הדמיה של multimodality 4D<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; זיהומים בעכברים

Summary

הדמיה רבת שיטה היא גישה יקרת ערך לחקר התישבות חיידקים במודלים של בעלי חיים קטנים. פרוטוקול זה מתאר זיהום של עכברים עם bioluminescent Citrobacter rodentium והניטור האורך של התישבות חיידקים באמצעות טומוגרפיה ההדמיה האור המפוזרת 3D המורכבת עם μCT הדמיה כדי ליצור סרט 4D של ג rodentium זיהום.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הנדרשים כדי לפקח על זיהום חיידקי bioluminescent באמצעות טומוגרפיה מרוכבים 3D המפוזרת אור הדמיה עם μCT המשולב (DLIT-μCT) ולאחר מכן של שימוש בנתונים אלה כדי ליצור ארבעה סרט (4D) ממדי של מחזור זיהום longitudinally. כדי לפתח את סרטי 4D זיהום וכדי לאמת את ההדמיה DLIT-μCT ללימודי זיהום חיידקים באמצעות IVIS ספקטרום CT, השתמשנו בזיהום עם bioluminescent ג rodentium, הגורם לדלקת המעי הגס הגבלה עצמית בעכברים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הזיהום של עכברים עם bioluminescent ג rodentium וניטור בלתי פולשני של התישבות על ידי הדמיה DLIT-μCT יומית וספירת חיידקים מצואה במשך 8 ימים.

השימוש בספקטרום IVIS CT ​​מאפשר שיתוף רישום חלק של סריקות אופטיות וμCT באמצעות פלטפורמת הדמיה בודדת. שיטת μCT המינון הנמוכה מאפשרת הדמיה של עכבריםבמספר רב של נקודות זמן במהלך זיהום, מתן לוקליזציה האנטומי מפורטת של מוקדי חיידקי bioluminescent ב3D מבלי לגרום לחפצים מהקרינה המצטברת. חשוב מכך, את סרטי 4D של עכברים נגועים לספק כלי אנליטי חזק כדי לפקח על דינמיקת קולוניזציה חיידקית in vivo.

Introduction

מודלים של בעלי חיים קטנים, באותם עכברי ניצול מסוימים, משמשים באופן שגרתי כדי לחקור פתוגנזה חיידקים או לבחון אסטרטגיות התערבות לטיפול בדלקות, כגון אנטיביוטיקה, פרוביוטיקה, Prebiotics וחיסונים ^1-7. את readouts הניסיוני העיקרי מזיהומים בבעלי החיים קטנים הם עומס הפתוגן, לוקליזציה מרחב ובזמן של הזיהום, ושינויים בתגובה החיסונית של האורגניזם הנגוע. בהדמיה אופטית vivo הוא כלי רב ערך למחקר מחלות מדבקות והוא יכול לשמש כדי לפקח על מספר רב של readouts ניסוי באמצעות השימוש בגני הכתב (חלבוני לוציפראז, ניאון, בטא lactamase, וכו '), צבעי ניאון, חלקיקים או בדיקות chemiluminescent ממוקדות לחלבון, תהליך ביולוגי, או מיקרואורגניזם ^6.

הדמיה פליטת אור (BLI) היא שיטת הדמיה אופטית המשמשת לניטור קולוניזציה של בעלי חיים קטנים, כגון עכברים וחולדות, על ידי bacte פתוגנייםRIA ^3,6,8,9. עכברים נגועים בחיידקים רקומביננטי המבטאים לוציפראז, כגון לוקס CDABE אופרון מluminescens Photorhabdus. לאחר מכן ניתן לאתר חיידקים אלה דרך הייצור שלהם באמצעות אור CCD מבוסס in vivo הדמיה מערכת ^3,6,9. חשוב לציין, רק מיקרו אורגניזמים הפעילים מטבולית הם bioluminescent (BL), כלומר רק תאים חיידקיים קיימא מזוהים על ידי מתודולוגיה זו ^10,11. שימוש 2D BLI, את מיקומו של מקור BL הוא להסיק את פני השטח של בעלי החיים שבו האות נפלט ^8. הלוקליזציה האנטומי המדויקת של מוקדי BL in vivo צריכה להיקבע באמצעות ניתוח vivo לשעבר של איברים ^3,6,9 לעומת זאת, מורכבת 3D מפוזר אור ההדמיה טומוגרפיה (DLIT) יכולה לשמש כדי לקמפל שחזור 3D כמותית של BL מקור ^12. DLIT מבוצע על ידי איסוף תמונות שצולמו באמצעות מסנני BL להקה עוברות אופטיים צרים ומוגדריםלאחר מכן מזין אותם לתוך 3D אלגוריתם שיקום טומוגרפיה אופטי מפוזר ^1,7,12,13.

נכון לעכשיו, הדמיה רבת שיטה היא השיטה היחידה העומדת למקבלת לוקליזציה האנטומי לא פולשנית אמיתית של bioluminescent מוקדי in vivo ללא צורך בניתוח vivo לשעבר. לאחרונה, השתמשנו בשילוב של DLIT שיתוף רשום עם μCT הדמיה כדי להעריך Citrobacter rodentium (ג rodentium) דינמיקת קולוניזציה בעקבות טיפול מניעתי עם חיידק הפרוביוטי ^7. ג rodentium הוא פתוגן enteric ספציפי עכברי משמש להדבקת בני אדם עם מודל enteropathogenic וenterhemorrhagic חיידקי Escherichia ^14. ג זיהום rodentium גורם דלקת המעי הגס, קשורות בדרך כלל עם הפסד מתון במשקל, שלשולים, תגובה חיסונית מקוטבת Th1 ושינויים פתולוגיים שונים, כוללים היפרפלזיה קריפטה הגס והצמדה והתבטלות הנגע formatiב ^-14. בנוסף לכך, ג פתוגנזה rodentium נחקרה ביסודיות באמצעות BLI ואת הדינמיקה שלה קולוניזציה בעכברי C57BL/6J מתועדת היטב, מה שהופך את החיידק זה מיקרואורגניזם מודל אידיאלי לשימוש עם רב שיטת הדמיה ^3,4,7.

פרוטוקול זה הוא ראשון שמתאר מתודולוגיה להדמית DLIT-μCT המשולבת של זיהום חיידקים באמצעות פלטפורמה אחת multimodality הדמיה, IVIS ספקטרום ה-CT, והדור של סרט 4D מראה את הדינמיקה האמיתית של זיהום זה הלא פולשני.

Protocol

1. הכנת עכברים

1. לרכוש או להתרבות מספיק 18-20 עכברי C57BL/6J g הנדרשים למחקר.
2. אם עכברים נרכשים מספק חיצוני, בהמשך ההובלה למתקן, להרגיל עכברים למשך שבוע 1 על מזון ומים autoclaved לייצב את החיידקים במעיים.
3. לשקול, אוזן מעולה, ולהפריד את המספר הנדרש של עכברים בכל כלוב.
4. היום לפני ההדבקה, לפני ביצוע כל הרדמה, בדוק שיש מספיק חמצן וisoflurane למשך ההליך. במידת צורך, להוסיף יותר isofluorane או להחליף את גליל החמצן. לאחר מכן, בדוק את משקלם של אוכלי נבלות ההרדמה, אם הם צברו יותר מ 50 גרם מאז השימוש הראשון שלהם, להשליך אותם ולהחליף עם אוכלי נבלות טריות.
5. עכברים לאלחש באמצעות 3% isofluorane בXGI-8 מערכת אלחוש ולהשיר השער באמצעות Veet ל7 דקות.
6. הערות:
   • אפילציה יסודית היא חיונית, במיוחד בעכברים שחורים כמו מלנין בפרווה פוחתים אות bioluminescent ^3,15 באופן משמעותי.
   • אפילציה של עכברים נמשכת בדרך כלל 8-10 ימים לפני הפרווה מתחילה לצמוח מחדש. כדי לבצע הדמיה multimodality 4D על פני תקופות ארוכות, להשיר שער עכברים בעת צורך, כך שהשטח של עניין הוא עירום לפגישות ההדמיה.
   • עכברים הם שוכנו ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2) מתקן בלימה.

2. הכנת תא חיידק

1. הכן מספיק לוריא Burtani מרק וצלחות אגר השלים עם Kanamycin [50 מיקרוגרם מ"ל ^-1] דרושים למחקר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד צורך.
2. היום לפני הזיהום להפשיר cryovial של ג rodentium זן ICC180 ומייד להוסיף cryobead עד 15 מיליליטר מרק LB אחד בתוספת Kanamycin [50 מיקרוגרם מיליליטר ^-1] ותרבות הלילה ב 220 סל"ד, 37 ° C. כביקורת לזיהום בינוני, להכין נוסףuninoculated מרק LB 15 מ"ל בתוספת Kanamycin [50 מיקרוגרם מיליליטר ^-1] והתרבות בסל"ד 220, 37 ° C.
3. למחרת בבוקר (~ 16 שעות), לבדוק את השלט הבינוני לעכירות כסימן להתפתחות חיידקים. אם השליטה היא ברורה, להעביר את תרבות ICC180 לצינור פלקון ו צנטריפוגות ב -4,000 סל"ד. לאחר מכן, לשטוף את הכדור בחיידקי PBS. אז resuspend ב1.5 מ"ל PBS (1/10 של ^ה הנפח המקורי של LB בתוספת Kanamycin) ומערבבים היטב כדי ליצור הבידוד החיידקים.
4. כדי לוודא שICC180 כבר תרבית כראוי והוא bioluminescent לפני ההדבקה של העכברים, תמונת הבידוד בIVIS הספקטרום באמצעות CT BLI וההגדרה האוטומטית באשף 4.3.1 תמונת החיים כפי שתואר לעיל ^1.
   הערה:
   • זן ICC180 הוא נגזר של bioluminescent הפראי הסוג C. rodentium ICC169 ^2. יש זן חיידקים זה לוקס CDABE אופרון כולל Kגן התנגדות anamycin מוכנס לתוך פסוידו של xylE בכרומוזום ^2.
   • לבצע את כל culturing החיידקים תוך שימוש בטכניקות אספטיים סטנדרטיות ואם נדרש גם לרכוש מוצרי צריכה / ריאגנטים סטריליים או חיטוי לפני שימוש.
   • בשלב 2.4, קריאת פליטת אור (P / S / ² ס"מ / SR) ניתן להשתמש כדי להעריך את מספרי חיידקים לפני הזיהום של עכברים.

3. זיהום של עכברים עם Bioluminescent ג rodentium והערכה של ההתיישבות חיידקים

1. לפני ההדבקה, בדוק שיש מספיק חמצן וisoflurane למשך ההליך. במידת צורך, להוסיף יותר isofluorane או להחליף את גליל החמצן. לאחר מכן, בדוק את משקלם של אוכלי נבלות ההרדמה, אם הם צברו יותר מ 50 גרם מאז השימוש הראשון שלהם, להשליך אותם ולהחליף עם אוכלי נבלות טריות.
2. עכברים לאלחש עם 3% isofluorane באמצעות-8 XGI Anaestheמערכת SIA לספק איפוק אנושי.
3. מערבבים את הבידוד החיידקים באופן יסודי ולצייר 0.2 מ"ל (כ 5 X 10 ⁹ CFU ICC180) לתוך המזרק.
4. הסר עכברים מהרדמת מערכת אחת בכל פעם ועורפם על ידי אחיזה בעור מאחורי הצוואר בחוזקה באגודל והאצבע שלך.
5. לדחוף את מחט gavage כיוון הגג של הפה, על הלשון, ובמורד הוושט ולהזריק את הבידוד החיידקים לתוך הבטן.
6. בעקבות gavage האוראלי של העכברים, לפקח על ההליכה ונשימתם לסימני מצוקה שיכול להיות סימן לכך שבידוד החיידקים נמסר לריאות. להרדים את כל עכברים, כי כבר מחוסן לריאות.
7. עכברים נגועים gavage עם 200 PBS μl כמו שליטה ברכב, כפי שמתוארים בצעדים 3.1-3.6.
8. כדי לאשר שgavage האוראלי בוצע בצורה נכונה, עכברים נגועים נגועים ומדומים בתמונות IVIS הספקטרום באמצעות CT BLI וההגדרה האוטומטית בחייםאשף 4.3.1 תמונה כפי שתואר לעיל ^1.
9. לקבוע את המספרים של חיידקי קיימא בבידוד על ידי דילול סדרתי בPBS ותצפית בשלושה עותקים על גבי אגר LB בתוספת Kanamycin [50 מיקרוגרם מ"ל ^-1].
10. לחשב את מספר ICC180 CFU / מ"ל ​​על ידי מציאת דילול שבו יש כ 5-50 מושבות ולספור את מספר מושבות מכל נקודה בדילול ושלהקליט את הדילול שהמושבות נספרו על. כתוצאה מכך, לחשב את המספר הממוצע של CFU (משלוש הנקודות) ולהכפיל ערך זה על ידי הגורם לדילול 50 (כל נקודה היא 20 μl של מדגם מיליליטר 1 המקורי) ודילול המושבות נספרו על, נותנת CFU / מ"ל.
11. לפקח קולוניזציה של העכברים היומיים על ידי איסוף צואה מכל עכבר ל- שקל מראש Eppendorf צינור (שקל על איזון עדין) ולדלל 1/10 ב PBS המבוסס על המשקל של המדגם (0.1 גרם מ"ל ^-1).
12. לקבוע את המספרים של חיידקי קיימא בהצואה על ידי דילול סדרתי בPBS ותצפית בשלושה עותקים על גבי אגר LB בתוספת Kanamycin [50 מיקרוגרם מ"ל ^-1].
13. לחשב את מספר חיידקי קיימא לגרם של צואה על ידי ביצוע צעד 3.9, ואז להכפיל את מספר CFU / מ"ל על ידי גורם צואת הדילול ב PBS (שלב 3.10) של 0.1 גרם מ"ל ^-1 לתת CFU / g.
14. כדי לקבוע שעכברים מחוסן עם ICC180 תרבות וטהורה שכל המושבות הם bioluminescent. קח את הצלחות אגר משלב 3.8, להעריך את מורפולוגיה המושבה החיידקים או על ידי עין או פיק מושבה נציג מהצלחת ולנתח על ידי מיקרוסקופ אור. במידת צורך, ניתן לבצע זיהוי חיידקים על ידי זן מסוימת המושבה PCR להעריך טוהר התרבות. כתוצאה מכך, תמונת הצלחות בIVIS הספקטרום באמצעות CT BLI כמתואר בשלב 3.7 ולבדוק כי 100% מהמושבות על הצלחת הם bioluminescent.
    הערות:
    • בשלב 3.4, כאשר החדרת מחט gavage, אם אתה חש בהתנגדות לא מכריחה את מחט gavage, כמו זה גורם לבידוד להיכנס לריאות. במקום זאת, להכניס מחדש את המחט ונסה שוב בעדינות.
    • שלב 3.1 הוא אופציונלי ועכברים יכולים להיות פה gavaged ללא הרדמה בהתאם למדיניות רווחת בעלי החיים המכונים.
    • שרפרפים חייבים להיות מצופה מהיום שהם נאספים. ג rodentium יגדל גם אם עזב ב 4 ° C למשך הלילה בPBS ויגרום לכימות של הצואה CFU / g להיות שגוי.

4. טומוגרפיה יומית Composite 3D מפוזר אור הדמיה עם μCT הדמיה (DLIT-μCT) של עכברים נגועים

שיקולי רווחת בעלי חיים: DLIT-μCT כרוך הדמיה אופטית DLIT משולבת עם מהירות, נמוכה הקרנות במינון μCT סריקה (~ 23 mGY לסריקה דו עכבר, ~ 53 mGY לסריקת עכבר אחת) של בעל חיים משותקים. מינון זה מצטבר עם כל פגישת הדמיה, ולכן המטרה היא לשמור על המינון כמו low ככל האפשר (ותמיד הרבה מתחת לLD _50/30) ועדיין להשיג את המחקר. במקרים מסוימים, אם אין סימן לזיהום בסריקת BLI קונבנציונלי של עכברים, ניתן להימנע מסריקת μCT כדי למזער את המנה נוספת. למרות שהמינון נשמר נמוך ככל האפשר, במחקרים ממושכים אם יש חשש לחשיפה לקרינה, עכברים יהיו נבחרים עם הסימן הראשון של תסמינים מזיקים או בסוף תקופת ההדמיה μCT.

1. לפני ההדמיה, לאתחל את IVIS ספקטרום CT ולבדוק שמשתלבת בטיחות רנטגן עובדים וכי השלב המחומם הוא בטמפרטורה הנכונה (37 מעלות צלזיוס) להדמיה. לאחר מכן, בדוק את רמת isoflourane במערכת ההרדמה והמשקל של אוכלי נבלות ההרדמה. במידת צורך, להוסיף יותר isofluorane ואם את אוכלי הנבלות צברו יותר מ 50 גרם מאז השימוש הראשון שלהם, להשליך אותם ולהחליף עם אוכלי נבלות טריות.
2. להגדיר את הספקטרום CT, כך שפרמטרי ההדמיה שלהפעיל את תכונת החשיפה האוטומטית ב4.3.1 תמונת חיים מותאמים ללוציפראז חיידקי הדמיה. בחר Edit> Preferences> רכישה וחלון חשיפה אוטומטית. לאחר מכן, בחר> ערכים בטווח> Exp. זמן (שניות) ולהגדיר את מקס>. ל300s. לבסוף, בחר> יעד רוזן (מינימום)> פלורסנט ומוגדר 10,000 סעיפים.
3. הכנס את פלטפורמת ההדמיה עכבר אחד לCT הספקטרום ואנך אותו להרדמה.
4. הפעל את קרן ה-X הבטיחות משתלבים ולאתחל את IVIS.
5. ברגע שIVIS הספקטרום CT אותחל, להרדים את העכברים עם isofluorane 3% באמצעות מערכת אלחוש XGI-8 כדי לספק איפוק אנושי.
6. כדי לקבוע אם זה הכרחי כדי לבצע סריקה DLIT-μCT, מראש תמונת העכברים באמצעות BLI כפי שתוארו לעיל ^1, בפלטפורמת ההדמיה עכבר אחת. אם אות חזק מתקבל בעכבר מתאים להדמית DLIT. השאר את העכבר הרדים בעכבר אחד ההדמיה platforמ 'לאחר סריקת BLI מוכן לDLIT-μCT.
7. השתמש באשף ההדמיה בחי תוכנת 4.3.1 להגדרת סריקת DLIT-μCT תמונה. ההדמיה האשף קובע FOV, זמן חשיפה, צמצם וbinning לDLIT וFOV, זמן חשיפה, מערכות סינון וbinning להדמית μCT לתת את האות הטוב ביותר יחס רעש באופן אוטומטי. כאשר תתבקשו על ידי אשף ההדמיה, כולל רק 560, 580, 600, 620 ומסנני פליטת ננומטר ובחר סריקת μCT עכבר אחת. לאחר מכן לחץ על> רוכש להתחיל הדמיה.
8. להחזיר את העכבר הרדים לכלוב שלה אחרי הדמיה, הסר את פלטפורמת ההדמיה עכבר אחד מCT הספקטרום ולחטא באמצעות Tri-גן 1%. במידת צורך, החלף את משטח הקצף שהעכבר ממוקם על כדי למזער את הסיכון של זיהום צולב בין עכברים.
9. עכברי תמונה יומי עד לזיהום לאחר יום 8 (PI) באמצעות DLIT-μCT, כמתואר בשלבים 4.1-4.8, כדי ליצור את נתוני ההדמיה האורך הנדרשים כדי להפוך את מו 4Dvie של זיהום.
   הערה:
   • בשלב 4.7, אנו ממליצים על השימוש במסנני פליטת 560-620 ננומטר לפליטת אור חיידקי תמונה. למרות שהשיא של פליטת אור חיידקים הוא סביב 485 ננומטר, בשל אופטיקה רקמות (הנחתה המשמעותית של פוטונים כחולים / ירוק על ידי רקמה עכברית), חשוב להשתמש בפוטונים הכתומים / אדומים ל3D שחזורים כפי שהם להקל על חישוב עומק אות .
   • את הגדרות החשיפה 'אוטו' ב4.3.1 תמונת חיים לDLIT צריכים להיות מותאמות כדי לייעל את כמות הפוטונים שנתפסו וזמן המרבי ההדמיה המשמש עבור כל ערכת מסנן.
   • זה הכרחי רק כדי לבצע את BLI מראש ההדמיה מתוארת בשלב 4.6, כאשר החוקר הוא לא בטוח אם יש אות bioluminescent זיהוי, למשל בעת שימוש במודל זיהום חדש.

5. שחזור 3D של נתוני ההדמיה DLIT-μCT

1. 4.3.1 פתוח חיים תמונת תוכנה ובחר>, עיון ופתח את התיקייה המכילה את קבצי DLIT-μCT.
2. פתח את קובץ DLIT-μCT בדפדפן תמונת החיים, למשל ג יום צרכן rodentium 1 על ידי לחיצה על עומס.
3. בלוח כלי בחירה> טופוגרפיה משטח> עכבר עירום, להתאים את הסף, ולאחר מכן לחץ על> יצירת משטח. אם פני השטח הוא השיקום מוצלח מתאר משטח יוצג בחלון תצוגת 3D.
4. לצפייה בסריקת μCT שניתנו בחלון תצוגת 3D, להסתיר את פני השטח מתאר (לחץ> כלים אופטיים 3D וביטול בחירה> אובייקט משטח תצוגה), או להקטין את שטח אטימות (לחץ> כלים אופטיים 3D ולהתאים את המחוון האטימות>).
5. כדי לספק לוקליזציה האנטומי מפורטת של שיקום DLIT 3D יש צורך לשנות את נתוני נפח 3D (μCT סריקה), כך שרק השלד של העכבר הוא גלוי לעין ושיש לו הניגוד האופטימלי. לחץ על כלים> multimodality 3D לבין היסטוגרמה בחר> לוגריתמי, Gתאורת radient, איכות וDenoise. לבסוף, להתאים את מחוון היסטוגרמה לימין ולצפות בשינוי לעומת נתוני נפח 3D. שמור על התאמת הנתונים עד רק את העצמות גלויות לעין. אם תרצה, לשנות את הצבע לנקודתי פונקצית ההעברה ביסטוגרמה.
6. בחר> שיקום הבא DLIT 3D בלוח הכלי ולוודא שרק 560, 580, 600, 620 ננומטר ושל מסננים, אשר נדרשים ללוציפראז חיידקי ההדמיה in vivo, שנבחרו. לחץ> התחל. תפריט חלון התצוגה המקדימה נתונים יופיע כעת מראה את אותות BL המסוננים ספקטרלית מהעכבר שהיה צילמו ב2D. אותות אלה thresholded באופן אוטומטי על ידי התוכנה, אבל יכול להיות מותאם באופן ידני אם יש צורך בשימוש בכרטיסיות בחלק התחתון של התפריט. הסף קובע את עוצמת נתוני המינימום (מיוצג כאחוז מהאות המרבית בתמונה) שייכלל כנתונים בשיקום.
7. הבא> Dשיקום LIT 3D בלוח הכלי ולבדוק שאת התכונות האופטיות המשמשות לשיקום DLIT נכונות. בחר> כרטיסיית מאפיינים ולוודא שההגדרות עבור מאפייני רקמות מוגדרת לרקמת עכבר, ספקטרום מקור מוגדר לחיידקים.
8. לחץ> בנייה מחדש כדי לבצע את שחזור DLIT.
9. כדי ליצור לחץ על סרט 3D DLIT-μCT> כלים> 3D אנימציה ובחר> אנימציות מוגדרות מראש> CCW ציר Y ו> סה"כ משך> 10 שניות (25 פריימים לשנייה). ברגע שאת ההגדרות לאנימצית 3D הם נכון עיתונות> שיא ולשמור את 3D שחזורי DLIT-μCT כ. קבצים AVI שכותרתו עם ניסוי, קבוצה ונקודת זמן מסוים בתיקייה נפרדת.
   הערה:
   • חשוב בעת ביצוע שחזורי 3D של נתונים DLIT-μCT להשתמש במחשב עם 4.3.1 תמונת חיים ואת חבילת שירות 1 המותקנת ושיש לו מחשב כרטיס גרפי מתאים להפעלת תוכנת ההדמיה שיטת Multi-. ההוא ניתן להורדת תוכנה, ומפרטי GPU כלולים בהערות השחרור (http://www.caliperls.com/support/software-downloads.htm).
   • אם 3D שחזורי DLIT-μCT מופיעים לאחור לאחר שהציל, המחשב שלך פועל גרסה של מנהל ההתקן הגרפי שלה ישנה וניתן לתקן זאת על ידי הורדת עדכון מאתר האינטרנט של היצרנים.
   • בשלב 5, אנו מציגים ההגדרות המועדפות שלנו ליצירת שחזורי DLIT-μCT 3D. עם זאת, יש מספר רב של נקודות במהלך שחזורי 3D שבו ניתן לשנות פרמטרים שלא נדונים בפרוטוקול זה. למדריך מקיף ל3D שחזורים באמצעות 4.3.1 תמונת חיים אנא עיין בהוראות הפעלה של היצרנים.
   • חשוב ליצור את 3D שחזורים באמצעות הגדרות זהות בכלי הדמיה רבת שיטה, כך שהם דומים. נוסף עלזאת, בעת יצירת את 3D שחזורי DLIT-μCT, זה חשוב כדי להפוך את קטעי וידאו באמצעות אותו המספר של מסגרות למשך שני וכולל (אורך), אחרת התזמון של וידאו 4D אינו הומוגני.

6. דור של סרט 4D של ג זיהום rodentium

1. בבירור לתייג את כל שחזורי 3D DLIT-μCT עם הניסוי הנכון, נקודת זמן וקבוצה בתיקייה נגישה.
2. צור קובץ חדש ביוצר סרטים של Windows Live ולהכניס את שחזורי DLIT-μCT בסדר כרונולוגית מיום 1 PI באמצעות כרטיסיית הכלים מהתיקייה מוכנה בשלב 6.1.
3. להוסיף כיתובים לתחילתו של כל סרטון המתאר את נקודת הזמן, למשל יום PI 1 על ידי בחירת וידאו DLIT-μCT המתאים ולאחר מכן בחירה בדף הבית> הוסף כיתוב. תיבת טקסט מופיעה על המסך, שבו הוא הוסיף את האגדה המתאימה. התאם את גודל גופן, סגנון, צבע, והצידוק כdesired באמצעות כרטיסיות זהות ל-Microsoft Word בסרגל הכלים של התוכנה. לבסוף, להעביר את הכיתוב לפינה השמאלית העליונה של וידאו.
4. חזור על שלב 7.3 לכל קטעי הווידאו DLIT-μCT.
5. הוסף עמוד שער, למשל ג ימי rodentium זיהום 1-8 על ידי לחיצה על דף הבית> כותרת. תיבת טקסט מופיעה על המסך שבו הכותרת המתאימה תתווסף לשקופית ריקה. התאם את גודל גופן, סגנון, צבע והצדקה המועדפים באמצעות כרטיסיות זהות ל-Microsoft Word בסרגל הכלים של התוכנה.
6. לשמור את הפרויקט כפרויקט יוצר סרטים * MMP בתיקייה מתאימה עם הכותרת של הסרט. צעד זה הוא חיוני אם אתה רוצה לשנות את הסרט.
7. שמור את הסרט כקובץ. WMV. לחץ על תפריט יוצרים סרטים> Save> סרט למחשב.
8. להמיר את הקובץ יוצר סרטים באמצעות ממיר קבצים ל. avi או סוג אחר מתאים קובץ תואם למחשב שלך.
   הערות:
   • מומלץ כי את סרטי 4Dנוצרים על מחשב עם Windows Live Movie Maker המותקן (http://windows.microsoft.com/en-GB/windows7/products/features/movie-maker) ותכנית מולטימדיה טובה מסוגלת לנגן. WMV או. סוגי קבצי AVI.

תוצאות

זיהום של עכברי C57BL/6J עם 5 X 10 ⁹ CFU ג rodentium הוא מודל זיהום חיידקים מתואר היטב ותוצאות בזיהום במערכת העיכול הגבלה עצמית שיאים בין ימי הודעה זיהום 6-8 ונמשך בין 3 עד 4 שבועות ^2,14. הזיהום מוגבל ללומן מעי על ידי מערכת החיסון העכברית וכתוצאה מכך, חיידקים הם לשפוך ללא הרף בצואה. קולוניזציה של עכברים על ידי ג ניתן לנטר rodentium הלא פולשני על ידי ספירת חיידקים ישירה מצואה, או הדמיה פליטת אור ^2,3.

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מותאם לביצוע 3D ו 4D multimodality הדמיה של ג rodentium בתוך עכברים כדי לפקח על עומס חיידקים ולוקליזציה בזיהום. התוצאות המוצגות באיור 1 מדגימות את הבקרות הנדרשות להדמית 4D מוצלחת. לפני הזיהום של עכברים זה חיוני כדי להרתיעשלי שהבידוד הוא החיידקים המשמשים bioluminescent (איור 1 א) וכי בעקבות gavage האוראלי של עכבר עם bioluminescent ג rodentium, כי האות ניתן לצפות בקיבתו של בעל החיים ולא לריאות (איור 1) ^16.

בנוסף לניטור קולוניזציה חיידקים באמצעות הדמיה פליטת אור, זה תרגול טוב כדי לכמת מספרי חיידקים בצואה; המשמש כמדידה עקיפה של קולוניזציה חיידקית של רירית מערכת העיכול איור 2 מדגים את עומס החיידקים הטיפוסי בצואה שנלקח מ8 C57BL6 / ג'יי. עכברים שנדבקו ~ 5 X 10 ⁹ CFU ICC180 ומעקב במשך 8 ימי עליות התישבות לצרכן מיום 2 לצרכן עד יום שבו 6-7 פסגות הזיהום ב~ 5 X 10 ¹⁰ CFU / g, אשר עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים ^2,3,17.

כדי להדגיש את החשיבות של מסגרת הערכהטינג התפשטות הזיהום בעכבר אחת, האיורים 1B ו -3, כמו גם וידאו 1 כבר נוצרת מאותו העכבר בעקבות ג זיהום rodentium, כפי שתואר לעיל. דיילי DLIT-μCT שימש כדי להעריך את ההתפלגות המרחבית של חיידקי bioluminescent בתוך העכבר הזה, תוך שימוש בשלד כהתייחסות אנטומי. איור 3 מדגים את שיקום DLIT-μCT של עכבר C57BL/6J נגוע ICC180 ב3 PI נקודות מפתח בזמן ניתן לראות 3 PI קטן bioluminescent מוקדי יום במעי הגס, אשר יציגו גידול מתון בעוצמת פליטת אור על ידי 5 PI היום עם שינוי קטן בהתפלגות המרחבית. ביום 7 PI אנו נצפו עלייה משמעותית בפליטת אור והתפשטות bioluminescent מוקדים על פני המעי הגס כולו.

וידאו 1 הוא אוסף של שחזורי DLIT-μCT 3D מימים 1-8 פיי ICC180 וממחיש גrodentium בתוך מערכת העיכול הפרוקסימלית בין 1-2 ימים PI אשר מתפשטת למעי הגס ביום 3 PI מימים 4-6 PI מספרי החיידקים במעי הגס להרחיב עד לשיא ב 7 יום שבו צרכן מוקדי החיידקים מכסה את כל המעי הגס. ביום 8 PI רק שני מוקדי חיידקים שונים שנמצאים במעי הגס הפרוקסימלי ודיסטלי. היכולת להציג שחזור 3D המלא בכל נקודת זמן על פי סדר כרונולוגי מייצגת כלי רב עוצמה לניתוח אינטראקציות פתוגן המארחת וקלה יותר לפרש מאשר 3D עדיין באותו בסיס הנתונים.

איור 1. הדמיה פליטת אור של 2D) Bioluminescent ג rodentium ICC180 הבידוד ו-B) בעקבות עכבר gavage האוראלי עם 200 μl של הבידוד. ראש חץ (>) ממחיש bioluminescent ג rodentium em> בבטן.

איור 2. ג דינמיקת קולוניזציה rodentium. כימות של ג המושבה rodentium להרכיב יחידות מצואה במשך 8 ימים PI

איור 3. טומוגרפיה-μCT הדמיה אור מפוזרת סריקה של bioluminescent ג זיהום rodentium מעכבר אחד במעקב ביום 3, 5 ו -7 PI ראש חץ (>) ממחיש קולוניזציה הגס. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

וידאו 1."Target =" p :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50450/LAB_MEDIA_50450_Frankel_Video1.wmv _blank "> לחץ כאן לצפייה בוידאו. סרט 4D של זיהום rodentium ג מעכבר אחד מימי מעקב 1-8 PI

Discussion

סרט 4D של זיהום חיידקים מספק כלי שימושי כדי להמחיש ולפרש כמויות גדולות של נתונים הדמיה רבת אפנות במהירות ובקלות. טכניקה זו מאפשרת ניתוח מפורט של איך זיהום מתפשט דרך עכבר בודד וניתן להשתמש בו כדי לחקור כיצד מחיקה של מארח או גנים של חיידקים או התערבות עומס חיידקים, הפצה, לוקליזציה והשפעת אסטרטגיות מסוימת במהלך מחקר אורך ^7. סרטונים אלה מספקים גם עזרי הוראה שימושיים ואמצעי להפצת מידע לציבור.

ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה שיכול להשפיע על איכות הנתונים המתקבלים מהדמית DLIT-μCT והיכולת לקמפל וידאו 4D של זיהום. החלק החשוב ביותר של פרוטוקול זה הוא הזיהום המוצלח והומוגנית של עכברים עם ג rodentium. זה חיוני כי העכברים המשמשים למחקר הם בין 18-20 גרם ושbacteinoculums ריאל מוכן טרי וכ 5 X 10 ⁹ CFU, כפי שתואר לעיל ^2,3. לפני ההדבקה של העכברים חשוב לבדוק שהבידוד הוא bioluminescent באמצעות הספקטרום CT ופעם הבידוד כבר מוכן, הוא חייב להיות הומוגני הרף לפני כל עכבר gavaged על מנת להבטיח שהעכברים יקבלו מינוני זיהומיות דומים. ההדמיה DLIT-μCT של עכברים בצורה מיטבית, כך שפונקצית החשיפה האוטומטית בתוכנת 4.3.1 תמונת חיים קובעת באופן אוטומטי את הפרמטרים ההדמיה האופטימליים עבור האות להיות הרבה מעל לרעש. עם זאת, פונקצית החשיפה האוטומטית מסתמכת על הגדרות משתמש מוגדר ופרמטרים אשר צריכים להיות שונה, כמתואר בהליך. הימנעות מלעשות זאת תגרום לעניי תמונות עם מספר נמוך של פוטונים שנאסף ושאינם נובע בהתקדמות ברורה בזיהום, כהגדרות היצרן של הספקטרום CT לautoexposure מתוכנתות לגידולי הדמיה להביעגחלילית לוציפראז. שחזורים בוצעו באמצעות 560-620 ננומטר לתת את ההסכם הטוב ביותר בין הנתונים מדומים ומדודים, ולכן הם נתונים המהימנים יותר לכלול בבנייה מחדש.

הגבלה לשימוש בDLIT-μCT היא שהקרינה מייננת מסריקת μCT גורמת לניזקי קרינה תת קטלניים שהוא מצטבר על מחקר אורך ^18. חשיפה לקרינה תת קטלנית יכולה להחליש את התגובה החיסונית, גורמת לניזק לדנ"א, ואפופטוזיס באיברים פנימיים ^19. סופו של דבר, נזק קרינה תת קטלני מצטבר יכול לגרום למוות אם LD _50/30 לקרינה מייננת חריגה, אשר בין 5 עד 7 Gy בהתאם לזן העכבר וגיל של העכברים משמש ^18,20,21. למרות שחלק מהניזקים מולקולריים מקרינה מייננת יכולים לרפא, שכן עיקרון העל הוא להעריך מינון שמרני, זה לא היווה בדרך כלל עבור בתכנון מחקר. במקום זאת, המטרה היא להישאר כמה שיותר רחוק בלow מגבלות אלה ככל האפשר ועדיין להשיג את מטרות המחקר. הדבר חשוב במיוחד במחקר זה בגלל התגובה החיסונית הנורמלית לזיהום, לתדירות של הדמיה, ואת העובדה כי מהונדס, חיסוני מורכב, או נגוע במידה רבה בעלי חיים עשויה להיות רגישה יותר לקרינה מייננת.

כאשר מתכננים ניסוי להפקת סרט 4D של זיהום, חשוב להביא בחשבון את אורכו של הניסוי, במספר μCT סורק נדרש בתקופה זו וLD _50/30 לקרינה מייננת לזן העכבר שבשימוש. מגבלה נוספת פוטנציאל DLIT-μCT היא כוח של הביטוי העיתונאי בזן החיידקים נמצאים בשימוש, כמו זה ישפיע מגבלות זיהוי חיידקים ושעות הדמיה. מומלץ מאוד שחוקרים משתמשים תוקף זני חיידקים שנמצאים באופן מלא ארסיים, אבל מותאם למקסימאלי לוקס אופרון ביטוי, כפי שהוכיח בעבר לBLI2,3.

אזהרה אחת לעיצוב הנוכחי של ההדמיה 4D היא שכל סרט מורכב מסריקות DLIT-μCT בודדות שיש להם קנה מידה פוטון שונה. זה יכול להפוך את התמונות קשה לפרש אם השינויים ללוקליזציה של מוקדי BL, או עוצמתו הם עדינים, או אם יש מוקד אחד אינטנסיבי BL מוקף במוקדים חלשים מרובים. לכן, עבור פריטים חזותיים אורכיים, חשוב לשמור על פסי הצבע עקביים בנקודתי הזמן.

הרעיון של סרט 4D של זיהום יכול להיות מיושם על כל מחולל מחלה חיידקית שכותרתו כראוי. פיתוח עתידי של טכניקה זו ישאף להשתמש דימות פלואורסצנטי טומוגרפיה (פליט), כמו גם כדי להקל על DLIT החקירה של תגובות מארחות לזיהום באמצעות שילוב של חיידקים פתוגנים bioluminescent וזריקות ניאון ליד בדיקות אינפרא אדום כדי לחקור את התגובות מארחות לזיהום. בנוסף לכך, בפרוטוקול זה אנו רקמתאר את השימוש של חיידקי bioluminescent ליצור סרטי 4D של זיהום. עם זאת, במקרים מסוימים ייתכן שיהיה צורך להשתמש בחיידקי שכותרת ניאון, למשל תויגו iRFP, כך שכתב פליטת אור יכול לשמש לחקר גנטיקה המארחת במהלך זיהום. חשוב מכך, השימוש בהדמיה רבת שיטת שילוב DLIT / פליט-μCT תאפשר לנו לחקור את הלא פולשני פרמטרים מרובים במהלך זיהום חיידקים, אשר יתרמו באופן משמעותי להפחתה, העידון, וההחלפה של השימוש בבעלי החיים במחקר מדעי כפי שמתואר ביוזמה של NC3R (http://www.nc3rs.org.uk/).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioluminescent C. rodentium	Frankel lab	ICC180	Wiles et al., 2004
Veet	Boots		Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well.
Isofluorane (100% v/v)	Abbott	B506
Medical Oxygen	BOC Medical		Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required.
Luria Bertani broth	Merck	1.10285.0500	25 g in 1L Demineralised water.
Luria Bertani agar	Merck	1.10283.0500	37 g in 1L Demineralised water.
Kanamycin sulphate	Sigma (Fluka)	60615
50 ml Polypropylene conical Falcon tubes	BD (Falcon)	352070
Universals	Corning (Gosselin)	E5633-063
1 ml syringe	BD (Plastipak)	300013
Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved	Vet Tech	DE005
Microbanks (Cryovial)	Pro-Lab Diagnostics	PL.170/Y
IVIS Spectrum CT	Caliper- a PerkinElmer Company	133577 Rev A/ Spectrum CT
6kVA UPS	Caliper- a PerkinElmer Company
XGI-8 anesthesia system	Caliper- a PerkinElmer Company	118918
XAF-8 Anaesthesia filter charcoal	Caliper- a PerkinElmer Company	118999/00
Living Image v4.3.1 SP1	Caliper- a PerkinElmer Company
Benchtop shaking incubator	New Brunswick Scientific	Innova 44