<em&gt; באוב</em&gt; CAM-assay כXenograftmodel לסרקומה

Summary

באוב Chorioallantoic קרום (רמ"א) הוא מורכב עם רקמות טריות סרקומה הנגזרות סרטניים, השעיות התא בודדות שלהם, ושורות תאי סרקומה הוקמו כותרתו fluorescently קבועות וארעיות. המודל משמש ללמוד שתל (כדאיות, Ki67 מדד התפשטות, נמק, חדירה) ומארח (חדירה פיברובלסטים, ingrowth כלי דם) התנהגות.

Abstract

סרקומה היא מחלה מאוד נדירה שהיא הטרוגנית בטבע, כל פוגעות פיתוח הטיפולים חדשים. חולי סרקומה הם מועמדים אידיאליים לרפואה אישית לאחר ריבוד, המסבירים את הריבית הנוכחית בפיתוח מודל xenotransplant לשעתק ועלות נמוכה למחלה זו. קרום chorioallantoic החומוס הוא מארח immunodeficient טבעי מסוגלים לקיים רקמות ותאים מורכבים ללא הגבלות מינים ספציפיות. בנוסף, ניתן לגשת בקלות, מניפולציות וצלם באמצעות stereomicroscopy אופטי וקרינה. היסטולוגיה נוספת מאפשרת ניתוח מפורט של אינטראקציות הסלולר heterotypic.

פרוטוקול זה מתאר בפירוט באובו השתלה של קרום chorioallantoic עם רקמות טריות סרקומה הנגזרות סרטניים, השעיות התא בודדות שלהם, וקווים קבועים וארעיים שכותרתו fluorescently הוקמו סרקומה סלולרי (Saos-2 וSW1353). עכברוש הישרדות החומוסes הוא עד 75%. המודל משמש ללמוד שתל (כדאיות, Ki67 מדד התפשטות, נמק, חדירה) ומארח (חדירה פיברובלסטים, ingrowth כלי דם) התנהגות. להשתלה מקומית של השעיות תא בודדות, ECM ג'ל מספק יתרונות משמעותיים על פני חומרי בלימה אינרטי. מדד ההתפשטות Ki67 קשור למרחק של התאים מפני שטח של CAM ואת משך הזמן של יישום ברמ"א, שהאחרון קביעת מסגרת זמן לתוספת של מוצרים טיפוליים.

Introduction

סרקומה היא גידול נדיר של רקמות החיבור עם תמותה גבוהה בשל התנגדות ^1,2 הטיפול. התקדמות בהישרדות חולה הקשתה על ידי שכיחותם הנמוכה השנתית, הגיוון הרחב שלהם, ואת העובדה שתאי סרקומה הם דיווחו להיות קשים לתרבות במבחנה ^3,4.

השימוש בתאים בתרבית להערכת טיפול קליני גילו כי מולקולות חדשות, ככל הנראה פעילה במבחנה לא תמיד משקפות את התוצאות בסביבה הקלינית. יתר על כן, סטיות הגנום מתגלים על ידי מערכי ביטוי גנים הן לא תמיד קשורות למאפייני התנהגות סרטניים בחולה בודדת ^5-7. על מנת לנסות ולפתור את הבעיות הללו, רפואה מותאמת אישית צברה בחשיבותו, אשר באה לידי ביטוי בחיפוש המוגבר לדגמי xenograft ^8-12.

ב assay vivo יש את היתרון של המשקף הגומלין המורכב בין גתאי ancer וסביבת רקמת המארח בגידולים מוצקים, הנדרשים להתפשטות הסרטן והפלישה ^13. נכון לעכשיו אנחנו לומדים את השימוש של assay ממברנה Chorio-allantoic (CAM-assay) כמודל לשחזור xenograft סרקומה ^14,15. assay זה נעשה שימוש נרחב למחקר של אנגיוגנזה גידול ^16,17. בספרות, לעומת זאת, מצאנו פרוטוקולים שונים עבור assay זה, בעוד שמחקרים אחרים שנצפו הבדל משמעותי בצמיחה או אנגיוגנזה על פי פרוטוקולים שונים ^18,19.

במאמר זה אנו לחקור את ההשפעה של משתנה תנאים של CAM-assay על התנהגות תא סרטניים, באמצעות שתלי השעיות תא בודדות שמקורם בגידול בתרביות תאי סרקומה ומבוססות.

Protocol

ראה איור 1 לסקירה

חומר גידול

1. קבלת והכנת דגימות גידול

לשימוש בחומר בחולה, האישור של ועדת האתיקה הוא הכרחי, ויש לו הסכמה מדעת שמתקבלת מהמטופל.

1. חומר קציר נציג (מינימום 1 ס"מ ³⁾ בזמן של התערבות, או ביופסיה או כריתה של סרקומה. האתר הנכון של ביופסיה מוגדר באמצעות דינאמי ניגוד MRI.
2. הנח את החומר באופן מיידי בבקבוקון המכיל סטרילי DMEM בתוספת 1,000 U פניצילין ו1 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין.
3. להעביר את הבקבוקון באופן מיידי (30-90 דקות) למעבדה.

כל הנהלים הבאים מבוצעים תחת הזרימה למינרית.

4. יוצקים את התוכן של הבקבוקון לתוך צלחת פטרי סטרילית.
5. שים מדגם הגידול לחלקים קטנים של מקסימאלי 1 מ 'מ ^'3 באמצעות אזמל סטרילי. הסר את כל החלקים המסוידים כפי שהם נוטים לפגוע בעיבוד נוסף של הרקמה.
6. באופן אקראי לקחת 10 שתלי גידול ליישום ברמ"א.

2. הכנת השעיות תא בודדות שמקורם בגידול

משך משוער: 3 שעות

1. לשקול את הרקמה הנותרת של המדגם.
2. לשים 4 - 2 גרם של רקמה בצינור Dissociator, צינור אחד או יותר עשוי להידרש לעכל את כל רקמת הגידול שנותרה.
3. לעיכול של 4 - 2 גרם של רקמה, להוסיף פתרון 2.5 מ"ל DNase (22 KU / מיליליטר RPMI 1640) פתרון 2.5 מ"ל collagenase 2 (500 U / מיליליטר RPMI 1640) ו.
4. לעבד את הרקמה פי פרוטוקול h_tumor Dissociator. זה כולל 2 מחזורים של דגירה על 37 מעלות צלזיוס בCO ₂ באינקובטור תוך הצינור הוא מזועזע בעדינות במשך 30 דקות.
5. סנן את ההשעיה הנותרים דרך מסננת תא 150 מיקרומטר.
6. צנטריפוגה lysate ב 1000 סל"ד במשך 5 ק"מn.
7. הסר את supernatant.
8. Resuspend גלולה ב 10 מ"ל של חיץ תמוגה הכדורית האדומה (ELB), המאפשר 10 דקות של דגירה עם השעיה קבועה.

הערה: מאגר תמוגה כדורית אדומה מיוצר באופן הבא: הוסף 0.037 גרם EDTA, 0.99 גר 'K ₂ HPO _4, Cl ₄ 8.29 גרם NH ל1,000 מ"ל אקווה, השתמש 10 N NaOH כדי להתאים את ה-pH ל 7.3, מסנן תחת לחץ דרך 0.22 מיקרומטר לסנן. חנות ב 4 ° C.

9. הוסף 25 מ"ל של מדיום התרבות (DMEM בתוספת 10% בסרום שור עוברי, 100 U / ml פניצילין, וסטרפטומיצין מיקרוגרם / מ"ל ​​100) כדי לעצור את התגובה.
10. צנטריפוגה ההשעיה ב 1000 סל"ד במשך 5 דקות. הצבע של גלולה צריך להיות לבן עכשיו.
11. הסר את supernatant.
12. הוסף 5 מ"ל של מדיום לגלולה. סנן את ההשעיה דרך מסננת תא 70 מיקרומטר.
13. לספור את מספר התאים / מ"ל ​​חיות באמצעות דלפק תא אוטומטי.

3. גשורות תאי ancer

SAOS2 תאי אוסטאוסרקומה (מספר ATCC: HTB-85) לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר היו electroporated ידי וקטור pEGFP-C1 באמצעות הסלולרי קו Nucleofector ערכת V על פי הפרוטוקול של היצרן. כדי לבסס את שורות תאי יציבות, תאי transfected נבחרו בG418 (1 מ"ג / מ"ל) למשך 4 שבועות בקנה אחד עם פרוטוקול קודם הוקם ^20. בנוסף מיון נעשה על ידי מיון תאים הופעל פלואורסצנטי (FACS) על פי הוראות היצרן.

תאים משורת תאי SW1353 כונדרוסרקומה (מספר ATCC: HTB-94) או השעיות תא בודדות סרטניים טרי מוכנים מסומנים באמצעות קרום lipophilic ניאון כתם אדום.

1. להסיר את התאים מבקבוק התרבות באופן קלסית באמצעות טריפסין (0.5% wt / כרך) חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA; 0.2% wt / כרך) פתרון.
2. צנטריפוגה ההשעיה התא במשך 5 דקות ב 1000 סל"ד.
3. הסר supernatant.
4. הוסף 1 מ"ל של מדיום סרום ללא ו5 DiI μl (Vybrant האדום) / 10 ⁶ תאים.
5. עטוף את הבקבוקון ברדיד אלומיניום ולשים אותו בCO ₂ באינקובטור למשך 10 דקות ב 37 ° C.
6. צנטריפוגה שוב במשך 5 דקות ב 1000 סל"ד ולהסיר את supernatant.

assay קרום Chorioallantoic

1. דגירה ביצה

1. ביצים מופרות ממדגרה מסחרית מקומית מבטיחה הפריה 95% מהביצים נדרשות.
2. ניתן לאחסן ביצים מופרות ב RT עד 10 ימים.

הערה: לפני שמתחילים דגירה, לכלוך, נוצות וצואה יוסרו בזהירות מקליפות הביצים אופן מכאני על ידי ניגוב יבש עם מגבות נייר, אשר יש מחוספסת ולא מבנה משטח רך. מנגב את הביצים עם 70% אתנול מפוגל או כל מגיב ניקוי אחר מפחית באופן משמעותי את שיעור ההישרדות של עוברי האפרוחים.

3. שים את הביצים בincubator בצד אחד, מסמן את המשטח העליון. היום שבו הם שמו את הביצים בחממה מיועד 0 יום של התפתחות עוברית.
4. הגדר את טמפרטורת ההדגרה ב 37.8 מעלות צלזיוס, ולחות על 47%. ודא שאפשרות הסיבוב האוטומטית כבויה.

2. פתיחה של הביצים

משך: ± 60 דקות במשך 25 ביצים

ביום פיתוח 3, את הביצים נפתחות תחת זרימת אוויר למינרית. פתיחה את הביצים בתוצאות שלב התפתחותי נוספות בניזק לרמ"א, כקרום נוטה להיצמד לקליפה. מנורת אינפרא אדום משמשת כדי לשמור את הביצים חמה במהלך ההליך. כדי לשפר את העקרות, אנו ממליצים על השימוש בכפפות יד.

1. מניחים את הביצה בגביע הביצה, עם הצד המסומן יפנה כלפי מעלה.
2. להוריד את הרמה של CAM על ידי הסרת שתי מ"ל של חלבון G דרך מחט 18 הוכנסה בקצה של הביצה. אם המחט היא בוטה לאחר הניקוב כמהקליפות ביצים, החליפו את המחט. אם לא, יש לו כוח רב מדי כדי להיות מופעל, וכתוצאה מכך לניזק לחלמון הביצה או שבר של הקליפה. לפעמים המחט חסומה על ידי chalazae, אחד מ2 להקות ספירלה מתלים החלמון בחלבון. זה יכול להיפתר על ידי בעדינות דוחף את הבוכנה חזרה למטה עד לגוש נפתר. אם חלמון הביצה נשאב לתוך המזרק, החלף את המחט, כמו גם את המזרק. לפעמים את העובר מת לאחר אירוע זה. אם כמות מספקת של חלבון מוסרת, CAM יהיה פגום כאשר מסירים את הקליפה.
3. החל סרט דבק semipermeable בצד העליון של הקליפה המסומן כדי למנוע שפיכה של חלקיקי קליפה על CAM תוך חיתוך החלון.
4. הפוך את חור כניסה עם מרצע קטן על פני השטח של הביצה.
5. לחתוך חלון של 1 ס"מ ² בקליפה, בעזרת זוג מספריים כירורגיות מחודדים סטריליים.
6. הלב הפועם של העובר וכלי סמוכים ניתן לצפות במשטח דואר של חלמון הביצה. הסר את הביצים שאינן מופרות או עוברים מתים. היבט קטע של כלי הדם שמאפיין את העוברים מתים.
7. לאטום את החלון עם סרט דבק semipermeable. אין זה הכרחי כדי לכסות את האתר לנקב, אלא אם כן את הקליפה נסדקה במהלך החדרת המחט.

3. נוהל חיסון

משך: ± 1 שעות בכל שורת תא

על החומוס עוברי פיתוח יום 9, את הביצים הם מחוסן תחת זרימת אוויר למינרית.

הערכה של תאים סרטניים מתפשטים ברחבי CAM דורשת בלימה של התאים למשטח מוגבל בזמן החיסון. Matrigel הוא מטריצת ג'ל (ECM) תאי מסרקומה עכבר Engelbreth-Holm-הנחיל משמשת לעתים קרובות בתנאי תרבית תאים ניסיוניים. זה נוזל כאשר התקררו, אבל יעבור פילמור הופעל תרמית כאשר הובא ל20 - 40 מעלות צלזיוס, ובכך יוצר ג'ל יציב. במהלךהניסויים, Matrigel נשמר בתיבה המכילה קרח נמס.

הערה: אנחנו מתעקשים לא להשתמש coverslips מחוררת. הבחנו קובץ מצורף וצמיחה של תאים סרטניים מורכבים על גבי דיסק הפלסטיק ובכך הטיית פוטנציאל צמיחה של התאים על הקרום עצמו.

1. Resuspend תא גלולה בג'ל ECM מקורר בריכוז של 10 ⁶ cells/100 ג'ל ECM μl. שמור פתרון זה על קרח נמס.
2. חלק בלו של הקרום החדיר למחצה עם זוג כירורגית סטרילית תחת זרימת אוויר למינרית. אם הסרט דבק נמחק לחלוטין, זה יגרום לשיעור גבוה יותר של מוות עוברי עקב זיהום.
3. גע בזכות CAM מתחת לחלון הקליפה בקלילות עם מוט זכוכית סטרילי, על מנת להסיר את שכבת תאי אפיתל. הנגיעה CAM עם מוט זכוכית סטרילית מוכיחה להיות פחות טראומטי מאשר באמצעות אזמל n ° 11, אשר דורש יותר handiness וניסיון. שטפי דם קטנים עלולים להתרחש.
4. dding חומר גידול.
5. לשתלים סרטניים: חתיכה בעדינות תחתונה של רקמה על CAM עם זוג מלקחיים סטריליות, בלי לסחוט אותו.
6. להליך ג'ל ECM: הוסף 25 μl 4x-ECM של תא ההשעיה ג'ל לרמ"א, על גב אחד את השני, מה שמאפשר את הג'ל לפלמר בECM בין היישומים. בדרך זו פלאק חסיד המכיל את התאים הסרטניים נוצר.
7. לאטום את חלון הפגז שוב עם סרט דבק semipermeable.

4. הדמיה וקציר של CAM

משך הפעילות: 2 שעות במשך 25 ביצים

על החומוס עוברי פיתוח יום 16, את המצלמות נקצרים. עבודה תחת זרימת אוויר למינרית היא לא הכרחית.

1. להגדיל את החלון עם זוג המספריים כירורגיות. הקפד שלא לחתוך נמוך מדי, אחרת CAM יהיה פגום, וכתוצאה מכך הדימום של כלי הפצועים.
2. הוסף 300-500 μl של PBS ^D עם טפטפת על כת CAMיון המכיל את החומר מחוסן. אם לא משתמשים בבדיקות ניאון, נאגר פורמלין יכול לשמש כזה הופך את הקרום נוקשה, להקל על החיתוך של הממברנה.
3. הפוך תצלום של CAM בביצה דרך מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו, מצויד במצלמה דיגיטלית בצבע, הן באמצעות GFP או מסנן DSR, ואין סינון. את השתלים לגידול, כל הצילומים נעשים ללא מסננים. הארה מלמעלה על ידי נורות LED מומלצת מאוד בזמן צילום (איור 2).
4. נדידת תאי גידול שיא לתאים שכותרתו. הגבולות של הגידולים עלולים להיות בלתי סדירים ומרופטים. תאים מפוזרים עשויים להיות נוכחים בסמוך לגבולות גידול. בחלק מהדגימות, שורות של תאים סרטניים אפשר לראות (איור 3).
5. חותכים את הקרום עם מספריים סטריליים בגבול שוכב נגד הקליפה.
6. הנח את CAM נקטף בצלחת פטרי סטרילית מלאה עם PBS ^D או שנאגרו במשךmaldehyde.
7. הפוך את תמונה של שניהם בצד העליון וצד התחתון של רמ"א, עם ובלי פילטר.
8. שים את הקרום במכל שכותרתו עם פורמלין שנאגרו במשך לפחות 72 שעות.
9. הטמע את המצלמות בפרפין ולהכין אותם לבדיקה היסטולוגית. תשמור על עצמך כדי לחתוך את השתלים הסרטניים במרכזו של הגוש הקטן, כדי לוודא ששטח החתך מקביל לחלקו התחתון של הקלטת. אם לא, את האינטראקציה בין CAM ושתל הגידול לא תהיה גלויה. אותה האסטרטגיה חלה על לוחות ג'ל ECM: פני השטח מול להב החיתוך צריך להיות בניצב ללוח.

5. ערכה היסטולוגית

מכתים hematoxylin-Eosin וקי 67 אימונוהיסטוכימיה בוצעו לבירור נוסף, במידת צורך. אימונוהיסטוכימיה בוצעה בסעיפי רקמות פרפין מוטבעים פורמלין-קבועים של 3.5 מיקרומטר בעובי, באמצעות שקופית Stainer אוטומטי על פילהוראות יצרן. נוגדן חד שבטי עיקרי עכבר כדי Ki-67 (שיבוט MIB-1, דילול 1/100) היה בשימוש. חום-Induced epitope אחזור בוצע באמצעות מיזוג 1 סלולרי, ויזואליזציה הושגה עם ערכת זיהוי DAB האוניברסלית, על פי הוראות יצרן. Dehydratation מסעיפי הרקמות בוצעה באמצעות coverslipper אוטומטי.

לSW1353 את שורות תאי SAOS2 ו, מספר תא nuclei/100 מיקרומטר ² Ki67 החיובי והשלילי Ki67 נספר בשלושה אזורים: אחד קרוב לגבול של רמ"א, אחד לסגור את פני השטח ואחד במרכז פלאק ג'ל ECM. הליך זה חזר על עצמו 6x עבור כל שקופית קי 67 מוכתמת. המדד של התפשטות נקבע עבור כל שקופית על ידי חלוקת מספר התאים Ki67 חיובי במספר הכולל של תאים נספרו.

נמק מוגדר על ידי אובדן של פיזור העדין של הכרומטין בגרעין התא, בליווי פאדיng של שולי תא נפרדים. לxenografts, נמק הוא הבקיע כמלא, חלקי (לעתים קרובות על פני השטח), או ייעדר. חדירה של תאי גידול לCAM מוגדרת על ידי התצפית של תאים סרטניים בתוך המזודרם של רמ"א, והוא הבקיע כמו להיות נוכח או ייעדר.

שלושה פריטים מקבלים נקודות על התנהגות מארחת. חדירת פיברובלסטים מוגדרת כתאים מוארכים עוזבים CAM ופולש השתל / פלאק גידול, והוא הבקיע כמו להיות נוכח או ייעדר. ingrowth כלי דם יכול להיות שנצפה כingrowth של מתרבה כלי חומוס, מאופיינים על ידי הנוכחות של אריתרוציטים חומוס nucleated.

תוצאות

הערכה של רמ"א

שתלי גידול הפכו חסיד לרמ"א (איור 2 א). השעיות תא בודדות מחומר שהמטופל להציג שלט מיובש, מוגבה מעט (איור 2 ד) לעתים קרובות. לאחר הכריתה של רמ"א, סימן קימוט של הקרום מתרחש (איורים 2E ו2F).

Discussion

זמן של חיסון וקציר

תזמון היום של חיסון בוצע באמצעות SAOS2 בECM ג'ל (36 מצלמות) ונע בין יום התפתחות העוברי 5 ו -10.

לפני הדגירה יום 9, CAM לא באופן עקבי היה גדול מספיק כדי לתמוך ג'ל ECM אנחנו מוחלים. בקציר, ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Line Nucleofector Kit V	Amaxa	VCA-1003
collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640)	Sigma Aldrich	C6885
DMEM	Invitrogen	41965-039
DMSO	Sigma	D8418
Dnase solution	Sigma Aldrich	DN25
G418	Invitrogen	11811031
Matrigel	Sigma-Aldrich	E1270
mouse primary monoclonal antibody Ki67	Dako Denmark	MIB-1
Paraformaldehyde	Fluka	D76240
PBS	Invitrogen	20012019
PBSD	Invitrogen	14040083
peGFP-C1 vector	Clontech	632470
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	15140163
RPMI	Invitrogen	22409-015
Trypsin-EDTA solution	Invitrogen	25300054
Vybrant cell-labeling DiI	Lifetechnologies	22885
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10227
digital color camera	Leica	DFC 340 FX
Digital Egg Incubator	Auto Elex Co	R-COM 50
FACS	BD Biosciences	FACSAriaIII
Gentlemacs C-Tube	Miltenyi Biotech	130-093-237
Gentlemacs Dissociator	Miltenyi Biotech	130-093-235
Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol	Miltenyi Biotech
[header]
semipermeable adhesive film (Suprasorb F)	Lohmann&Rauscher	20468
stereo fluorescence microscope	Leica	M205 FA
Tissue-Tek Film automated Coverslipper	Sakura	6400
ultraView Universal DAB Detection Kit	Ventana Medical Systems Inc	760-500
Ventana Automated Slide Stainer	Ventana Medical Systems	Benchmark XT