למתוח בתאי אנדותל כלי הדם במוח (cEND) כ<em&gt; במבחנה</em&gt; פגיעה מוחי טראומטי דגם של מחסום דם המוח

Summary

במבחנה מודלים פגיעה מוחית טראומתיים מפותחים להתרבות בעיוות מוח vivo. פגיעה הנגרמת על מתיחה כבר מועסק להאסטרוציטים, נוירונים, תאי גלייה, אבי העורקים, ותאי האנדותל במוח. עם זאת, המערכת שלנו משתמשת במחסום דם מוח (BBB) ​​דגם בעל תכונות שמהוות מודל לגיטימי של BBB להקים במודל TBI מבחנה.

Abstract

עקב אירוע התמותה הגבוהה הביא על ידי פגיעה מוחית טראומטית (TBI), שיטות שתאפשר אחד כדי להבין טוב יותר את המנגנונים מעורבים בזה הם שימושיים לטיפול. ישנן גם in vivo ו במבחנת שיטות זמינות למטרה זו. במודלי vivo יכולים לחקות פגיעת ראש בפועל כפי שהוא מתרחש במהלך TBI. עם זאת, בטכניקות vivo לא יכול להיות מנוצל ללימודים ברמת הפיסיולוגיה התא. לפיכך, בשיטות מבחנה הם יתרון נוסף למטרה זו מכיוון שהם מספקים גישה קלה יותר לתאים והסביבה תאית למניפולציה.

הפרוטוקול שלנו מציג במודל חוץ גופית של פציעת מתיחה באמצעות TBI בתאי אנדותל כלי הדם במוח. הוא מנצל את לחץ המופעל על התאים בתרבית בבארות גמישות תחתיות. הלחץ המופעל יכול בקלות להיות בשליטה ויכול לייצר פגיעה שנעה בין נמוך לחמורים. העכבריתאי אנדותל כלי הדם במוח (cEND) שנוצרו במעבדה שלנו הוא מודל מתאים היטב למחסום דם המוח (BBB) ​​ובכך מתן יתרון למערכות אחרות המעסיקות בטכניקה דומה. בנוסף, בשל הפשטות של השיטה, משוכפלים להגדיר קופצים ניסיוני בקלות. לכן, מודל זה יכול לשמש בחקר המנגנונים התאיים ומולקולריים המעורבים בTBI בBBB.

Introduction

פגיעה מוחית טראומטית (TBI) היא אחד הגורמים המובילים למוות בעולם. כ -10 מיליון בני אדם מושפעים מדי שנה על ידי שהופך אותו TBI בריאותי משמעותי והבעיה רפואית ^1. בשל כך, שונים in vivo ו במודלים חוץ גופית של TBI כבר הוקם ופותח על מנת ללמוד מנגנוניה ^2,3,4. הבנה טובה יותר של TBI יכולה לעזור לשפר את הטיפול בחולה ולהפחית את התמותה המשויכת, תחלואה, ועלות.

מודלים רבים לפגיעה מוחית אשר מנצלים גם in vivo ו במבחנת שיטות קיימים. במודלי vivo יכול לחקות את האירוע הממשי של פגיעת הראש. עם זאת, בשל מורכבותו של מצב vivo, נגישות לרקמות של עניין הופך להיות מוגבל ^2. בהבנה את התגובה הפיזיולוגית של תאים בודדים, כתוצאה מפגיעה שנגרמה, חשוב שהתאים מבודדים מההשפעות המערכתיות אשרעלול לעכב או לשנות את תגובת ⁵ פרט. מסיבה זו, מודלים סלולריים של טראומה מספקים יתרונות חשובים על פני מודלים של בעלי חיים מאז הסביבה מכאנית של התאים ניתן לשלוט בדיוק ^6.

במערכות מבחנה שמעסיקות את השימוש של עומס מכאני לתאים או רקמות כדי לקבוע שינויים הנגרמים על ידי שיטה כזו של פגיעה פותחו. לדוגמה, שיטה ללימוד ההשפעה של פגיעה מכאנית לתאים כבר נקבעה להאסטרוציטים, נוירונים, תאי גלייה ותאי האנדותל אבי העורקים ^7,8,9. במודל טראומת מבחנה שהוקם לחקר מכרסמים ותגובתיות astrocyte אנושי ¹⁰ הועסקה מכשיר שליטה בלחץ זהה למה שאנו משתמשים למודל שלנו. אותה השיטה יושמה כדי לגרום ניזק ע"י מתיחה בתאי עכבר מוח microvessel אנדותל (bEnd3) ¹¹ ו נוירונים בקליפת המוח ^12,13 וכן, endoth מוחיןתאי elial מחזירונים יילוד ^14. מכשיר deforms התחתון של התרבות היטב וכך לייצר מתיחת פגיעה מכאנית ^10. היא גורמת פגיעה על תאים בתרבית על ידי היישום של לחץ אוויר מעל לתאים. לחץ זה יכול להסיט את הקרום שעליו התאים גדלים, ובכך מותח את התאים. דרגות שונות של מתיחה (כלומר "נמוך," מתון ", או" חמור ") יכולות להיות מושגת על ידי קביעת משך דופק לחץ האוויר ועצמת בהתאם. שיטה זו של פגיעה הנגרמת על מתיחה כבר בקורלציה עם פגיעה טראומטית בvivo ^7. יתר על כן , שיטה זו של פציעה מאפשרת שליטה המדויקת של הסביבה תאית והוא יכול בקלות להיות מועתק.

למרות שגישה דומה הייתה בשימוש כבר הרבה סוגי תאים אחרים במוח כולל bEnd3, המודל שלנו הוא של יתרון בכך שהוא עושה שימוש בתאי אנדותל כלי הדם במוח העכבריים (cEND) שנוצרובמעבדה שלנו. קו זה תא הוא מודל מתאים היטב למחסום דם המוח (BBB). בתרביות תאים במבחנה המשמשות כמודלים BBB צריך להחזיק מאפיינים שיאפשר להם לשמש כמסך חדירות. קריטריון חשוב אחד במודל תאים במבחנה להיות מנבא של חדירות BBB הוא שזה צריך להחזיק ארכיטקטורת תא פיזיולוגית מציאותית ^15. למרות bEnd3 תאים ייחודיים להציג ציר דמוי קשקש מורפולוגיה בתרבות ^16, הם מפגינים התנהגות המוךפו"גנטי סדירה במבחנה שבו הם יוצרים חללים דמויי ציסטה ולא את המבנים צינורי הרגילים בפיברין ג'לי ^17. יתר על כן, כאשר התאים הוזרקו לעכברים עובריים ואת הרך הנולד, הם מושרה במהירות צמיחה גידולים קטלניים לעכברים עובריים, אך לא בעכברי בני יומם וצעירים. הוא הציע ובכך שאחד או יותר מתהליכים המסדירים את צמיחה נורמלית, הגירה, ובידול האנדותל שונו או eliminatאד בקו תא זה ^18. מצד השני, הערכה מורפולוגית, immunocytochemical של מדידות שטף האנדותל וביטוי סמן BBB, bioelectric, ולהוכיח כי paracellular BBB המודל cEND שלנו היא אכן מודל מתאים של BBB ^19.

האנדותל מוח in vivo מאופיין בחדירות הדוקות ביותר עם ​​התנגדות חשמלית טרנס אנדותל (TEER) נעה בין 2,000-5,000 Ωcm ^2. ללימודים של נכסי מכשול microvasculature מוח לתרופות, יש לשקול מגבילי paracellular ואטימות של התאים. ברוב תאי אנדותל נימי במוח (BCEC), זה לא נשמר כTEER תערוכת התאים הנע 50-100 Ωcm ^{2 20.} BEnd3 שורת תאי אנדותל המוח הונצח מייצר ערכי TEER של לא יותר מ -60 Ωcm ^{2 15.} בניגוד התמיינות של תאי cEND עם מדיום המכיל סרום מופחת תצוגהערכים הנעים TEER 300-500 Ωcm ^{2 19,21.}

עד כה, במודלים חוץ גופית של פגיעת מתיחה בתאי האנדותל במוח בתרבית הם נדירים. לפיכך, במודל חוץ גופית לטראומה בגלל פציעת מתיחה באמצעות תאי מוח אנדותל בתרבית המשמשים כמודל של BBB עשוי להיות שימושית. בפרוטוקול זה, אנו מציגים מודל במבחנה שיכול לחקות את ההשפעה בפועל שתאי מוח, תאי אנדותל כלי הדם במוח במיוחד של BBB, מקבלים במהלך TBI. היתרון העיקרי של מודל זה הוא שהסכום של פגיעה מוחל על התאים, כמו גם ניתן לשלוט בקלות בסביבה תאית באופן מדויק המאפשר שחזור קל של ניסיוני ההגדרה.

Protocol

1. זריעה של תאי האנדותל לתוך צלחות גם

1. טפח את תאי אנדותל כלי הדם במוח עכבריים (cEND) בבקבוק התרבות T75, שינוי המדיום (DMEM המכיל 10% FCS, 50 U / ml פניצילין / סטרפטומיצין, 1% L-גלוטמין) פעמיים בשבוע, עד שיגיע למפגש. (לדור וההנצחה של תאי אנדותל כלי הדם במוח, אנא עיין Burek et al, 2012;. פורסטר ואח', 2005 ^21,19.).
2. לשטוף את התאים עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS). הסר את PBS וtrypsinize את התאים עם פתרון טריפסין-EDTA חם 2 מ"ל.
3. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות או עד ששכבת התאים מפוזרת.
4. הוסף 8 מיליליטר מדיום התרבות לתוך התאים. הקש בקבוק מספר פעמים לנתק את התאים.
5. צפה בתאים מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח ניתוק מוחלט מבקבוק.
6. בינוני פיפטה עם תאים מנותקים למעלה ולמטה. מערבולת את הבקבוק כדי לערבב suspensi התאב.
7. קח 20 μl של ההשעיה התא, הכניס לתוך hemocytometer ולספור את מספר התאים.
8. לקבוע את צפיפות תאי זרע ו20,000 תאים / ² ס"מ לתוך הבאר.
9. מעבירים את ההשעיה התא לתוך collagen1 precoated תרבות צלחות 6 גם גמישה בעל תחתית (57.75 ס"מ ²⁾ בהיקף כולל של 3 מ"ל / היטב. לכל אחד יש גם שטח של 9.62 ס"מ ^2.
10. לגדל את התאים על 37 מעלות צלזיוס למשך שבוע עד שמחוברות אחת. לשנות את התרבות בינוני פעמיים בשבוע.

2. התמיינות תאים לפני הפגיעה הנגרמת על מתיחה

1. לשנות את התרבות בינונית של התאים עם מדיום התמיינות (DMEM המכיל 1% סרום-הפשיטו עגל בסרום עוברי (ssFCS), 50 U / ml פניצילין / סטרפטומיצין).
2. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.

3. פגיעה הנגרמת על מתיחה של תאי האנדותל

1. הפעל את התקן בקר פציעת התא.
2. הגדר את העיכוב עד 50 אלפיות שנייה.
3. הגדר את לחץ הרגולטור ל -15 PSI ולחץ על ההדק כמה פעמים, עד שלחץ השיא הרשום הופך להיות יציב.
4. הגדר את לחץ הרגולטור לערך הרצוי. השתמש בטבלת מס '1 כמדריך ליצירת דרגות שונות של פציעת מתיחה.
5. מניחים את צלחת התרבות גמישה בעל תחתית 6 היטב (57.75 ס"מ ²⁾ למחזיק המגש. ודא כי הבורר גם מוגדר היטב בגודל הנכון (כלומר גם גדול).
6. הנח את תקע מתאם חוזקה מעל הבאר. החזק את התקע בחוזקה למקומו ביד אחת ואילו השני דוחפת את היד על ההדק.
7. רשום את שיא הלחץ שנוצר.
8. מייד לשים את הצלחת בחזרה לתוך 37 ° C חממת האורך הרצוי של זמן או להשתמש באופן מיידי להצלחת ניסויים או הערכה.

4. הערכה של פגיעה למתוח על ידי assay ספיג דיי

1. מייד לאחר שהתאים היו strחרוט (שלב 3.7), להוסיף 30 μl של פתרון 1 מ"ג / מ"ל של כדאיות כתם שפועל כסמן cytotoxicity (ראה בטבלת משלים של חומרים וציוד) למדיום הסלולרי התרבות (הערה: 10 μl של הפתרון לצבוע הוא לשמש עבור כל מ"ל של מדיום תרבות תאים).
2. עם התוספת של הצבע לתאים, להציג באופן מיידי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

5. הערכה של פגיעה על ידי מתיחת קטט דהידרוגנאז (LDH) שחרור

1. מייד לאחר מתיחת התאים (שלב 3.7), להסיר 200 μl של מדיום תרבית תאים מהבאר. לעשות את אותו הדבר עבור כל נקודת זמן שלאחר פציעה שאתה רוצה לכלול בחקירה של LDH שחרור שלך (כלומר, לדוגמה: 30 דקות, שעה 1, 2 שעות, וכו '.)
2. צנטריפוגה תרבית תאים בינוניות בהגדרה הגבוהה ביותר של microcentrifuge במשך 5 דקות כדי להסיר כל פסולת תא. הסר את supernatant ולהשתמש בזה לשלבים שאחריו.
3. ברגע שאתה hשד 'סיים שלב 5.1 ולקח את הדגימות הדרושות שאתה רוצה יש לי מהנקודות הזמן השונות שהיית רוצה לחקור, lyse התאים באמצעות פתרון תמוגה הכלול בערכת LDH assay (ראה בטבלת משלים של חומרים וציוד).
4. שים 100 μl של מדיום assay נכלל בassay kitto כל גם צלחת 96 בארות המסופקת בערכה.
5. שים 100 μl של מדיום תרבית התאים ללא תא לשתי בארות מקבילות של צלחת 96-בארות כלולות בערכת assay.
6. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
7. קראו את הספיגה ב 492 ננומטר.

תוצאות

תאים בתרבית על קולגן אני precoated תרבות צלחות תחתיות 6 גם גמישות (57.75 ס"מ ²⁾ נחשפו לדרגות שונות של פציעת מתיחה באמצעות המכשיר הסלולרי של האלונקה. לאחר חשיפת התאים לפגיעה, הם נבדקו תחת המיקרוסקופ לתופעות של פגיעה הנגרמת מתיחה למורפולוגיה של תאים. זה היה ציין כי מידה כמו גדולה יותר של קטע הייתה מוחלת על התאים במידה רבה יותר של עיוות תא גם יכולה להיבחן (איור 1). כפי שניתן לראות באיור 1 א, תאי בקרה שלא היו נתונים לפגיעה מופיעים תאי אנדותל כלי דם במוח כצורה באופן קבוע (cEND) ללא כל אינדיקציה לנפיחות תא או עיוות. כאשר פציעת מתיחה יושמה (איורים 1 ב-D), עיוות יכולה להיבחן תחת מיקרוסקופ האור. לאחר מתיחת התאים קשה עם לחץ שיא בין 3.5-4.5 PSI, תאי cEND הופיעו חזר בו במידה ניכרת, נפוח ומעוות עם לא מרחבים אינטר מסוגלים. בנוסף, ספיגה של כדאיות כתם (ריכוז 100 ננומטר סופי) עלתה גם היא כמידת פגיעת מתיחה הוגדלה (איור 2). הכדאיות בשימוש הוא כתם צבע impermeant לתאים בריאים שהופך permeant כאשר שלמות קרום הפלזמה של תאים נפגעת. הצבע לא נכלל רוב תאי הבקרה, ולכן, רק מעטים מהתאים היו מוכתמים (איור 2 א), בהשוואה לתאים מתוחים (איורים 2 ב-D). יותר תאים fluoresced ירוקים עם מידה מוגברת של פגיעה במתיחה.

כסמן ביוכימי של פגיעה, שחרורו של קטט דהידרוגנאז (LDH) אנזים נבחן גם על פי הוראות יצרן. איור 3 מראה כי פציעת מתיחת תא הגדלת נגרמה שחרור הגדלת LDH.

928/50928fig1.jpg "width =" 500px "/>
איור 1. בחינת אור מיקרוסקופית של תאים נורמלים לעומת פצועים. () monolayer תא מחוברות unstretched רגילה ארזה istightly והמוארכת. כאשר תאים נמתחו על ידי יישום לחץ דופק שיא של 1.8-2.0 PSI (מתיחה נמוכה, כלומר) הם מופיעים פחות קומפקטי, מרחבים מסומנים על ידי חצים (ב '). כאשר התאים שנפצעו באורח בינוני עם דופק שיא לחץ 2.5-3.0, חלקם הופיעו נפוח ומעוות (C). התאים הופכים חזרו עם מתיחה חמורה של 3.5-4.5 psi, כפי שצוין על ידי חץ (ד '). ההגדלה 100x. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2. פלואורידבדיקה מיקרוסקופית של escence תאים נורמלים לעומת תאים פגועים טופלו 2hr כתם כדאיות לאחר פציעה: תאי בקרת unstretched BD: תאים מתוחים (B - נמוך, C - מתון, D - חמור).... ההגדלה 100x. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3. שחרור חומצת החלב דהידרוגנז LDH () אנזים לsupernatant לאחר פציעת מתיחה. LDH משתחררים למדיום התרבות נמדד במרווחי זמן שונים לאחר פגיעה הנגרמת מתיחה. LDH בא לידי ביטוי כאחוז מסך releasable LDH LDH (בתקשורת בתוספת תאים). ערכים הם ± SEM. N עבור כל נקודת זמן הוא 5, פרט ל0 HR Value נתון למתיחה חמורה כאשר n = 3. שחרור LDH מהתאים שהיו נתונים למתיחה נמוכה ובינונית לא היה שונה באופן משמעותי מזו של פקדי unstretched ואחד מהשני. תאים שנמתחו קשות שחררו כמות גדולה יותר באופן משמעותי של LDH בהשוואה לכל דוגמאות אחרות, למעט המדגם נמתח במתינות בשעה 1. (P <0.05, גורם אחד ניתוח שונה, שיטה הולם-Sidak). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

טבלת מס '1. מדריך ליצירת דרגות שונות של פציעת מתיחה.

לחץ רגולטור	לחץ שיא	מידת הפגיעה
15 psi	1.2-1.5 PSI	<נמוך
20-25 psi	1.8-2.0 PSI	נמוך
30-35 psi	2.5-3.0 PSI	למתן
40-50 psi	3.5-4.5 PSI	חמור
60 psi	4.8-6.0 PSI	> חמור

Discussion

את ההשפעות של פגיעה מכאנית במבחנה נחקרו ושיטות הוקמו במשך האסטרוציטים, נוירונים, תאי גלייה ותאי האנדותל אבי העורקים ^{8, 9, 22.} יש, עם זאת, נכון להיום עדיין לא ידוע במודל במבחנה של פציעת מתיחה בתאי האנדותל במוח בתרבית. מודלים סלולריים של טראומה מספקים יתרונות חשובים על פני מודלים של בעלי חיים מאז הסביבה מכאנית של התאים ניתן לשלוט בדיוק ^6. לפיכך, במודל חוץ גופית לטראומה בגלל פציעת מתיחה באמצעות תאי מוח אנדותל בתרבית המשמש כמודל של מחסום דם המוח (BBB), כגון מה מתנות הפרוטוקול שלנו עשויות להיות שימושית.

פרוטוקול זה עושה שימוש בתאי cEND, מודל שהוקם BBB במעבדה שלנו. מאז התמוטטות BBB לעתים קרובות תועדה בחולי TBI וTBI קשור לעתים קרובות לשיבוש BBB אשר עלול לגרום להיווצרות בצקת ^{23, 24,} שיטת prèsented כאן עשויים דווקא לשמש בביצוע מחקרי BBB ביחס לTBI.

במודל זה, חשוב לטפל בכמה מעלות מפציעת מתיחה מוחלות על התאים. באותה מידה כמו התאים נפצעו בכל מקרה, ועם כל מה כמות הלחץ מוחל, מידת פגיעה שיכול להשפיע על תאי האנדותל שונה בהרבה מאוד מסוגי תאים אחרים. תאי האנדותל אבי העורקים הם עמידים יותר בפני פגיעה מלמתוח האסטרוציטים או תאי גלייה מעורבים ^9. בנוסף, הם לתקן במהירות רבה יותר לאחר פציעה בהשוואה לסוגי התאים האחרים. לכן, לתאי מוח, תאי אנדותל במיוחד cEND, כמות גדולה יותר של פציעת מתיחה יש צורך לייצר רמה גבוהה של פציעה. אפשר להשיג את המידה הרצויה של פגיעה על ידי יישום הלחץ המקביל שצוין בטבלת 1. לתאי cEND, לעומת זאת, פגיעה קשה היא מועדפת בשל התנגדותם למתח. מבחני שנערכו הראו LDHשככל שהמידה של עליות מתיחה, יותר LDH מופרש לתוך הנוזל העליון. לעומת זאת, בתאים שקבלו כמות נמוכה של פציעת מתיחה הופקו LDH בסכום דומה כדי לשלוט בתאים. כפי שצוין בפרוטוקול, יש לדאוג שהכמות המתאימה של מדיום משמשת מאז עלייה או ירידה בכמות בינונית עלולה לגרום להבדלים בלחץ השיא להחיל את הבארות. לדוגמה, המכיל 5 מ"ל גם של נוזל רושם שיא בלחץ הממוצע של 4.0 PSI ואילו גם ריק רושם ממוצע של 3.8 PSI כאשר לחץ psi 45 מוחל. לכן, הדרך הטובה ביותר הוא לדחוף את ההדק מספר פעמים על שליטה גם על מנת להבטיח כי לחץ השיא שיופק מתאים לכמות הרצויה.

בניסויים שלנו השתמשנו כדאיות כתם כדי לקבוע את האפקט של מתיחה לחדירות של קרום התא. אופטיקה של צלחות התרבות גמישות התחתיות ששמשנו אותנו מאפשרת לנו VIEW התאים המוכתמים ישירות מתחת למיקרוסקופ. עם זאת, כשרוצים לבצע מחקרי immunolabelling ישירות לאחר המתיחה פציעה, עלולים להתעורר קשיים. ראשית, בגודל ובעובי של הצלחת עלול להוות בעיה עם כמה פלטפורמות צפייה מיקרוסקופ. שנית, אופטיקה של הקרום גמיש של גם עשויה להיות מכשול כדי לנקות צפייה.

למרות המגבלות הנ"ל, לעומת זאת, הליך המתואר יכול לשמש כמודל לפגיעה מכאנית במבחנה של BBB. פגיעה מוחית טראומטית (TBI) כוללת שני רכיבים, כלומר, איסכמיה וטראומה. איסכמיה יכולה להתרחש כפגיעה משנית בעקבות TBI במקרים שבם יש אובדן דם חמור וכתוצאה מכך לחץ דם נמוך או כתוצאה מנפיחות במוח המגביל את אספקת חמצן למוח. זה נחשב נזק מושהה, nonmechanical מייצג תהליכים פתולוגיים ברציפות ביוזמת ברגע של פציעה ^25. המופע של היפוקסיהפגיעה מוחית טראומטית חמורה חרו נפוצה ^26. קיפוח גלוקוז חמצן (OGD) הוא השיטה כרגע בשימוש לאיסכמיה מודל במבחנה. לפיכך, חשיפת תאים לOGD כעלבון משנית לתאים לאחר מתיחה יכולה לחקות את השכיחות של TBI אחרי איסכמיה. לפיכך, כדי לשפר את המודל הנוכחי שלנו במבחנה של TBI ודפוס זה קרוב ככל האפשר לTBI בפועל כפי שהוא מתרחש in vivo, בעתיד אנחנו גם יעסיקו OGD בשילוב עם פציעת מתיחה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Injury Controller II	Custom Design and Fabrication, Virginia, USA
Bioflex Culture Plate - Collagen Type I	Flexcell, Dunn Labortechnik	BF - 3001C
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796
Fetal Calf Serum (FCS)	PAA Laboratories	A15110-1333	final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 °C)
L-glutamine	Biochrom AG	K0282	Storage: ≤ -15 °C
MEM Vitamin	Biochrom AG	K0373	Storage: ≤ -15 °C
Na-pyruvate	Biochrom AG	L0473
Non-essential amino acids (NEA)	Biochrom AG	K0293	Storage at 4 °C
Penicilin/Streptomycin	Biochrom AG	A2212	Storage: ≤ -15 °C
Fetal Calf Serum, charcoal stripped (ssFCS)	Life Technologies	12676-011
Trypsin-EDTA solution	PAA Laboratories	L11-004	Storage: ≤ -15 °C
Image-iT DEAD Green	Life Technologies	I10291	Storage: ≤ -15 °C, protected from light
Cytotoxicity Detection Kit PLUS (LDH)	Roche	4744926001	Storage: ≤ -15 °C