Оценка кальция Sparks в малонарушенных скелетных мышечных волокон

Резюме

Описанный здесь метод непосредственного измерения искры кальция, элементарные единицы Ca ^{2 +} освобождение от саркоплазматического ретикулума в неповрежденных скелетных мышечных волокон. Этот метод использует осмотического стресса опосредованного срабатывания Ca ^{2 +-релизе} рианодинового рецептора в изолированных мышечных волокон. Динамика и гомеостатический емкость внутриклеточного Ca ^{2 +-сигнализации} могут быть использованы для оценки функции мышц в норме и при патологии.

Аннотация

Поддержание гомеостаза Са ^{2 +} сигналов является фундаментальным физиологический процесс в живых клетках. Ca ^{2 +} искры являются элементарными единицами Са ^{2 +-сигнализации} в поперечно-полосатой мышечных волокон, которые появляются, как сильно локализованы Ca ² события ⁺ релиз, опосредованные рианодинового рецептора (RyR) Са ^{2 +} освободить каналы на саркоплазматического ретикулума (СР) мембраны. Надлежащая оценка мышц Ca ^{2 +} искры может предоставить информацию о внутриклеточных Са ^{2 +} обработки свойств здоровых и больных поперечно-полосатых мышцах. Хотя Ca ^{2 +} искры события часто наблюдается в состоянии покоя кардиомиоцитов, они редко наблюдается в состоянии покоя скелетных мышечных волокон, таким образом существует потребность в способах для получения и анализа искры в скелетных мышечных волокон.

Детальный здесь экспериментальный протокол для измерения Ca ^{2 +} искры в изолированных сгибателей digitorm Brevis (FDB) мышечных волокон с помощью еluorescent Са ^{2 +} indictors и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. При таком подходе, изолированные волокна FDB подвергаются переходного гипоосмотического стресса с последующим возвращением к изотонического физиологического раствора. В этих условиях надежной Ca ^{2 +} искры ответ обнаружено, прилегающей к мембране сарколеммы у молодых здоровых мышечных волокон FDB. Измененные Са ^{2 +} искры ответ обнаружены в дистрофических или в возрасте скелетных мышечных волокон. Такой подход в последнее время показали, что мембрана, разделенных сигналов с участием перекрестные помехи между инозит (1,4,5)-трифосфат рецептор (IP ₃ R) и RyR способствует Ca ^{2 +} активации искра в скелетных мышцах. Таким образом, наши исследования с использованием осмотического стресса индуцированных Ca ^{2 +} искры показал, что это внутриклеточный ответ отражает мышцу механизм сигнализации в физиологии и старения Штаты / болезни, в том числе моделей мыши мышечной дистрофии (MDX мышей) или бокового амиотрофического склероза (БАС модели).

Введение

Внутриклеточного свободного Са ^{2 +} ([Ca ^{2 +]} _я) является универсальным и важным второстепенным вестников, который регулирует несколько клеточных функций в возбудимых клеток, таких как нейроны, сердца, скелетной и гладкой мускулатуры (см. обзор Stutzmann и Mattson ^1). Регулируемый Ca ^{2 +} мобилизации и перекрестные помехи между саркоплазматического ретикулума (СР) и Т-канальцев (TT) мембраны являются фундаментальными регуляторы мышечной физиологии. Кроме того, изменения в Ca ^{2 +-сигнализации} уже было показано, что основной механизм сократительной дисфункции при различных заболеваниях мышц.

Ca ^{2 +} искры локализованы элементарных событий Са ^{2 +} релиз, происходящих из открытия рианодинового рецептора (RyR) канала на саркоплазматического ретикулума (СР) мембраны ^2. В сердечной мышце, искры возникают спонтанно через отверстие канала RyR2 с помощью Ca ^{2 +-индуцированных} Са ^{2 +} RELEASE (CICR) механизм ^3-5. В скелетных мышцах, RYR1 строго контролируется с помощью датчика напряжения на мембраны ^6,7 TT. Таким образом Ca ^{2 +} искры подавляются и редко обнаруживается в покоящихся условиях в неповрежденных скелетных мышечных волокон. До недавнего времени сарколемных мембрана необходима, чтобы быть нарушена различными химическими или механическими "Горное дело" методов расцепить подавление датчика напряжения на RYR1 и позволило Ca ^{2 +} искра события, которые будут обнаружены в скелетных мышцах ^8,9. Один способ, ранее описанный требуемого пермеабилизации мембраны мышечных волокон по сапонина моющего средства ^10.

В 2003 году мы обнаружили, что либо переходный стресс гипоосмотического или гиперосмотический стресс может вызвать периферическую Ca ^{2 +} искры рядом с сарколеммы мембраны интактных мышечных волокон ^11. Этот метод был модифицирован так как изучить молекулярный механизм и модуляцию Ca ^{2 +} релиз и динамика ^12-16. Здесь мы приводим детали нашего экспериментального подхода для индукции, обнаружения и анализа Ca ^{2 +} искр в неповрежденной скелетных мышцах. Мы также представляем наш специально построенный программу анализа свечу, которую можно использовать для количественного определения элементного свойства отдельных Ca ^{2 +} искр в скелетных мышцах, например свечи частоты и амплитуды (Δ F/F0, что отражает вероятность открытия каналов RyR и ⁺ нагрузка Са ² внутри СР); время до пика (время нарастания) и продолжительность (FDHM, полный срок в полумаксимальной амплитуды) искр, а также пространственное распределение Са ^{2 +} искр. Кроме того, мы представляем доказательства того, что ссылки изменен Ca ^{2 +} искры к различным патофизиологических состояний в скелетных мышцах, таких как мышечная дистрофия и боковой амиотрофический склероз.

Преимущество этой техники включает в себя возможность измерения Са ^{2 +} в относительно undamв возрасте клетки, вместо зачистки мышечные волокна, что позволяет записи Са ^{2 +} искры в условиях ближе к физиологическим. Кроме того, наша специально разработанная программа обеспечивает более точные расчеты свойств искры в отношении мышечных волокон.

протокол

1. Настройка Осмотическое-стрессовой перфузии системы

Фиг.1 представляет собой схематический протокол кальция искры оценку в интактных скелетных мышечных волокон.

1. Настройка трехосный (XYZ) микроманипулятор способный позиционирует наконечник выпускной системы перфузии, включающей не менее двух каналов. Это может быть сделано с одноразовой Luer-шприца с прикрепленными три - способ Luer - Лок краном для включения и / или выключения потока перфузии решений. Эти перфузии каналы должны быть способны доставлять> 1 мл / мин раствора через один наконечник перфузии с> 0,2 мм в диаметре.
2. Загрузите два канала перфузии системы, один изотоническим Тироде решения, а другой гипотоническими Тироде Solution.

2. Подготовка Неповрежденный Одноместный сгибателя Brevis (FDB) мышечных волокон от Mouse

1. Снимите ногу с мыши ЕСthanized следующие NIH и IACUC принципов, используя пару тяжелых ножниц рассекая по прорезая выше голеностопного сустава ноги.
2. Прикрепите ногу на рассечение камере, заполненной с минимальным Ca ^{2 +} Тироде решения с поверхностью подошвенной стороной вверх.
3. Проанализируйте FDB за счет сокращения сухожилия и осторожно потянув на сухожилия, чтобы отделить мышцу от окружающей ткани.
4. Закончить рассечение счет сокращения дистального сухожилия, где она разветвляется на отдельные цифры в глубокие слои мышц.
5. Перенести мышцы FDB, поднимая щипцами через его сухожилия, чтобы избежать дополнительного повреждения мышечных волокон и поместить в трубку с талой аликвотой коллагеназой решения предварительно нагретой до 37 ° С.
6. Инкубируйте пробирку, содержащую FDB вертикально на орбитальном шейкере при 37 ° С в течение 60-90 мин со скоростью 160 оборотов в минуту. Этот протокол диссоциации мышечные пучки должны быть экспериментально исследованы на различных штаммов животных, Особенно для тех болезней / мутантных волокон уязвимых к повреждению мембраны.
7. Передача расщепленной FDB в трубку 700 мкл изотонического раствора Тироде и осторожно растирают освободить волокна, привлекая мышцу несколько раз через серию 200 мл микропипетки-кончиков постепенно уменьшением диаметра с помощью резки с чистым лезвием бритвы, чтобы удалить кончики 200 мл микропипетки. Чтобы избежать повреждения волокон в частности слабые мышцы от болезней, убедитесь, что наконечник достаточно большой, чтобы позволить расслоение пройти через без прилипания. Не перегружайте пучка через слишком небольшой отверстие.
8. Тарелка из волокна FDB аккуратным постукиванием и ресуспендированием FDB волокон в трубке, а затем растягивая 70 мл (1/10 от общего числа волокон) с мл микропипетки в центре 35 мм Дельта TPG блюдо с 1 мл изотонического вырезать 200 Тироде Решение снизить распространение через блюдо.
9. Определить количество неповрежденных одиночных волокон в гиш использованием рассечение микроскоп. Добавить дополнительные аликвоты FDB волокон для получения 3-4 неповрежденные волокна на блюдо.
10. Храните дополнительные изолированные мышечные волокна при 4 ° С и использовать в течение 6 часов.

3. Fluo-4 утра Краска Погрузка и Са ^{2 +} томография (Спаркс Измерение)

1. Передача 500 мл изотонического раствора Тироде из сосуда с гальваническим FDB волокон в трубку 10 мл Fluo-4 утра наличии (1 мМ), перемешать и добавить обратно в чашку до конечной Fluo-4 AM концентрации 10 мМ. Кроме того, Pluronic кислота может быть использована для повышения эффективности красителем.
2. Загрузите в течение 60 мин при комнатной температуре в темноте.
3. Вымойте волокна, тщательно растягивая 500 мл Fluo-4 утра, содержащих Изотонический Тироде Решение от блюда с неразрезанного 200 мл-пластиковые пипетки наконечник и заменить равным объемом свежего Изотонический Тироде Solution.
4. Повторите эту процедуру еще 3 раза.
5. Для визуализации функции митохондрий, передать 500 мл ИсотоNIC Тироде Решение от блюдо с FDB волокон в трубке 5 мл TMRE складе (1 мм), перемешать и добавить к блюду для конечной концентрации 50 нМ.
6. Инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин.
7. Промыть волокон, тщательно растягивая 500 мл TMRE содержащих Изотонический Тироде раствора из сосуда с неразрезанного 200 мл пластиковую микропипетки наконечник и заменить с равным объемом свежего раствора Тироде Изотонический.
8. Повторите эту процедуру еще 3 раза.
9. Перенести блюдо в конфокальной микроскопии и выберите нетронутыми волокна с четкими страт и гладкой мембраны сарколеммы для экспериментов.
10. Расположите кончик системы перфузии 400-500 мкм от целевой мышечных волокон и от центра с помощью элементов управления Микроманипулятор.
11. Начните поток Изотонический Тироде решения для обеспечения волокно FDB остается на месте.
12. Запишите сигнала флуоресценции от Fluo-4 утра с 40Х иммерсионным объективом и возбуждают Fluo-4 утра саргон лазерные (длина волны возбуждения 488 нм) и запись выбросов сигналы (длина волны 510-580 нм). Интенсивность флуоресцентного сигнала пропорциональна относительной уровня внутриклеточного Са ^{2 +} концентрации ([Са ^{2 +]} _I).
13. Вызвать Са ^{2 +} переходных путем изменения осмотического давления внеклеточного раствора с целью получения осмотического стресса на волокна. Первоначально заливать волокна с изотонический раствор Тироде (290 мОсм) (базовый уровень сбора в течение 60 секунд), а затем раствором Гипотоническая Тироде (170 мОсм) за 100 сек, чтобы вызвать отек. Заливать волокна FDB назад с изотонический раствор Тироде. Как правило, только один осмотический шок применяется к одной цельной волокна в одном дельта ТПГ блюдо и свечей событий в прошлом 10 мин для получения данных.
14. Запись пространственная локализация Ca ^{2 +} искр (рис. 2) с использованием временных рядов из ху двумерных изображений со скоростью сканирования 166 LPS (линий в секунду, Е.А.ч Линия состоит из 512 пикселей, приводящих к 3,08 сек / кадр) для каждого условия изотонического (1 мин), гипотоническая стресс (100 сек) и пост-гипотоническая стресс (5 мин). Храните сигналы для автономного анализа позволяет оценить распределение и частоту Ca ^{2 +} искр после завершения эксперимента.
15. Найти новую волокна на новое блюдо и следовать той же протокол осмотического шока, чтобы побудить Са ^{2 +} переходных процессов. Используйте конфокальной строчной развертки (х) режим (512 пикселей в длину, частоту дискретизации 2 мс / строчной развертки для записи Са ^{2 +} переходных течение одной минуты (т.е. 30 000 строк) с конфокальной сканирующей строке помещены непосредственно под сарколеммы мембраны (рис. 3 ). Измените сканирование строки для различных фокальных плоскостях записать три последовательные наборы (с интервалом 1-мин) linescans для анализа величины и кинетики отдельных Ca ^{2 +} искр.

4. Анализ данных

1. Соберите большое количествохи линия сканирования следы оценить морфологию и кинетики отдельных Ca ^{2 +} искр параметров, т.е. амплитуды (F / F _0; где F ₀ является отдыхает Са ^{2 +} флуоресценции), время нарастания, время пиковой, продолжительность (FDHM , полный срок на половину величины), и пространственная ширина (FWHM, полная ширина на половине величины) из записанных искр. Эти параметры представляют собой основные литниковые свойства RYR Ca ^{2 +} каналов, таких как Ca ^{2 +} потока (амплитуды), и стробирующие кинетика RYRs (продолжительность).
2. Анализ данных цифрового изображения с пользовательским развитая, полуавтоматической алгоритма, который был создан с языка обработки изображений IDL (Interactive Data Language), как описано выше ^11,16. Потому что уникальные кинетика Ca ^{2 +-релиз} в случае Ca ^{2 +} искр, вызванных в FDB волокон осмотического стресса, лучше объединить ручные и автоматические особенности Ca ^{2 +} искра событияобработки и идентификации с этими программами анализа заказ сборки изображения ^11. Этот алгоритм очень полезен, когда необходимо вручную определить ROI (область интереса) в некоторых моделях болезни мышц. После того, как ROI определяется, алгоритм может автоматически вывести вышеупомянутые параметры свечи, которые затем могут быть экспортированы в Excel файл. Кроме того, общественность доступное программное обеспечение для обработки изображений, например SparkMaster в ImageJ, может быть использован для определения кинетических свойств Са ^{2 +} искр и их пространственное распределение в скелетных мышцах ^17.

Результаты

Более ранние исследования показали, что переходный гипоосмотического стресс, вызванный периферийных Ca ^{2 +} искры рядом с сарколеммы мембраны интактных мышечных волокон ^11. На рисунке 1 показаны образы неповрежденных отдельных мышечных волокон с гладкой мембраны сар...

Обсуждение

Это метод оценки Ca ^{2 +} искры в неповрежденном скелетных мышц является полезным инструментом для мышечной физиологии и исследования болезни. Мы показали, что Ca ^{2 +} искра ответ был изменен в различных условиях, в том числе мышечная дистрофия ^11, старение ^{_18, 19,} а т?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting microscope			Dissect out fibers and check muscle integrity
Dissection tools -scissors and fine tip forceps	Fine Science Tools
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	DOW CORNING	184 SIL ELAST KIT	Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60 mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become a clear, colorless solid substrate.
60 mm glass Petri dish	Pyrex	3160	Fiber dissection
Isotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Minimal Ca2+ Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Hypotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Collagenase type I	Sigma-Aldrich	C-5138	Fiber digestion
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201	Fluorescent Ca2+ imaging dyes
TMRE	Invitrogen	T669	mitochondrial membrane potential fluorescent dyes
Delta TPG dishes	Bioptechs	0420041500C	35 mm glass bottom dish for imaging
Spark Fit software			data analysis software
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope	Bio-Rad
3 Axis Micromanipulator	Narishige International	MHW-3
Temperature controllable orbital shaker	New Brunswick scientific		Fiber dissociation