ייצור של<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; ביצה מחלץ לזהות RNAs microtubule הקשורים

Summary

אנו מתארים את האוסף של מופרה Xenopus tropicalis ביצים וייצור של תמצית ביצה השנייה, נעצר מיוזה. תמצית ביצה זה יכול לשמש כדי לטהר microtubules וRNAs microtubule הקשורים.

Abstract

אורגניזמים רבים למקם mRNAs ליעדי subcellular ספציפיים לביטוי גני שליטת מרחב ובזמן. מחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי הרוב המכריע של transcriptome הוא מקומי למיקום אקראי בתאים ועובר. גישה אחת לזהות mRNAs מקומית היא לטהר יוכימית מבנה תאי של עניין וכדי לזהות את כל התמלילים הקשורים. תוך שימוש בטכנולוגיות רצף תפוקה גבוהה שפותחו לאחרונה עכשיו זה פשוט לזהות את כל RNAs הקשורים למבנה subcellular. כדי להקל על זיהוי תמליל יש צורך לעבוד עם האורגניזם עם הגנום רצף במלואו. מערכת אחת אטרקטיבית לטיהור הביוכימי של מבני subcellular הן תמציות המופקות מביציות הצפרדע Xenopus laevis. עם זאת, X. laevis אין כרגע הגנום רצף באופן מלא, מה שפוגע בזיהוי תמליל. במאמר זה אנו מתארים שיטהכדי להפיק תמציות מביצת צפרדע קשורה, X. tropicalis, שיש לו רצף הגנום מלא. אנו מספקים פרטים לפילמור microtubule, טיהור ובידוד תמליל. בעוד מאמר זה מתאר שיטה לזיהוי ספציפית של תמלילי microtubule הקשורים, אנו מאמינים שזה ייושם בקלות למבני subcellular אחרים ויספק שיטה רב עוצמה לזיהוי של RNAs מקומי.

Introduction

שליטה במרחב ובזמן של ביטוי גנים הוא חשובה לכל התאים, וחשוב במיוחד לשליטה על עוברית מוקדמות מטופף ^1. שליטה במרחב של ביטוי גנים מושגת באמצעות הלוקליזציה הפעילה של mRNAs ליעדים ספציפיים בתוך תאים או בעוברים. בסוגי תאים רבים גדולים מאוד, (למשל ביציות, עובר, ועל נוירונים) משמשת לוקליזציה mRNA כדי להגביל ביטוי חלבון לאתר פעולה של החלבון המקודד. מאז ה-mRNA מקומית יכולה לזרז סיבובים רבים של ייצור חלבון הוא יעיל יותר בתרגום ה-mRNA מלמקם מולקולות חלבון בודדות. mRNAs מקומית בדרך כלל מודחקת translationally עד שהם מגיעים ליעדם, המשמש להגבלת הלוקליזציה של החלבון המקודד ² נוספת. בנוסף למקרים המתועדים היטב הרבים של RNA לוקליזציה לשלוט דפוסים עובריים, מספר מחקרים תעדו mRNAs שהן נקודותלאתר פעולה של החלבון המקודד. דוגמאות בולטות כוללות לוקליזציה של β-אקטין ³ וArp2 / 3 ⁴ mRNAs לקצה המוביל של fibroblasts הנעים ובלוקליזציה של mRNAs לרגולטורי mitotic רבים לmeiotic וmitotic צירים ^5-7.

רבים מדוגמאות קלאסי של mRNAs המקומיות זוהו באמצעות מסכי גנטיים למוטציות השפעה אימהיות ולאחר מכן נקבעו לקידוד RNAs מקומי. עם זאת, מחקרי הגנום האחרונים החלו לספק תובנה רחבה יותר בהיקף של RNAs מקומי. אחרונים במסך הכלאה באתר בעוברים תסיסנית הוכיח כי ~ 70% מכל mRNAs יש לוקליזציה ספציפית, כולל יעדים רבים רומן ^8. טיהור pseudopodia מfibroblasts העכבר זיהתה קבוצה מגוונת של מקומי mRNAs ^9. עובד מהקבוצה שלנו באמצעות טיהור ביוכימי של microtubules מmeiotic קסנומוגלה ביצה מחלצת מאות מזוהים של mRNAs כי copurify עם ציר ^5,7. העבודה שלנו הראתה כי הרוב המכריע של mRNAs microtubule ההמקומית לקודד חלבונים המתפקדים בשליטה של ​​מיטוזה, תומך ברעיון שmRNAs מותאמת לשפה מקומית לאתר פעולה של החלבון המקודד. יתר על כן, היכולת לזהות העשרת mRNA בשבריר subcellular על ידי טיהור ביוכימי מדגישה את כוחה של גישה זו לזיהוי mRNAs מקומית.

RNAs מקומי ביותר להשתמש בתחבורה פעילה בשלד התא, או אקטין או microtubules, כדי להשיג את ההובלה ליעד הסופי שלהם ^10. כדי להשיג הבנה טובה יותר של ההיקף והסוגים של RNAs המקומיים ליעדים ספציפיים באמצעות גישה ביוכימית זה יש צורך יש במערכת במבחנה שיכול לסכם תהליכי cytoskeletal. אחת מהמערכות המובילות ללימוד הביולוגיה cytoskeletal הוא תמציות ביצים יוצרמהביצים מופרות מצפרדע Xenopus laevis. X. תמציות ביצת laevis שמשו במשך עשרות שנים כדי ללמוד מגוון רחב של תהליכי cytoskeletal ותרמו הרבה להבנתנו את המנגנונים והמולקולות השולטים הרכבה cytoskeletal ^ו11 דינמיקה שלנו. יתר על כן, X. תמציות ביצת laevis ניתנות לpurifications בקנה מידה גדולה של microtubules וחלבונים הקשורים ^12,13 ויש שיטות מעוצבות היטב לייצור סוגים שונים של תמציות ביצים ^14-16. עם זאת, למחקרים גנומיים יש כמה חסרונות לשימוש בX. laevis כמערכת מודל.

במשך עשרות שנים צפרדעי laevis Xenopus היו מערכת רב עוצמה לחקר ביולוגיה התפתחותית ותא, בשל גודל הביצית הגדול ופיתוח חיצוני ¹⁷ חזק. יתר על כן, הפיתוח של מערכות תמצית ביצים שיכולים לסכם רבים processe הסלולריים במבחנה הפך צפרדע זה מודל ניסיוני רב עוצמה. עם זאת, Xenopus laevis כבר הקשו על ידי חוסר רצף הגנום מלא, שהואט על ידי טבע allotetraploid של ניגוד genome.In, מין הקשורות באופן הדוק, Xenopus tropicalis, יש גנום דיפלואידי שהיה רצף בשינה 2010 ^18. בעוד X. tropicalis לא כצייתן באופן ניסיוני כX. laevis ¹⁷ הזמינות של הגנום רצף הופך אותו למערכת אטרקטיבית מודל לבצע ניתוחים רחבים הגנום.

בדו"ח זה אנו מתארים שיטה לעשות תמציות גורם-II-נעצרו, cytostatic מיוזה (CSF) מX. tropicalis ^19. לאחר מכן, אנו מתארים שיטה פשוטה לטהר microtubules וRNAs הנלווים מתמצית זו. את RNAs לאחר מכן ניתן להמיר את ספריות המתאימים לשימוש בטכנולוגיות רצף רצף פותחו לאחרונה תפוקה גבוהה. ברגע שהספריותהם רצף שהם יכולים להיות מיושרים לגנום של הצפרדע לזהות mRNAs ספציפית שמועשרות במדגם microtubule בהשוואה לתמצית מוחלטת. זה מספק שיטה רב עוצמה לאיתור לוקליזציה mRNA microtubule ממוקדת בקנה מידת הגנום כולו. בנוסף להיותו מסוגל לזהות mRNAs מקומית, השימוש ברצף תפוקה גבוהה ורצף הגנום מציע את האפשרות של גילוי תמלילי רומן שאינם נמצאים כרגע בהווה בביאורי מסדי נתונים ציבוריים.

Protocol

1. דור של X. tropicalis ביצים

כל צפרדעי tropicalis Xenopus מסודרות מNasco. הצפרדעים שלנו שוכנות בבתי גידול מימיים מערכת מים הסירקולציה המחודשת שמרה על 27 ° C. ישנן אפשרויות רבות למערכות מים לטיפול של X. tropicalis. ניתן למצוא קצת מידע כללי טוב על מיני צפרדעים זה באינטרנט באתרים של הרלנד וגריינג'ר המעבדות (http://tropicalis.berkeley.edu/home/, http://www.faculty.virginia.edu/xtropicalis /). הצפרדעים שלנו נשמרות בtankwater בהיקף של (0.4 גר 'מלח Ciclid אגם, 0.6 גר' מלח ים, 0.625 גרם NaHCO ₃ לליטר מים, pH 7.0) ^20. תוצאות המתכון הזה במוליכות של 1800 ~ μS, אשר היא מליחות גבוהה לX. tropicalis. עם זאת, מצאנו כי צפרדעינו לשגשג בthiהסביבה של ביצית והאיכות משופרת. ניתן למצוא מתכוני tankwater אלטרנטיביים לעיל במשאבים הרשומים לכללי X. טיפול tropicalis.

1. צפרדעים מוזרקות עם גונדוטרופין כוריוני האנושי (hCG) בשלושה ימים רצופים כדי לעורר הנחת ביצה: ראשית, להכין שני ריכוזים של פתרון hCG. U resuspend 10,000 של אבקת hCG lyophilized ב10 מ"ל סטרילי, H ₂ O deionized לריכוז סופי של 1,000 U / מ"ל. ואז, לדלל 1 מ"ל של תמיסת 1,000 U / מיליליטר hCG ב9 מ"ל H ₂ O לריכוז סופי של 100 U / מ"ל. לאחסן שני פתרונות ב 4 ° C.
2. ביום 1 ביום, להכין 4-6 צפרדעים להטלת ביצים על ידי הזרקה עם hCG בין 2:00-03:00. הזרק כל צפרדע בצק הלימפה הגבי ליד הביב עם פתרון 0.2 מ"ל 100 U / ml hCG. לאחר הצפרדעים מהירה בשתי הזריקות הבאות יהיה למזער את כמות פסולת הווה צפרדע במהלך הטלת ביצים, אבל הוא אופציונלי.
3. ביום 2, להזריק את אותם צפרדעיםעם פתרון 0.2 מ"ל 100 U / ml hCG בין 2:00-03:00.
4. ביום 3, להזריק את אותם צפרדעים עם פתרון 0.2 מ"ל 1,000 U / מיליליטר hCG, בין 7:00-10:00. הגדר את הצפרדעים להטיל ביצים: למלא דלי פלסטיק 6 ליטר עם tankwater הטרי, להוסיף צפרדעים ומקום בחושך ב 25 ° C. לאחר הזרקה זו, הנחת ביצה תתחיל אחרי 4 שעות ותהיה שלם של 7 שעות. צפרדעים צריכה להטיל ביצים בסביבה, כי הוא שמר על מינימום של 25 ° C.
5. הפוך לחלץ פתרונות ויש לי ציוד מוכן מייד לפני איסוף ביצים.

20X MMR: 100 HEPES מ"מ, pH 7.8 2 מ"מ; EDTA pH 7.8, 2 M NaCl, 40 מ"מ KCl, 20 מ"מ MgCl _2; 40 מ"מ CaCl _2. חיטוי ולאחסן בטמפרטורת חדר. הכן 1 ליטר של MMR 1X רק לפני לחלץ הכנה.

XB 10X: 100 HEPES מ"מ, pH7.7; 10 מ"מ MgCl _2; 1 מ"מ CaCl _2; 1 M KCl; סוכרוז מ"מ 500. חיטוי ולאחסן ב 4 ° C. הכן 1 ליטר של 1X XB JUST לפני לחלץ הכנה. פתרון Dejelly: הכן פתרון ציסטאין 3% 250 מ"ל בdeionized H ₂ O ו-pH 7.8-8.0 עם 10 N NaOH. הכן רק לפני לחלץ הכנה.

CSF-XB: לקחת 200 מ"ל של 1X XB ולהוסיף 2 מ"ל 0.5 M pH 7.7 EGTA ו200 μl 1 M MgCl _2. הכן רק לפני לחלץ הכנה.

CSF-XB +: לקחת 50 מ"ל של CSF-XB ולהוסיף 50 μl של LPC (10 מ"ג / מ"ל ​​כל מניה של leupeptin, Pepstatin, וChymostatin DMSO). הוסף 50 Cytochalasin D μl (10 מ"ג / מ"ל ​​ב DMSO). הכן רק לפני לחלץ הכנה.

הכן פתרון ג'לטין 0.2% בdeionized H ₂ O, מיקרוגל כדי להמס ולסנן לעקר. לאחסן בטמפרטורת חדר.

2 2 x ½ צינורות ultracentrifuge מילואים Beckman אינץ.

הכן שני 15 צינורות צנטריפוגה עגולים תחתיי מ"ל זכוכית עם 0.5 מ"ל של H ₂ O בכל אחד כדי לרכךultracentrifuge צינור.

הפוך את האש מלוטשת pipettes פסטר זכוכית. הצמד את הסוף של 5 ¾ pipettes זכוכית אינץ לחשוף פתיחה רחבה, ולחשוף ללהבה כדי להחליק את קצה פיפטה נחשף החדש.

6. הכן כוס 500 מיליליטר זכוכית לאחסון ביצים על ידי מתערבל פתרון ג'לטין 0.2% סביב למעייל הקירות של הכוס. בטל פתרון ג'לטין מכוס לאחר שימוש.
7. לאסוף ביצים מדלי הפלסטיק המשמש להנחת שעות 6-7 לאחר ההזרקה השלישית ביום 3. אם תרצה, בעדינות לסחוט כל צפרדע פעם אחת כדי לקבל את כל ביצים הנותרות. לשטוף ביצי פעם אחת עם tankwater והעברה לכוס זכוכית 500 מ"ל מצופה בפתרון ג'לטין 0.2% טריים.

2. הכנת תמצית מX. ביצי tropicalis

כל השלבים של הכנת תמצית יכולים להתבצע בטמפרטורת חדר, כ 25 ° C. במהלך שוטף, חשוב לשמור על הביצהמתחת למים ים מתחת לנוזל, כך שהם יישארו רטובים. חשיפה לאוויר יכולה לגרום לביצים לברוח עצירת מחזור תא או lyse.

1. למזוג כמה שיותר tankwater ככל האפשר, תוך הזמנת מספיק נוזלי כדי לשמור את הביצים רטובות. הטה את הכוס המכילה ביצים בצד ולהוסיף ~ 300 מ"ל 1X MMR לאט לקיר של הכוס, כך שהתסיסה פיזית של הביצים היא מזערית. בוא ביצים להתיישב, ואז למזוג את הפסולת המכילה supernatant. X. ביצי tropicalis הן סיביים בשלב זה, ולכן הסרת ביצים הופעלה נעשה לאחר dejellying. חזור על פעולה עבור סכום כולל של שלוש שוטף 1X MMR.
2. Dejelly את הביצים. למזוג את כמו MMR כמחצית אפשרית ותוספת של פתרון dejelly. מערבולת ברציפות במשך כ 5 דקות. המסת שכבות ג'לי תהיה גלויה בsupernatant לאחר כמה דקות. למזוג את ולהוסיף את פתרון dejelly הנותר. ממשיך לערבל ברציפות עד ביצים לארוז בחוזקה וכל האוריינט עם המוט הצמחי (המוטעם פיגמנט לבן) לכיוון החלק התחתון של המנה. למזוג את מהירות כפתרון הרבה dejelly ככל האפשר. ברגע שהביצים dejellied הם מאוד רגישים למניפולציות מכאניות.
3. להוסיף XB זהירות את הביצים. בכביסה XB הראשונה, להסיר ביצים שנמלטו CSF מעצר על ידי הסרת ביצי lysed, נפוחים, לבנים, וpseudocleavage. הופעל X. ביצי tropicalis נוטות להתיישב במרכז הראש, כך להשתמש פיפטה העברה פלסטיק כדי למשוך את אלה. גם להסיר את פיסות עור ופסולת צפרדע. לשטוף ביצים בסך הכל שלוש פעמים עם פתרון ~ 300 מ"ל 1X XB, בעדינות מתערבל ביצים בין שוטף ומאפשר להם להתיישב בתחתית הכוס. כמו בעבר, למזוג כמה שיותר מכל פתרון לשטוף ככל האפשר, תוך שמירה על ביצים רטובות.
4. לשטוף ביצים פעמיים עם CSF-XB ולמזוג.
5. הוסף CSF-XB + לביצים. באמצעות אש המלוטשת ג'לטין שטופל פיפטה פסטר, ביצים לצינורות Ultra-צנטריפוגות העברה עם CSF-XB +, נזהר שלא לחשוף את הדוארggs לאוויר. במקום בתוך 15 צנטריפוגות צינורות זכוכית מ"ל עם כרית המים.
6. ספין ביצים בצנטריפוגה קלינית ב XG 200 דקות 1, להגדיל את המהירות ל -800 XG וספין למשך 30 שניות.
7. השתמש aspirator להסיר כמה שיותר חיץ ככל האפשר מהביצים. הם צריכים להיות כמעט יבשים על העליונה. מהר להעביר ביצים לצנטריפוגות Sorvall RC-6 מצוידות בHB-6 הרוטור (או שווה ערך) וספין 17,000 XG במשך 15 דקות ב 20 ° C.
8. הסר את שכבת cytoplasmic הצהובה בין פיגמנט ושכבות שומנים בדם באמצעות מחט מד 18 מצורפת מזרק 1 מ"ל. לנקב את הצד של הצינור ולמשוך את חבית המזרק לאט כדי להשיג את שכבת תמצית cytoplasmic. הימנע מגרגירי פיגמנט ככל האפשר.
9. העבר את הציטופלסמה לצינור ultracentrifugation החדש. זה נורמלי לתמצית להופיע מעט מעונן בשלב זה. מקום בתוך צינור צנטריפוגות זכוכית 15 מ"ל עם כרית מים. ספין שוב 17,000 XG במשך 10 דקות ב 20 ° C. חזור על שלוחהraction עם מחט מד 18.
10. העבר את הציטופלסמה לצינור 1.5 מיליליטר microfuge. לאמוד את היקף התמצית ולדלל Cytochalasin D וLPC 1:1,000 לתמצית. מערבבים היטב עם מיליליטר פיפטה קצה 1, pipetting למעלה ולמטה פעמים רבות ללא הכנסת בועות אוויר. תשואה אופיינית ממושבת צפרדע בריאה היא כ 300-500 μl של תמצית / צפרדע. כדי לשמר את הפעילות מקסימלית, יש צורך לאחסן את התמצית ולבצע מניפולציות ניסיוני בטמפרטורת חדר (20-25 ° C).

3. טיהור Microtubules טקסול התייצב מX. tropicalis חלץ

1. הוסף לטקסול aliquot μl 100-200 של תמצית בריכוז סופי של 10 מיקרומטר ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות. לתגובות בקרה, טיפול בהיקף שווה ערך של תמצית עם תרופת Nocodazole microtubule-destablilzing (10 מיקרומטר). μl המילואים 100 של תמצית מטופל לניתוח.
2. לדלל את הטיפול תרופתילחלץ עם 10 כרכים + 30% גליצרול BRB-80 (80 מ"מ pH צינורות 6.8, 1 מ"מ MgCl _2, 1 מ"מ EGTA). 14 להרכיב צינורות פוליפרופילן מסביב לתחתית מ"ל המכילים 10 מ"ל של BRB-80 + כרית גליצרול 60%. באמצעות משעמם פיפטה קצה רחב, שכבת תגובת המטופלים בתרופת התמצית בעדינות על גבי BRB-80 + 60% כרית גליצרול. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב -17,000 XG ב 20 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה Sorvall RC-6 מצוידות בHB-6 הרוטור (או שווה ערך) ומתאמי צינור.
3. לשאוב את חומר supernatant המכיל תמצית unsedimented, ולשטוף פעמיים עם ממשק deionized H ₂ O. לשאוב את נפח הכרית שנותר לאט, נזהר שלא להפריע דמוית ג'ל גלולה המכילה microtubules, חלבוני microtubule הקשורים, וRNAs microtubule הקשורים במדגם שטופל בטקסול. המדגם Nocodazole טופל אינו מכיל חומר גלוי. Resuspend גלולה ב 1 מיליליטר TRIzol ולהמשיך עם הוראות היצרן לבידוד RNA. Untrתמצית eated (μl עד 100) יכולה להיות resuspended ישירות בTRIzol 1 מ"ל.
4. כיום יש ערכות זמינות מסחרי להכנת ספריות transcriptome מתאימה לRNA-אילך. אלה ניתן לרכוש דרך http://www.illumina.com/ וhttp://www.454.com/.

תוצאות

לזהות X. תעתיקי tropicalis קשורים microtubules, אנו מכינים תמצית cytosolic מהביצים מופרות שנעצרו בmetaphase של המיוזה השנייה (CSF). טיפול בתמצית זו עם טקסול מאפשר היווצרות של microtubules יציבה שיכול להיות מטוהרות על ידי שקיעה באמצעות כרית גליצרול (איור 1 א). ניתוח ג'ל Coomassie מאשר שמשקעי α / β-טובולין באופן טקסול תלוי, ומייצג את מיני חלבון הגדולים התאוששו בהכנות אלה (איור 1). רמות נמוכות יותר של חלבונים אחרים הן גם בהווה בגלולת טקסול, אבל לא בהכנות שטופלו בתרופת microtubule depolymerizing nocodazole, המציין כי חלבונים בשבריר טקסול המקורב במיוחד עם microtubules (מפות).

Bioanalyzer Agilent משמש לבחינת הרכב RNA כללי בכל X. ברי תמצית tropicalis (איור 1 ג ). שניהם rRNA tRNA ומינים שנמצאים בתמצית CSF וטקסול גלולה המכילה microtubule, עולה בקנה אחד עם ממצאים קודמים שהתרגום מתרחש על microtubules וצירים בX. laevis ביצה לחלץ ^5,21. עקבות שורה של הקרנת ג'ל מגלה את אות ה-mRNA היא נמוכה במידה ניכרת בmicrotubule המכיל טקסול גלולה, בעיקר באזור הנודדות מעל 28S rRNA, המציין כי קבוצת משנה של cosediment mRNAs עם microtubules בX. tropicalis. רנ"א מבודד באופן זה הוא מתאים לניסוי RNA-Seq באמצעות חומרים כימיים מסחרי זמינים.

איור 1. טיהור של MT-RNA לRNA-אילך. () ערכת טיהור לבודד MT-RNA. ביצים נקצרים מן הנקבה X. טרוצפרדעי picalis. לאחר הכנת תמצית cytoplasmic, טקסול מתווסף לגרום פילמור microtubule. Microtubules וMT-RNA הם מטוהרים על ידי שקיעה באמצעות כרית גליצרול. (ב ') ניתוח ג'ל Coomassie של חלבונים המבודדים באמצעות ערכה שמתוארת ב(). סה"כ CSF לחלץ בהשוואה לחלבוני משקעים בנוכחות טקסול או nocodazole. (ג) ניתוח Bioanalyzer ג'ל של רנ"א מבודד באמצעות ערכה שמתוארת ב(). רנ"א מבודד מCSF לחלץ לעומת RNA משקעים בנוכחות טקסול או nocodazole. גם הקרנת ג'ל ואת עקבות הקו מוצגות. התפרסם באישור שארפ, et al., (2011). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Discussion

בדוח זה שתארנו שיטה פשוטה לייצור תמציות ביצת CSF-נעצר מX. tropicalis ¹⁹ ולהשתמש בתמצית זו כדי ללמוד RNAs microtubule הקשורים ^7. ההליך הבסיסי לייצור תמציות ביצת CSF-נעצרו מX. tropicalis זהה המשמש לX. laevis עם כמה הבדלים מרכזיים. אחד ההיבטים המאתגרים ביותר לעבודה עם X. צפרדעי tropicalis היא השגת ביצים באיכות גבוהות מספיק כדי להפוך את תמצית עם נוקלאציה microtubule או פעילות דומה להרכבת ציר X. laevis ביצת תמציות. כדי להשיג תנאי הטלה אופטימליים תוך מניעת זליגה ממעצר המיוזה השנייה במחזור תא, המרווח בין זריקות הורמונים לX. tropicalis הוא קצר יותר מזה המשמש לX. laevis, והעיתוי מהזרקת hCG השלישי לתחילת הנחת ביצה הוא גם הרבה יותר קצר. עם X. laevis עיתוי מהזרקת hCG כדי לאהוא תחילת הנחת ביצה היא כזה שהוא נוח ויעיל לביצים שהונחו בין לילה לחיץ. עם זאת, בשל הזמן הקצר יותר בין ההזרקה וביצת hCG הנחת עם X. tropicalis זה הוא לעתים קרובות הכרחי כדי לבטא באופן ידני את הביצים מצפרדעים. עוד הבדל משמעותי בין מה שהופך את תמצית ביצה משתי הצפרדעים השונות הוא צעד dejellying. עם X. laevis את הביצים כל כך גדול שזה קל לקבוע מתי מעיל הריבה נמס על ידי התבוננות כיצד מקרוב את הביצים הם מרווחים בכוס. כתגובת dejellying מתחילה, את הביצים להתחיל לארוז יותר בצפיפות. עם זאת, X. ביצי tropicalis הן הרבה יותר קטנים וזה יכול להיות די קשה לקבוע מתי מעיל הריבה נמס בביצת אריזת צפיפות לבד. מצאנו כי השיטה אמינה ביותר לקבוע מתי מעיל הריבה נמס היא לפקח על נטייתו של בעל החיים (שחור) וצמחיים (לבן) הקטבים. כאשר כל קטבי אורי צמחייםאף אוזן גרון לכיוון החלק התחתון של כוס ריבת מעיל הוסר מספיק כדי להמשיך עם התמצית. לבסוף, ואילו X. ניתן לאחסן תמצית ביצת laevis בטמפרטורות קרירות (4-12 מעלות צלזיוס) שראינו שזה הוא קריטי כדי לשמור על X. תמצית ביצת tropicalis בטמפרטורת חדר (20-25 ° C) במהלך הכנה ומניפולציות ניסיוני כדי לשמר את הפעילות ביוכימית. בגלל ההבדלים בנוחות שימוש שאנו מעדיפים להשתמש X. צפרדעי laevis לייצור של תמצית ביצים. עם זאת, בניסויים שדורשים או בהנחייתם של האורגניזם עם רצף הגנום, X. tropicalis הוא מערכת אלטרנטיבית מצוינת.

השיטה שתארנו בדוח זה משתמש בטקסול כסוכן microtubule-מייצב כדי לגרום פילמור microtubule. אנחנו בחרנו בשיטה זו משום שטקסול הוא סוכן microtubule-מייצב חזק המאפשר בידוד בקנה מידה גדולה של מטוהרים microtubules. ה השיטהשבתארנו סביר יכול להיות שיפור באמצעות השוואת בין החלבונים RNAs קשורים microtubules בשיטות פילמור microtubule חלופיות. חלופות יכולים לכלול פילמור באמצעות GTP-Induced פילמור (טכניקה קלאסי), ²² או שימוש ברן-GTP כpolymerizer microtubule לחקות את microtubules הנגרמת על ידי הרכבה ציר הכרומטין מונחה ^23. לבסוף, שימוש מטוהר גרעיני זרע כדי לגרום פילמור microtubule יהיה לחקות הקרוב ביותר לסוגי microtubules הnucleated במהלך מיטוזה (centrosome, הכרומטין, ותיווך kinetochore). חסרונות למקורות חלופיים אלה של נוקלאציה microtubule הם כי סוכני nucleating הם לא ברצון כטקסול והם לא nucleate או לייצב microtubules בצורה יעילה ככל טקסול. לכן, כל אחת מהשיטות הללו, יהיה קשה יותר לשימוש עבור purifications בקנה מידה גדולה. היתרון של השוואה בין סוגים שונים מרובים של nucleators microtubuleהוא שזה יכול להיות אפשרי לזהות חלבונים ו / או RNAs שהם ספציפיים לכל מסלול של נוקלאציה microtubule.

השיטה שתארנו כאן מנצלת תמציות cytoplasmic של דו חיים. עם זאת, גישה זו ניתן תהיה להרחיב את השימוש במערכת לחלץ מאורגניזמים אחרים. תמציות mitotic כבר תאר ממסונכרן תאי תרבית רקמה אנושיים ²⁴ שנאמנו לסכם היבטים רבים של ההרכבה microtubule. אנחנו השתמשנו בהצלחה תמציות אלה כדי לזהות RNAs microtubule הקשורים מהלה תאים ^5. תוכניות טיהור microtubule דומות תוארו לאורגניזמים רבים ושונים ^25,26, אם כי כאמור לא נבדק בRNAs קשורים microtubule. הגישה שתוארה כאן יכולה לשמש עם כל אורגניזם שיכול לייצר תמצית מרוכזת cytoplasmic מסוגלת nucleating microtubules.

לבסוף, למרות שהגישה שאנו דהסופר דן כאן טיהור microtubules וחלבוני RNAs נלווים, גישה זו יכולה להיות מוכללת למבני subcellular אחרים. בעוד mRNAs המקומיות ביותר לא זוהתה באמצעות שיטות ביוכימיות את ההתקדמות בטכנולוגיות ה-DNA ורצף RNA להפוך גישה זו שיטה אטרקטיבית לזהות RNAs מקומי. בגישה זו כל מבנה subcellular או תת עובר של עניין יכול להיות מבודד או מטוהרים. ואז את החלבונים RNAs הנלווים יכולים להיות מזוהים בקנה מידה רחב הגנום. לאחר מכן ניתן להשוות RNAs לתוכן RNA של התא המוחלט או העובר לזהות RNAs מקומי מועשר. גישה זו יכולה להיות בשימוש עם ביצים שלמות (של בעלי חיים וצמחי הפרדה, בדומה לגישה שזיהתה את RNAs המקומיים הראשון בXenopus ^27), RNAs קשורים אקטין, RNAs ER-RNAs נלווים, הקשורים למיטוכונדריה, או לכל מבנה שיכול subcellular להיות מטוהר עם RNAs הנלווים ללא פגע. בהתבסס עלהעבודה שלנו על microtubule הקשורים RNA אנו צופים שזו תהיה שיטה מצוינת לגלות חלבונים חדשים שפועלים במיקום נתון. יתר על כן, זיהוי של המיקום וההיקף של כל RNAs המקומיים יספק תובנה כיצד תאים ועוברים להשתמש בלוקליזציה mRNA לשלוט על ביטוי גנים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Xenopus tropicalis	NASCO	LM00823MX
human Chorionic Gonadotropin	Sigma-Aldrich	CG10
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
CaCl2	Sigma-Aldrich	C8106
sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Leupeptin	Sigma-Aldrich	L9783
Pepstatin	Sigma-Aldrich	P5318
Chymostatin	Sigma-Aldrich	C7268
Cytochalasin D	Sigma-Aldrich	C8273
Gelatin, porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757
Taxol	Sigma-Aldrich	T7191
Nocodazole	Sigma-Aldrich	M1404
Trizol	Invitrogen	15596-026
L-Cysteine, free base	USB Corporation	14030
Cichlid Lake Salt	Seachem	47894
Marine salt	Seachem	SC7111
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014
EQUIPMENT
1 ml syringes	BD Biosciences	309659
18 gauge needles	BD Biosciences	305195
30 gauge needles	BD Biosciences	305106
Rubbermaid Plastic bucket	Amazon	6306
Beckman Polyallomer 2 x ½ inch Ultracentrifuge tubes	Beckman	326819
15 ml round-bottomed glass centrifuge tubes	Fisher Scientific	45500-15
Rubber adapter sleeves for 15 ml tubes	Kimble-Chase	45550-15
5 ¾ inch glass Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20A
14 ml polypropylene round-bottom tube	BD Biosciences	352059
Sorvall HB-6 rotor	Thermo Scientific	11860
Sorvall RC-6 centrifuge	Thermo Scientific	46910