הערכה של סידן ניצוצות בסיבי שריר שלד שלמים

Summary

שתואר כאן היא שיטה למדידה ישירה ניצוצות סידן, היחידות יסודי של Ca ^{2 +} שחרור מreticulum sarcoplasmic בסיבי שריר שלד בשלמותה. בשיטה זו משתמשת האוסמוטי-תיווך מתח מפעילה של Ca ^{2 +} שחרור מקולט ryanodine בסיבי שריר מבודדים. יכולים להיות מועסק הדינמיקה ויכולת homeostatic של Ca ^{2 +} איתות תאית כדי להעריך את תפקוד שרירים בבריאות ובחוליים.

Abstract

שמירה על האיתות ⁺ homeostatic Ca ² היא תהליך פיסיולוגי בסיסי בתאים חיים. Ca ^{2 +} ניצוצות הם היחידות היסודיים של Ca ^{2 +} האיתות בסיבי השריר המפוספס שמופיעים מקומיים כמאוד ² אירועי שחרור Ca ⁺ מתווכים על ידי קולטן ryanodine (RyR) Ca ^{2 +} לשחרר ערוצים בreticulum sarcoplasmic (SR) בממברנה. הערכה נכונה של השרירים Ca ^{2 +} ניצוצות יכולים לספק מידע על Ca ^{2 +} מאפייני טיפול תאיים של שרירים משורטטים בריאים וחולים. למרות Ca ^{2 +} ניצוצות אירועים נראים בדרך כלל בשריר לב במנוחה, הם נשמרים רק לעתים נדירות במנוחת סיבי שריר שלד, ולכן יש צורך בשיטות להפקת ולנתח ניצוצות בסיבי שריר שלד.

המפורטים כאן הוא פרוטוקול ניסוי למדידת Ca ^{2 +} ניצוצות בdigitorm brevis סיבי שריר מכופף מבודד (FDB) באמצעות fluorescent Ca ^{2 +} דדים ומיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר. בגישה זו, סיבי FDB מבודדים נחשפים ללחץ hypoosmotic חולף ואחרי חזרה לפתרון פיסיולוגי איזוטוני. בתנאים אלה, Ca ^{2 +} חזק ניצוצות התגובה מזוהה סמוכה לממברנה sarcolemmal בסיבי שריר צעירים ובריאים FDB. Ca ^{2 +} שינה ניצוצות תגובה מזוהה בסיבי שריר שלד dystrophic או בגיל. גישה זו הוכיחה לאחרונה כי איתות מופרדת קרום מעורב דיבורים צולבים בין אינוסיטול (1,4,5)-אדנוזין קולט (IP ₃ R) וRyR תורם לCa ^{2 +} ניצוץ הפעלה שברירי שלד. לסיכום, המחקרים שלנו באמצעות לחץ האוסמוטי מושרה Ca ^{2 +} ניצוצות הראו כי תגובה תאית זו משקפת שרירים איתות מנגנון בפיזיולוגיה והזדקנות / מדינות מחלה, כולל מודלים עכבר של ניוון שרירים (MDX עכברים) או טרשת לרוחב amyotrophic (מודל ALS).

Introduction

Ca בחינם תאית ^{2 +} ([Ca ^{2 +]} _i) הוא שליח משני צדדי וחשוב המווסת את התפקודים תאיים רבים בתאים להתרגש כגון תאי עצב, לב, שלד ושרירים חלקים (לסקירה ראה Stutzmann ^ו1 Mattson). מוסדר Ca ^{2 +} וגיוס דיבורים צולבים בין reticulum sarcoplasmic (SR) ו-T-אבובית קרומים (TT) הם רגולטורים בסיסיים של פיזיולוגיה שרירים. יתר על כן, שינויים בCa ^{2 +} איתות שהוכחו כמנגנון בסיסי של תפקוד לקוי של התכווצות במחלות שרירים שונות.

Ca ^{2 +} ניצוצות מקומיים אירועי Ca ^{2 +} שחרור יסודיים שמקורם הפתיחה של הקולטן ryanodine הערוץ (RyR) על reticulum sarcoplasmic הקרום (SR) ^2. בשריר לב, ניצוצות להתרחש באופן ספונטני באמצעות פתיחת ערוץ RyR2 ידי Ca ² Ca ^{2 +} rele ^+-InducedASE (CICR) ^3-5 מנגנון. בשרירי שלד, RyR1 נשלט בקפידה על ידי חיישן המתח ^ב6,7 קרום TT. כך Ca ^{2 +} ניצוצות מדוכאים וזוהו רק לעתים נדירות בתנאי מנוחה בסיבי שריר שלד בשלמותה. עד לאחרונה, קרום sarcolemmal הדרוש כדי להיות מופר על ידי שיטות שונות כימיות או מכאניות "הפשטה" לנתק את הדיכוי של חיישן המתח על RyR1 ואיפשר לCa ^{2 +} להצית אירועים כדי להתגלות בשרירי שלד ^8,9. שיטה אחת שתוארה קודם לכן permeabilization הנדרש של הקרום של סיבי שריר על ידי saponin חומר ניקוי ^10.

ב2003, גילו שגם מתח hypoosmotic חולף או מתח hyperosmotic יכול לגרום Ca ההיקפי ^{2 +} ניצוצות סמוכים לממברנה sarcolemmal בסיבי שריר בשלמות ^11. שיטה זו מאז שונתה כדי ללמוד את המנגנון ואפנון המולקולריים של Ca ^{2 +} שחרור ודינמיקת ^12-16. כאן אנו מתארים את הפרטים של הגישה הניסויית שלנו לזירוז, זיהוי וניתוח של Ca ^{2 +} ניצוצות בשרירי שלד בשלמותה. אנו מציגים גם התכנית שלנו שהותקן ניצוץ הניתוח שיכול לשמש כדי לכמת את המאפיינים הבסיסיים של Ca ^{2 +} ניצוצות בודדים בשרירי שלד, לדוגמא תדר ניצוץ ומשרעת (Δ F/F0, המשקף את ההסתברות הפתוחה של ערוצי RyR ו Ca ^{2 +} המטען בתוך SR); זמן להגיע לשיא (זמן עלייה) ומשך (FDHM, משך מלא במשרעת חצי מקסימלי) של ניצוצות, כמו גם את ההתפלגות המרחבית של Ca ^{2 +} ניצוצות. בנוסף, אנו מציגים ראיות המקשרת שינו Ca ^{2 +} ניצוצות למדינות השונות pathophysiological בשרירי שלד, כגון ניוון שרירים וטרשת לרוחב amyotrophic.

היתרון של שיטה זו כרוך ביכולת למדוד Ca ^{2 +} ביחסית undamתאי בני, במקום להפשיט את סיבי השריר, המאפשרים הקלטה של Ca ^{2 +} ניצוצות בתנאים קרובים יותר לפיסיולוגיים. בנוסף, התכנית המותאמת במיוחד שלנו מספקת חישובים מדויקים יותר של המאפיינים של הניצוץ ביחס לסיבי שריר.

Protocol

1. הגדרת מערכת זלוף אוסמוטי מתח

איור 1 הוא פרוטוקול סכמטי של סידן ניצוצות הערכה בסיבי שריר שלד בשלמותה.

1. הגדר את micromanipulator שלושה צירים (XYZ) מסוגל מיקום קצה היציאה של מערכת זלוף המכילה מינימום של שני ערוצים. זה יכול להיעשות עם חבית Luer-מזרק חד פעמית עם שלוש מצורפים - הדרך Luer - ברזלים לוק לעבור על ו / או לבטל את הזרימה של פתרונות זלוף. ערוצי זלוף אלה צריכים להיות מסוגלים לספק> 1 מיליליטר / דקה של פתרון באמצעות קצה זלוף יחיד עם> 0.2 בקוטר מ"מ.
2. טען שני ערוצים של מערכת זלוף, אחד עם איזוטוניים Tyrode פתרון והשני עם hypotonic Tyrode פתרון.

2. סיבי שריר פגוע הכנה יחידה המכופפת digitorum רוויס (FDB) מעכבר

1. הסר את הרגל מאיחוד אירופי בעכברthanized הבא הנחיות NIH וIACUC באמצעות זוג מספריים לנתח כבד על ידי חיתוך דרך הרגל מעל למפרק הקרסול.
2. הצמד את הרגל על חדר נתיחה מלא מינימאלי Ca ^{2 +} Tyrode פתרון עם משטח plantar פונה כלפי מעלה.
3. לנתח FDB ידי חיתוך הגיד ומשייכתו בעדינות על הגיד להפריד את השרירים מהרקמה הסובבת.
4. לסיים את הנתיחה על ידי חיתוך הגיד הדיסטלי שבו סניפים לספרות בודדת בשכבות עמוקות של השרירים.
5. העבר את שריר FDB ידי להרים עם מלקחיים באמצעות הגידים שלה כדי למנוע נזק נוסף לסיבי שריר ואת המקום לתוך צינור עם aliquot מופשר של Collagenase עיכול פתרון prewarmed 37 ° C.
6. דגירה הצינור המכיל FDB זקוף על שייקר מסלולית ב 37 מעלות צלזיוס במשך דקות 60-90 עם מהירות של 160 סל"ד. פרוטוקול דיסוציאציה חבילות שריר זה יש לבחון באופן ניסיוני לזנים שונים של בעלי חיים, במיוחד עבור אלה מחלה / סיבי מוטציה פגיעים לנזק בממברנה.
7. העבר את FDB מתעכל לתוך צינור עם 700 μl של איזוטוניים Tyrode פתרון ועדינות triturate כדי לשחרר את הסיבים על ידי ציור של השריר מספר פעמים באמצעות סדרה של 200 טיפים מ"ל micropipette של ירידה בקוטר בהדרגה באמצעות חיתוך בסכין גילוח נקי כדי להסיר את הטיפים 200 micropipette מיליליטר. כדי להימנע מסיבי נזק בשרירים חלשים במיוחד ממחלה, לוודא את הקצה הוא פשוט גדול מספיק כדי לאפשר צרור הסיבים לעבור דרך ללא דבק. אל תכריח את החבילה דרך קטנה מדי פתיחה.
8. פלייט את סיבי FDB בעדינות על ידי ההקשה וresuspending סיבי FDB בצינור ולאחר מכן ציור מתוך 70 מיליליטר (1/10 של סיבי סך הכל) עם micropipette מיליליטר לחתוך 200 למרכז צלחת 35 מ"מ דלתא TPG מכילה 1 מיליליטר של איזוטוניים Tyrode פתרון כדי להפחית דיפוזיה על פני הצלחת.
9. לקבוע את מספר הסיבים בודדים ללא פגע בדish באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה. הוספת aliquots נוספים של סיבי FDB להשיג 3-4 סיבים שלמים בצלחת.
10. אחסן את סיבי שריר מבודדים נוספים על 4 מעלות צלזיוס ולהשתמש תוך 6 שעות.

3. טוען Fluo-4:00 דיי וCa ^{2 +} הדמיה (ניצוצות מדידה)

1. העברת 500 מיליליטר של איזוטוניים Tyrode פתרון מצלחת עם סיבי FDB מצופים לתוך צינור עם מיליליטר 10 מניית AM Fluo-4 (1 מ"מ), לערבב ולהוסיף חזרה לצלחת לריכוז AM Fluo-4 סופי של 10 מ"מ. לחלופין, חומצת pluronic ניתן להשתמש בם כדי להגביר את יעילות טעינת צבע.
2. טען ל60 דקות בטמפרטורת חדר בחושך.
3. שטוף את הסיבים על ידי ציור בזהירות 500 מיליליטר של Fluo-4 המכיל AM איזוטוניים Tyrode פתרון מהצלחת עם קצה micropipette נימול 200 מיליליטר פלסטיק ולהחליף עם נפח שווה של טרי איזוטוניים Tyrode פתרון.
4. חזור על תהליך זה 3 פעמים נוספות.
5. כדי להמחיש את התפקוד המיטוכונדריה, להעביר 500 מיליליטר של IsotoNIC Tyrode פתרון מצלחת עם סיבי FDB לתוך צינור עם 5 מיליליטר מניית TMRE (1 מ"מ), לערבב, ולהוסיף חזרה לצלחת לריכוז סופי של 50 ננומטר.
6. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות.
7. שטוף את הסיבים על ידי הציור בזהירות 500 מיליליטר של איזוטוניים Tyrode פתרון מהצלחת עם קצה חתוך 200 מיליליטר פלסטיק micropipette ולהחליף עם נפח שווה של טרי איזוטוניים Tyrode פתרון המכיל TMRE.
8. חזור על תהליך זה 3 פעמים נוספות.
9. מעביר את המנה למיקרוסקופ confocal ובחר סיבים שלמים עם פסים בהירים וקרום sarcolemmal חלק לניסויים.
10. מקם את קצה מיקרומטר 400-500 מערכת זלוף מסיבי שריר היעד ומחוץ למרכז באמצעות פקדי micromanipulator.
11. בגין הזרימה איזוטוניים Tyrode הפתרון כדי להבטיח את סיבי FDB נשאר במקום.
12. רשום את אות הקרינה מFluo-4 בבוקר, עם מטרת טבילת שמן 40X ולרגש Fluo-4 בבוקר, עםאותות לייזר ארגון (ננומטר 488 גל עירור) ופליטת שיא (אורך גל 510-580 ננומטר). עוצמת אות הניאון היא פרופורציונלית לרמה היחסית של ריכוז ⁺ Ca ² תאיים ([Ca ^{2 +]} _i).
13. לגרום Ca ^{2 +} ארעיים על ידי שינוי הלחץ האוסמוטי של הפתרון תאי על מנת לייצר לחץ האוסמוטי בסיבים. בתחילה תנקב סיבים עם פתרון איזוטוניים Tyrode (290 mOsM) (אוסף בסיס ל60 שניות) ולאחר מכן עם פתרון hypotonic Tyrode (170 mOsM) ל100 שניות כדי לגרום לנפיחות. Perfuse סיבי FDB חזרה עם פתרון איזוטוניים Tyrode. באופן כללי, רק אחד הלם אוסמוטי מוחל על סיב בודד בשלמות בצלחת TPG דלתא אחד ואירועי הניצוץ אחרון 10 דקות עבור רכישת נתונים.
14. לוקליזציה המרחבית שיא של Ca ^{2 +} ניצוצות (איור 2), תוך שימוש בזמן סדרה של XY תמונות דו ממדיות עם מהירות סריקה של 166 LPS (קו לשנייה, וeaשורת ch המורכבת מ512 פיקסלים וכתוצאה מכך 3.08 שניות / מסגרת) עבור כל תנאי של דקות (1 איזוטוני), מתח hypotonic (100 שניות) ודחק פוסט hypotonic (5 דקות). אותות חנות לניתוח במצב לא מקוון כדי להעריך את התפוצה ואת התדירות של Ca ^{2 +} ניצוצות לאחר השלמת הניסוי.
15. מצא את סיבים חדשים על מאכל חדש ובצע את אותו פרוטוקול הלם אוסמוטי כדי לגרום Ca ^{2 +} ארעיים. השתמש בקו סריקה confocal מצב (XT) (512 פיקסלים באורך, קצב דגימה של סריקת msec / קו 2 להקליט Ca ^{2 +} ארעיים למשך דקה אחת (כלומר 30,000 שורות) עם קו סריקת confocal ממוקם ישירות מתחת קרום sarcolemmal (איור 3 ). שנה את קו הסריקה למטוסי מוקד שונים לשלוש סדרות רציפים (במרווחי 1-min) של linescans לניתוח של הגודל וקינטיקה של Ca ^{2 +} ניצוצות בודדים להקליט.

4. ניתוח נתונים

1. לאסוף מספר רב שלקו סריקת XT עקבות להעריך את המורפולוגיה וקינטיקה של פרמטרים ^{2 +} ניצוצות Ca נפרדים, כלומר את המשרעת (F / ₀ F; בי F ₀ הוא ^{2 +} הקרינה Ca המנוחה), זמן עלייה, זמן השיא, המשך (FDHM , משך מלא במחצית גודל), ורוחב מרחבית (FWHM, רוחב מלא במחצית גודל) של הניצוצות שנרשמו. פרמטרים אלה מייצגים את המאפיינים הבסיסיים של gating RYR Ca ^{2 +} ערוצים כגון Ca ^{2 +} השטף (אמפליטודה), וקינטיקה gating של RYRs (משך).
2. לנתח את נתוני תמונה דיגיטליים עם אלגוריתם שפותח במיוחד עבור, חצי אוטומטי שנוצר עם שפת עיבוד התמונה IDL (נתונים אינטראקטיביים שפה), כפי שתואר לעיל ^11,16. בגלל קינטיקה הייחודית של Ca ^{2 +} שחרור במקרה של ² ניצוצות ⁺ Ca המושרה בסיבי FDB ידי מתח האוסמוטי, עדיף לשלב את התכונות ידניות ואוטומטיות של Ca ^{2 +} להצית אירועיםזיהוי ועיבוד עם תוכניות ניתוח תמונה אישית לבנות האלה ^11. אלגוריתם זה הוא מאוד שימושי כאשר זה הכרחי כדי לזהות באופן ידני את ההחזר על ההשקעה (אזור של עניין) בחלק מדגמי מחלת שריר. ברגע שהחזר על השקעה מוגדרת, האלגוריתם יכול באופן אוטומטי לגזור את הפרמטרים הניצוץ שהוזכרו לעיל אשר לאחר מכן ניתן לייצא לקובץ Excel. לחלופין, התוכנה הציבורית זמינה עיבוד תמונה, למשל SparkMaster בImageJ, ניתן להשתמש בם כדי להגדיר את מאפייני הקינטית של Ca ^{2 +} ניצוצות והפריסה המרחבית שלהם בשרירי שלד ^17.

תוצאות

מחקרים קודמים הראו כי לחץ hypoosmotic חולף ⁺ מושרה Ca ההיקפי ² ניצוצות בסמוך לממברנה sarcolemmal בסיבי שריר בשלמות ^11. איור 1 מציג את התמונות של סיבי שריר בודדים שלמים עם קרום sarcolemmal חלק ופסים ברורים אופייניים. איור 2 מראה Ca הטיפוסי ^{2 +} ניצוצו...

Discussion

שיטה זו של הערכת Ca ^{2 +} ניצוצות בשרירי שלד בשלמותה היא כלי שימושי לפיזיולוגית שרירים ומחקר מחלה. הראינו כי תגובת Ca ^{2 +} הניצוץ שונתה בתנאים שונים, כולל ניוון שרירי ^11, הזדקנות ^{_18, 19,} כמו גם בטרשת לרוחב amyotrophic ^20. המחקר שנערך לאחרונה שלנו חשף ג...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting microscope			Dissect out fibers and check muscle integrity
Dissection tools -scissors and fine tip forceps	Fine Science Tools
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	DOW CORNING	184 SIL ELAST KIT	Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60 mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become a clear, colorless solid substrate.
60 mm glass Petri dish	Pyrex	3160	Fiber dissection
Isotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Minimal Ca2+ Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Hypotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Collagenase type I	Sigma-Aldrich	C-5138	Fiber digestion
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201	Fluorescent Ca2+ imaging dyes
TMRE	Invitrogen	T669	mitochondrial membrane potential fluorescent dyes
Delta TPG dishes	Bioptechs	0420041500C	35 mm glass bottom dish for imaging
Spark Fit software			data analysis software
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope	Bio-Rad
3 Axis Micromanipulator	Narishige International	MHW-3
Temperature controllable orbital shaker	New Brunswick scientific		Fiber dissociation