChem	LC222102
P1000, P100, P10 pipettes	Gilson	FA10005P
Weighing boat	Heathrow Scientific	HS1420A
Plastic transfer pipettes	USA Scientific	1020-2500
15 ml conical tubes	BD Falcon	352095
50 ml conical tubes	BD Falcon	352070
1.5 ml micro-centrifuge tube	Fisher	05-408-129
0.65 ml micro-centrifuge tube	VWR	20170-293
22 x 22 mm glass coverslips	Fisher	032811-9
Nitric Acid	Fischer	A483-212
Hydrochloric Acid	Fischer	A142-212
Deionized water	N/A	N/A
18 x 18 mm coverslips	Fischer	021510-9
Laboratory film	Parafilm	PM-996
Fluo-4AM	Invitrogen	F14201
Dimethylsulfoxide	Sigma	D2650
Luer lock	Becton Dickinson	932777
60 ml syringe	BD Bioscience	DG567805
23 ¾ gauge needle	BD Bioscience	9328270
PE50 tubing	Clay Adam	PE50-427411
Flat head screwdriver	N/A	N/A
DMEM F-12, no Phenol Red	Gibco	21041-025
30.5 gauge needle	BD Bioscience	305106
5 CC syringe	BD Bioscience	309603
25 ml Erlenmeyer flask	Fischer	FB50025
Nylon mesh filter	Nitex	03-150/38	150 μm pore size
48 well tissue culture plate	Costar	3548
96 well tissue culture plate	Costar	3795
6 well tissue culture plate	Costar	3506
Liquid nitrogen	Matheson Gas	7727-37-9
Cytotoxicity assay kit	Promega	G1782
Adeno-GFP	N/A	N/A	Gift from J. Williams
			Equipment
Ring stand with clamps	United Scientific	SET462
Perifusion chamber	N/A	N/A	Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University
Vacuum line	Manostat	72-100-000
Water bath with shaker	Precision Scientific	51220076
Confocal microscope	Zeiss	LSM 710
BioTek Synergy H1 plate reader	BioTek	11-120-534
Tissue culture hood	Nuaire	NU-425-600
Tissue culture Incubator	Thermo	3110