<em&gt; Ovo</emSarkoma için bir Xenograftmodel olarak&gt; CAM-testi

Özet

Ovo Chorioallantoic membran (CAM), taze sarkomu türevli tümör dokuları, bunların tek hücre süspansiyonları, ve kalıcı ve geçici floresan etiketli Kurulan sarkoma hücre hatları ile aşılanır. Modeli greft-(canlılığı, Ki67 proliferasyon indeksi, nekroz, infiltrasyon) ve ev sahibi (fibroblast infiltrasyonu, vasküler yapıdaki) davranışlarını incelemek için kullanılır.

Özet

Sarkoma tüm yeni tedavilerin geliştirilmesi engel, doğada heterojen bir çok nadir görülen bir hastalıktır. Sarkom hasta bu hastalık için bir tekrarlanabilir ve düşük maliyetli kısenotransplant modeli gelişmekte olan cari faiz açıklayan, tabakalaşma sonra kişiselleştirilmiş tıp için ideal adaylardır. Civciv chorioallantoic membran türe özgü kısıtlama olmaksızın aşılı doku ve hücrelerin sürdürülmesi yeteneğine sahip doğal bir bağışıklık sistemi zayıf ev sahipliği yapmaktadır. Buna ek olarak, kolayca, erişilebilir manipüle ve optik ve floresan stereomikroskobi kullanarak görüntülü. Histoloji daha heterotipik hücresel etkileşimlerin detaylı analiz sağlar.

Bu protokol, detaylı şekilde açıklanmaktadır taze sarkomu türevli tümör dokuları, bunların tek hücre süspansiyonları, ve kalıcı ve geçici floresan etiketli Kurulan sarkoma hücre çizgileri (Saos-2 ve SW1353) ile korioallantoik membran aşılama ovo. Civciv hayatta kalma sıçanes% 75 kadar vardır. Modeli greft-(canlılığı, Ki67 proliferasyon indeksi, nekroz, infiltrasyon) ve ev sahibi (fibroblast infiltrasyonu, vasküler yapıdaki) davranışlarını incelemek için kullanılır. Tek hücre süspansiyonları aşılama lokalize için, ECM jel etkisiz altına malzemelere göre önemli avantajlar sağlamaktadır. Ki67 proliferasyon CAM yüzeyinden hücre mesafe ve CAM, terapötik ürünlerin eklenmesi için bir zaman dilimi belirlenmesi ikincisi uygulama süresi ile ilgilidir.

Giriş

Sarkomu tedavisi direnci ^1,2 nedeniyle yüksek mortalite ile bağ dokularının bir nadir bir tümördür. Hasta hayatta ilerleme, düşük yıllık insidansı, onların geniş çeşitlilik ve sarkom hücreleri in vitro ^3,4 kültür zor olduğu bildirilmektedir gerçeği ile engellenmektedir.

Klinik öncesi tedavi değerlendirmesi için kültür hücrelerinin kullanılması in vitro yeni, görünüşte aktif molekülleri her zaman klinik ortamda sonuçları yansıtmamaktadır ortaya koymuştur. Ayrıca, gen ifadesi diziler ortaya genom sapmaları her zaman ^5-7 hasta tümör davranış özellikleri ile ilişkili değildir. Bu sorunları denemek ve çözmek için, kişiye özel tıp ksenogreft modelleri ^8-12 için artan arama yansıtılır önem, kazanmıştır.

In vivo deney, bir C arasındaki karmaşık etkileşimi yansıtan avantajına sahiptirkanser proliferasyonu ve invazyonu ¹³ için gerekli ancer hücreleri ve solid tümörlerde konak doku ortamında,. Şu anda sarkomu ^14,15 için bir tekrarlanabilir xenograft model olarak Chorio-alantoik Membran testi (CAM-testi) kullanımını incelemek. Bu deney, yaygın tümör anjiyojenezi ^16,17 çalışma için kullanılmıştır. Diğer çalışmalarda farklı protokoller ^18,19 göre büyüme ya da anjiyogenez belirgin bir fark gözlenmiştir ise literatürde, ancak biz, bu tahlil için farklı protokoller bulduk.

Bu yazıda tümör greft, tümör kaynaklı tek hücre süspansiyonları ve köklü sarkomu hücre kültürleri kullanarak hücre davranışı üzerindeki CAM-testinin koşulları değişen etkisini araştırmak.

Protokol

Genel bir bakış için Şekil 1'e bakınız

Tümör malzeme

1. Tümör Örnekleri elde ve hazırlanması

Hasta malzeme kullanımı için, Etik Kurul onayı gereklidir ve aydınlatılmış onam hasta elde edilecek vardır.

1. Müdahale sırasında hasat temsilcisi malzeme (en az 1 cm ^3), biyopsi veya sarkom bir rezeksiyon ya. Biyopsi uygun sitesi dinamik kontrastlı MR kullanılarak tanımlanır.
2. DMEM 1,000 ünite penisilin ve 1 mg / ml streptomisin ile takviye içeren steril bir cam şişe içinde hemen malzeme yerleştirin.
3. Laboratuara - hemen flakon (90 dakika 30) taşıyın.

Tüm aşağıdaki işlemleri laminer akış altında yapılmaktadır.

4. Steril bir Petri kabı içine flakon içeriğini dökün.
5. Maksimum 1 m küçük parçalar halinde tümör örnek koymakm ³ steril bir neşter kullanılarak. Bu doku daha fazla işlem zarar eğilimi gibi tüm kalsifiye parçaları çıkarın.
6. Rasgele CAM uygulama için 10 tümör greft almak.

2. Tümör türetilmiş tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması

Yaklaşık süresi: 3 saat

1. Numunenin geri kalan doku tartılır.
2. 2 - dissociator bir tüp içinde doku, 4 g, birden fazla boru, kalan tüm tümör dokusu sindirimi için gerekli olabilir.
3. 2 sindirimi için, - doku, 4 g, 2.5 ml kollajenaz 2 çözeltisi (500 U / ml RPMI 1640) içinde ve 2.5 ml DNase çözeltisi (22 KU / ml RPMI 1640) ekleyin.
4. Dissociator h_tumor protokolüne göre doku işlem. Tüp 30 dakika hafifçe sarsıldı ise bu 37 inkübasyon 2 kür ° CO ₂ inkübatör C içerir.
5. 150 mikron hücre süzgecinden kalan süspansiyon filtre.
6. 5 mi için 1000 rpm'de lizat santrifüjn.
7. Süpernatantı.
8. Normal süspansiyonu ile inkübasyon 10 dakika sağlayan, eritrosit lizis tamponu (Elb) 10 ml pelletini.

Not: eritrosit lizis tamponu ile aşağıda belirtildiği gibi imal edilmiştir: 0.037 g EDTA, 0.99 g K ₂ HPO _4, 1000 ml su ile 8.29 g _NH4CI ekleme, bir 0.22 mikron filtre basınç altında, 7.3 pH değerini ayarlamak için 10 N NaOH kullanmak filtre. 4 ° C'de saklayın

9. , Reaksiyonu durdurmak için kültür ortamı (DMEM,% 10 fetal sığır serumu, 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiş) 25 ml ilave edilir.
10. 5 dakika boyunca 1000 rpm'de süspansiyon santrifüj. Pelet rengi hemen beyaz olmalıdır.
11. Süpernatantı.
12. Pelet orta 5 ml ilave edilir. 70 mikron hücre süzgecinden süspansiyon filtre.
13. Otomatik bir hücre sayacı vasıtasıyla canlı hücre / ml sayısını.

3. Cancer Hücre Hatları

SAOS2 osteosarkom hücreleri (ATCC numarası: HTB-85) gelişmiş yeşil floresan proteini ifade üreticinin protokolüne uygun olarak Hücre Hattı Nucleofector Seti V kullanılarak pEGFP-C1 vektörü ile elektroporasyon işleminden geçirildi. Stabil hücre hatları oluşturmak için, transfekte edilmiş hücreler önceki oluşturulmuş protokol ²⁰ paralel olarak 4 hafta boyunca G418 (1 mg / ml) içinde seçildi. Buna ek olarak ayırma, üreticinin talimatlarına göre, floresan aktive hücre sınıflandırma (FACS) ile gerçekleştirildi.

SW1353 kondrosarkom hücre hattı (ATCC numarası: HTB-94) alınan hücreler veya yeni hazırlanmış bir tümör tek hücre süspansiyonları, kırmızı bir floresan lipofilik membran lekesi kullanılarak etiketlenmiştir.

1. Çözeltisi; Tripsin (% 0.5 ağırlık / hacim) etilendiamintetraasetik asit (% 0.2 ağırlık / hacim EDTA) kullanılarak klasik bir şekilde kültür şişelerinde hücreleri çıkarmak.
2. 1000 rpm'de 5 dakika boyunca hücre süspansiyonu santrifüj edilir.
3. Supern çıkarınatant.
4. Serumsuz ortamda ve 5 ul DiI (Vybrant Kırmızı) / 10 ⁶ hücre 1 ml ilave edilir.
5. Alüminyum folyo ile şişe sarın ve 37 10 dakika ° C için CO ₂ inkübatör koydu
6. 1000 rpm'de 5 dakika boyunca tekrar santrifüje ve supernatant çıkarın.

Chorioallantoic membran tahlilinde

1. Yumurta Kuluçka

1. Yumurta% 95 döllenme garanti altına alan bir yerel ticari kuluçkahane gelen döllenmiş yumurta gereklidir.
2. Döllenmiş yumurta 10 gün oda sıcaklığında saklanabilir.

Not: kuluçka başlamadan önce, kir, tüy ve dışkı dikkatle yerine yumuşak bir yüzey yapısı daha kaba var kağıt havlu ile kuru silme ile mekanik olarak yumurta kabuğu kaldırılır. % 70 denatüre etanol ya da başka herhangi bir temizlik maddesi ile yumurta silme önemli piliç embriyoları hayatta kalma oranını azaltır.

3. Incub içinde yumurta koymakBir tarafta ator, üst yüzey işaretleme. Yumurta inkübatör koymak edildiği gün embriyonik gelişim gün 0 belirlenmiştir.
4. 37.8 ° C'de inkübasyon sıcaklığı, ve% 47 nem ayarlayın. Otomatik döndürme seçeneği kapalı olduğundan emin olun.

2. Yumurta Açılışı

Süre: 25 yumurta ± 60 dk

Geliştirme 3. günde, yumurta laminer hava akımı altında açılır. Membran kabuk sopa eğilimi, CAM zarar daha da gelişim aşamasında sonuçlara yumurta açılması. Bir kızılötesi lamba işlem sırasında yumurta sıcak tutmak için kullanılır. Kısırlık geliştirmek için, el eldiven kullanılmasını tavsiye ederiz.

1. Yukarı bakacak şekilde belirgin yüzü, eggcup içinde yumurta yerleştirin.
2. Yumurta ucunda takılı bir 18 G iğne ile albümin iki ml kaldırarak CAM seviyesini indirin. Iğne birkaç perfore sonra künt iseyumurta kabuğu, iğne değiştirin. Eğer değilse, çok fazla kuvvet yumurta sarısı veya kabuğun kırık hasar ile sonuçlanan, sarf edilmesi gerekir. Bazen iğne chalazae, ak en sarısı askıya 2 spiral gruplarından biri tarafından engellendi. Bu blok çözülene kadar yavaşça geri pistonu iterek çözülebilir. Yumurta sarısı şırınga içine çekilir, iğne gibi şırınga değiştirin. Bazen embriyo bu olaydan sonra ölür. Albümin miktarı yetersiz çıkarılırsa kabuk kaldırıldığında, CAM zarar görür.
3. Pencere kesim sırasında CAM üzerine kabuk parçacıkları dökülmesini önlemek için, kabuk kısmının belirgin üst tarafında bir yarı-geçirgen bir yapışkan film uygulanır.
4. Yumurta yüzeyinde küçük bir bız ile bir giriş deliği olun.
5. Steril sivri uçlu cerrahi bir makas kullanarak, kabuk 1 cm ² bir pencere kesin.
6. Embriyonun titreşimli kalp ve bitişik damarları inci de görülebiliryumurta sarısı e yüzey. Olmayan döllenmiş yumurta veya ölü embriyolar kaldırmak. Kan damarlarının bir kesintiye yönü ölü embriyo karakterize etmektedir.
7. Yarı geçirgen bir yapışkan film ile pencere mühür. Kabuk iğnenin sokulması esnasında çatlamaya sürece, ponksiyon karşılamak için gerekli değildir.

3. Aşılama Prosedürü

Süre: hücre hattı başına ± 1 saat

Civciv embriyonik gelişim günde 9, yumurta laminer hava akımı altında aşılanır.

CAM yayılan kanser hücresi değerlendirilmesi inokülasyon esnasında sınırlı bir yüzey için hücrelerin muhafaza gerektirir. Matrigel çok deneysel hücre kültürü koşullarında kullanılan Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkom bir hücre dışı matris (ECM), jel. Bu, soğutuldu, bir akışkan, ancak 20 ila getirdiği zaman termal aktif polimerizasyon doyurmaya - 40 ° C, böylece sabit bir jel meydana getirir. SırasındaDeneylerde, Matrigel erime buz içeren bir kutu tutulur.

Not: delikli lamelleri kullanmamayı ısrar ediyorlar. Böylece zar kendisinde hücrelerinin büyümesini potansiyel eğimlendirme plastik disk üzerine bağlanma ve aşılı kanser hücrelerinin büyümesini görülmektedir.

1. 10 ⁶ cells/100 ul ECM jel konsantrasyonunda soğutulmuş ECM jel bir hücre pelletini. Erime buz üzerinde bu çözüm tutun.
2. Laminer hava akımı altında steril cerrahi bir çift ile yarı geçirgen zar Tüketim parçası. Yapışkan film tamamen kaldırılır, bu kirlenme nedeniyle embriyonik ölüm daha büyük bir oran ile sonuçlanacaktır.
3. Epitel hücre tabakası kaldırmak için, steril bir cam çubuk ile hafifçe kabuk penceresinin altındaki CAM doğru dokunun. Steril bir cam çubuk ile CAM dokunmak bir neşter n ° 11, daha beceriklilik ve deneyim gerektirir kullanarak daha az travmatik olduğunu kanıtlamaktadır. Küçük kanamalar oluşabilir.
4. Birtümör malzeme dding.
5. Tümör greftler için: bu sıkmadan steril forseps bir çift ile CAM üzerine doku hafifçe düşük tek parça,.
6. ECM jel işlem için: ECM jel uygulamalar arasında polimerize etmek için, birbirleriyle üstüne, CAM için hücre-ECM jel süspansiyonu 4x 25 ul ekle. Bu şekilde, kanser hücrelerini içeren bir yapışkan plak oluşturulur.
7. Yarı geçirgen bir yapışkan film ile tekrar kabuk penceresini kapatın.

4. Görüntüleme ve CAM Hasat

Süre: 25 yumurta 2 saat

Civciv embriyonik gelişim günde 16, CAM'lar hasat edilir. Laminer hava akımı altında çalışan gerekli değildir.

1. Cerrahi bir makas ile pencere büyütmek. Yaralı gemilerin kanama ile sonuçlanan, aksi CAM hasar görür, çok düşük kesmek için emin olun.
2. Ekle 300 - PBS ^D 500 ul CAM mezhep üzerine bir pipet ileinoküle malzeme içeren iyon. Herhangi bir flüoresan prob kullanıldığında, bu, membranın sertleştirir olarak, tamponlu formaldehid zarın kesimi kolaylaştıracak, kullanılabilir.
3. GFP veya DSR filtre ve hiçbir filtre her ikisini de kullanarak bir dijital renkli kamera ile donatılmış bir stereo floresan mikroskop,, ile yumurta CAM bir fotoğrafı olun. Tümör greftler, tüm fotoğrafları filtreleri olmadan yapılır. LED ışıklarla yukarıdan aydınlatma güçlü (Şekil 2) fotoğraf sırasında önerilir.
4. Etiketli hücreler için kayıt tümör hücre migrasyonu. Tümörlerin sınırları düzensiz ve yıpranmış olabilir. Dağınık hücreler tümör sınırları yakınında mevcut olabilir. Bazı örneklerde, tümör hücrelerinin satır (Şekil 3) gözlenebilir.
5. Kabuk karşı yalan sınırda steril bir makas ile membran kesin.
6. PBS ^D dolu ya da için tamponlu steril bir Petri kabındaki hasat CAM yerleştirinmaldehyde.
7. Üst yan ve ve filtre olmadan hem CAM alt tarafında, hem de bir fotoğrafı olun.
8. En az 72 saat boyunca tamponlu formaldehid ile etiketli bir kap içinde membran koyun.
9. Parafin CAM'lar Embed ve histolojik inceleme için onları hazırlamak. Kesim yüzeyi kasetin alt paralel olmasına dikkat ederek, nodül merkezinde tümör greft kesmek için dikkat edin. Değilse, CAM ve tümör greft arasındaki etkileşimi görünmeyecektir. Aynı strateji ECM jel plaklar için geçerlidir: kesme bıçağı bakan yüzey plak dik olmalıdır.

5. Histolojik Değerlendirme

Gerekirse Hematoksilen-Eozin boyama ve Ki-67 immünhistokimya, daha fazla açıklama için yapıldı. İmmünohistokimya göre otomatik bir slayt yapıcısı kullanılarak, kalınlığı 3.5 mikron arasında, formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku bölümleri üzerinde gerçekleştirilmiştirüreticinin talimatlarına. Ki-67 (klon MIB-1, seyreltme 1/100) bir primer fare monoklonal antikor kullanılmıştır. Isı kaynaklı epitop alma Hücre Klima 1 kullanılarak yapıldı ve görselleştirme Evrensel DAB Algılama Kiti ile sağlandı, üreticinin talimatlarına göre. Doku bölümlerinin Dehidratasyon otomatik bir coverslipper kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

SAOS2 ve SW1353 hücre hatları için, Ki67 pozitif ve Ki67-negatif hücre nuclei/100 mikron ² sayısının üç bölgelerde sayıldı: bir yakın CAM sınırına, birinin merkezinde yüzey ve bir yakın ECM jel plak. Bu işlem her Ki-67 lekeli slayt için 6x tekrarlandı. Çoğalma endeksi sayılan toplam hücre sayısına göre Ki67-pozitif hücrelerin sayısına bölünmesi ile her bir slayt için belirlenmiştir.

Nekroz fadi eşliğinde hücre çekirdeğinde kromatin ince dağılım kaybı, ile tanımlanırfarklı hücre marjlarının ng. Xenografts için, nekroz tam, (genellikle yüzeyde) kısmi veya eksik olarak puanlanır. CAM içine tümör hücrelerinin Sızma CAM mezoderm içinde tümör hücrelerinin gözlem ile tanımlanır ve mevcut veya yok olarak puanlanır.

Üç öğe ana davranış puanlanır. Fibroblast infiltrasyonu uzun hücreleri CAM bırakarak ve tümör greft / plak işgalci olarak tanımlanır ve mevcut veya yok olarak puanlanır. Damar büyümesi çekirdekli civciv eritrositlerin varlığı ile karakterize civciv gemilerin, çoğalan gelişmesini olarak görülebilir.

Sonuçlar

CAM değerlendirilmesi

Tümör greft CAM (Şekil 2A) yapışık olur. Hasta malzemeden tek hücre süspansiyonları sık sık kuru, hafif kabarık plak (Şekil 2D) görüntüler. CAM eksizyonu sonra, membran kırışıklıklar (2E ve 2F Şekiller) oluşur oldu.

Ticari bir hücre hattı için plak hücre çoğalması gösteren, zaman içinde daha opak hale gelir. ECM jel farklı hücre hatları CAM ?...

Tartışmalar

Aşılama ve hasat zamanı

Aşılama yapıldığı gün ECM jel (36 CAM'lar) içinde SAOS2 kullanılarak yapılan ve embriyonik gelişim gün 5 ile 10 arasında değişiyordu zamanlama.

Kuluçka gün önce 9, CAM sürekli biz uygulanan ECM jel destekleyecek kadar büyük değildi. Hasat, tümör hücreleri bazen derin CAM alınan gerekiyordu ve bazı ECM jel örnekleri albümin ya da CAM gevşek yatıyorlardı. Gün 5 ve 6, bu civciv malformasyonlar veya ölüml...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Line Nucleofector Kit V	Amaxa	VCA-1003
collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640)	Sigma Aldrich	C6885
DMEM	Invitrogen	41965-039
DMSO	Sigma	D8418
Dnase solution	Sigma Aldrich	DN25
G418	Invitrogen	11811031
Matrigel	Sigma-Aldrich	E1270
mouse primary monoclonal antibody Ki67	Dako Denmark	MIB-1
Paraformaldehyde	Fluka	D76240
PBS	Invitrogen	20012019
PBSD	Invitrogen	14040083
peGFP-C1 vector	Clontech	632470
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	15140163
RPMI	Invitrogen	22409-015
Trypsin-EDTA solution	Invitrogen	25300054
Vybrant cell-labeling DiI	Lifetechnologies	22885
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10227
digital color camera	Leica	DFC 340 FX
Digital Egg Incubator	Auto Elex Co	R-COM 50
FACS	BD Biosciences	FACSAriaIII
Gentlemacs C-Tube	Miltenyi Biotech	130-093-237
Gentlemacs Dissociator	Miltenyi Biotech	130-093-235
Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol	Miltenyi Biotech
[header]
semipermeable adhesive film (Suprasorb F)	Lohmann&Rauscher	20468
stereo fluorescence microscope	Leica	M205 FA
Tissue-Tek Film automated Coverslipper	Sakura	6400
ultraView Universal DAB Detection Kit	Ventana Medical Systems Inc	760-500
Ventana Automated Slide Stainer	Ventana Medical Systems	Benchmark XT