במדידת רחם של קצב לב בעכבר על ידי אקו M-המצב פולשנית

Summary

אולטרסאונד בתדירות גבוה במיוחד הוא כלי הדמיה חיה רב עוצמה כדי לבחון מומים לב בבעלי חיים קטנים. noninvasiveness שלו מאפשר שמירה על המצב הפיזיולוגי של עוברים. בזאת, אנו מציגים את השימוש באולטרסאונד M-mode כדי למדוד את קצב הלב של עוברים בE18.5 ברחם.

Abstract

מחלת לב מולדת (CHD) היא הגורם המידבק השכיח ביותר למוות בלידה. השכיחות של מחלת לב כלילית נעה 4-50 / 1, 000 לידות (מחלות ואומדני פגיעה אזוריים, ארגון בריאות עולמי, 2004). ניתוחים שלעתים קרובות להתפשר על איכות החיים נדרשים לתיקון מומי לב, מזכירים לנו את החשיבות של מציאת הגורמים למחלת לב כלילית. מודלים עכבר שעברו מוטציה וטכנולוגיה הדמיה לחיות הפכו לכלי חיוני ללמוד אטיולוגיה של מחלה זו. למרות שיטות מתקדמות מאפשרות הדמיה חיה של לב חריג בעוברים, המדינות הפיזיולוגיות והמודינמית של זה האחרון לעתים קרובות נפגעים כתוצאה מניתוחים ו / או ארוכים. אולטרסאונד הדמיה לא פולשנית, לעומת זאת, ניתן להשתמש ללא ניתוח חושף את העוברים, ובכך שמירה על הפיסיולוגיה שלהם. בזאת, אנו משתמשים באולטרסאונד M-מצב פשוט כדי להעריך את קצב לב של עוברים בE18.5 ברחם. זיהוי של קצב לב לא תקין הוא אכן אינדיקה טובהטור של חוסר תפקוד של לב ובכך מהווה שלב ראשון בזיהוי של ליקויים התפתחותיים שעלולות להוביל לאי ספיקת לב.

Introduction

מחלת לב כלילית הוא הגורם המידבק השכיח ביותר למוות בלידה ^1. ניתוחים רבים לעתים קרובות יש צורך לתקן את הליקויים המבניים בנושאי איכות החיים, שעשוי להישאר בסכנה ^1. ילדים עם מחלת לב כלילית בתדירות גבוהה לפתח הפרעות נוירולוגיות גם אם הם לא עברו ניתוח, מה שמעיד חשוב בהשלכות רחם על ^2,3 פיתוח. גורמים גנטיים והן סביבתיים, כגון חשיפה לוירוסים או חומרים כימיים (אלכוהול) במהלך הריון, מחלת לב כלילית גורם. לומדים תורמים הגנטיים הוא עדיין בשלב המוקדם שלה, אבל גדל במהירות. לזהות התורמים האלה ולהבין את תפקידם בהתפתחות לב, Phenotyping עכברים שעברו מוטציה עם כלי פשוט ורב עוצמה יהיה מאוד מועיל.

עכבר הוא אכן מודל חיה של בחירה ללמוד מחלת לב כלילית, ורוב המקרים של בני אדם יכול להיות מועתק בעכברים ^4,5. כתוצאה מכך, phenotyping לב עוברי בעכבר הפך incחשוב reasingly לחקור אטיולוגיה של מחלת לב כלילית אדם ודורש כלים מתאימים. למרות שמחקרים היסטולוגית על דגימות קבועות הם לא יסולא בפז, הדמיה של בעלי חיים בזמן אמת היא חיונית כדי להבין את הפיסיולוגיה של הלב. מיקרוסקופיה וידאו מציעה הדמיה לחיות. עם זאת, זה דורש laparotomy לחשוף עוברים, וכך לפגוע במדינה הפיזיולוגית והמודינמית שלהם. לאחרונה, אקו הפך את טכניקת ההדמיה סטנדרטית להערכות לב במרפאת, כמו גם בעכברים.

אקו העוברי בעכבר מתבצע באמצעות מערכות סטנדרטיות קליניות אולטרסאונד, כמו גם מערכות אולטרסאונד אולטרה תדירות גבוהה. האחרון מספק 30 MHz או מתמרים תדר גבוה יותר שיוצרים דימויים דו ממדים ולאפשר ההערכה של שלבים עובריים המוקדמים. יש לי מתמרים אלו עומק חדירה נמוך יחסית (~ מ"מ 13), שהוא, לעומת זאת, מספיק כדי להשיג מטוסי הדמיה נאותים ולקבוע הרשות לב בסיסיתrameters, כגון קצב לב, בקוטר הפנימי של חדר שמאל וימין בירוויח והתכווצות ומחצה ועובי קיר, בלי לבצע פיום בטן.

במחקר שלנו, יש לנו בשימוש מערכת אולטרסאונד-Ultra High Frequency כדי להעריך את קצב לב של עוברי עכברים בE18.5 היום עוברי. בחרנו מתמר 30 MHz המספק תצוגת תחום 20 מ"מ x 20 מ"מ, שהוא אידיאלי בהתחשב בגודל של העוברים, עם אורך מוקד של 12.7 מ"מ. עם זאת, מתמר תדר גבוה יותר ניתן לבחור כדי לנתח שלבי התפתחות מוקדמים יותר. M-המצב שנבחר מאפשר ההדמיה של רקמות בבזכות תנועה לרזולוציה גבוהה זמנית של 1,000 מסגרות / sec. ההליך המלא הוא פשוט וצריך להתבצע במהירות אפשרית, כדי למנוע כל הפרעה של המדינות הפיזיולוגיות והמודינמית של העובר. הניתוח של כ -8 עוברים דורש כ 1 שעות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הנהלים שמוצגים בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים IRCM.

1. אולטראסאונד מערכת ותחנת הכנה

1. הפעל את מערכת ההדמיה אולטרסאונד ולהתחבר scanhead כמו גם את יחידת הבקר פיזיולוגיה על פי הוראות היצרן (איור 1). בחר לב תכנית המדידה וscanhead שמתאים למתמר 30 MHz.
2. מלא מזנקים של scanhead עם מים deionized. למנוע בועות אוויר כמו שהם מפריעים להדמיה ברזולוציה. הנח את scanhead עם צד הידית עד למחזיק בה בסמוך לפלטפורמת ההדמיה (איור 1 א).
3. לחטא את פלטפורמת ההדמיה ופינת עבודה.
4. למלא לגמרי את הבקבוק של ג'ל אולטרסאונד, כדי למנוע היווצרות של בועות ולמקם אותו במהופך בסט מיכל prewarming 37 ° C (איור 1).
5. בדוק את הרמות של Oxygen ומערכת צינורות להרדמה isoflurane ו. ניסוי אחד עם ~ 8 עוברים ישתמש כ 15-20 חמצן L.
6. מניחים את הבקבוקים של מרככי עיניים, קרם מקריח וג'ל אלקטרודה ליד פלטפורמת ההדמיה (איור 1).
7. ודא שפונקציות מנורת חום אינפרא אדום. במהלך אימון, הגדר את רמת החום, את עמדתה של המנורה ואת המרחק של המנורה לעכברים כדי לשמור על טמפרטורת גוף קבועה וקצב לב.
   הערה: ההכנה נכונה של המערכת והחומר היא קריטית. הליכים ממושכים עשויים להשפיע על המאפיינים הפיזיולוגיים והמודינמית של עוברים כהרדמה ארוכה מדכאת את תפקוד לב על ידי הפחתת קצב לב, לחץ דם ורמת חמצון בדם. העיבוד בזמן ל~ 8 עוברים (גודל המלטה ממוצע בC57BL / 6) צריך להיות כ 1 שעות. זני עכבר אחרים עשויים לספק מספר גבוה יותר של עוברים, ואולי עם גודל נקבה גדול יותר. אימון הוא חיוני כדי לייעל את processiזמן ng.

2. עכבר הכנה

1. להרדים את הנקבה בהריון בתא עם אספקה ​​רציפה של 2% isoflurane בחמצן (200 מיליליטר / דקה) עד שהוא הופך nonresponsive.
2. הנח את העכבר על פלטפורמת ההדמיה במצב שכיבה, להתאים את הצינור לשאיפה מתמדת של isoflurane 1.5% בחמצן (200 מיליליטר / דקה), ולתקן את צינור שאיפה עם (איור 2 א) קלטת. הרדמה מספיק צריכה להיות אישרה במהלך ההליך על ידי התנוחה הנינוחה של העכבר והעדר כל תגובה לצובט זנב ובוהן.
3. ג'ל אלקטרודה המקום היחיד בחלק העליון השמאלי ורפידות האלקטרודה ימנית תחתונה (מימין קדמי רגל ורגל השמאלית אחורית, המכונה גם עמדה השנייה עופרת) לelectrocardiography. עופרת העמדה השנייה מספקת מוגדר טוב יותר P-גל זקוף חיובי וQRS מורכב כדי לקבוע את קצב לב. אבטח את ארבע כפות רגליים לכל משטח באמצעות (איור 2 א) קלטת. כדי למנוע יובש בעיניים, להחיל 1 טיפה שלמזור עיניים לכל עין.
4. לגלח את הבטן מחזה לשלפוחית ​​שתן עם גוזז שיער. לאחר מכן להחיל קרם מקריח למשך 2 דקות ונגב אותה בעזרת גזה ו / או מקלון צמר גפן כדי להסיר כל שיער שנשאר בזהירות. היזהר שלא לחתוך את הפטמות.
5. הכנס את המדחום prelubricated עם ג'ל אלקטרודה לתוך פי הטבעת של הנקבה כדי לפקח על טמפרטורת הגוף (יש לשמור על 37 ± 0.5 ° C על ידי התאמת מנורת חום אינפרא אדום ממוקמת מעל הפלטפורמה). קצב לב צריך להיות 450 ± 50 פעימות / דקה (BPM). טמפרטורה וקצב לב הן מוצגים ביחידת בקר פיזיולוגיה (איור 1).
   הערה: הרדמה ארוכה, נשירת שיער וג'ל קולי (אם כי prewarmed) יכולה להוביל להיפותרמיה, אשר יכול להשפיע על קצב הלב של הנקבה. אם טמפרטורת הגוף יורדת מתחת 36.5 ° C, להפסיק את ההליך ולשנות את עמדתה של מנורת החימום כדי להתאים את הטמפרטורה ואת קצב הלב. חכה כמה דקות befבצר ימשיך שוב.

3. זיהוי עובר

1. לחץ בעדינות מטה על הבטן בעירום כדי לאתר את העוברים. לאט ובקלילות פרוש להם יש רוב של עוברים בשכבה אחת מתחת לפני שטח הבטן. בכל קרן רחם, שקים הם ליניארי מחוברים זה לזה. נסה לכבד את הסדר הזה כשמתפשט.
2. מארק כל עובר על בטן העירום של הנשים עם סמן קבע עם קדמי / אחורי וכיווני הגחון גב / שלהם. לדעת את הכיוון יאפשר איתור הלב עם החללית. מספר העוברים בצד הימין וקרנות עזבו החל מצוואר הרחם (1, 2, 3 ... ו1 ', 2', 3 '... בהתאמה; איור 2).
   הערה: (i) הימנע מלהפיץ את העוברים בכוח מוגזם. לשרטט את מיקומם על פיסת נייר כדי לעקוב אחריהם (איור 2 ג). (Ii) יש לי C57BL / 6 נקבות ~ 8 עוברים בכל המלטה. עם זאת, 0-2 עובר בכל המלטה הוא located מתחת לאחרים, מה שהופך את ההדמיה שלהם בלתי אפשרית. תכלול עוברים אלה מהניתוח ולהעריך יותר המלטות במידת הצורך.

4. מדידת קצב לב

1. מניחים כמות קטנה של ג'ל אולטרסאונד prewarmed על בטן עירומה ולהפיץ אותה באופן שווה. למנוע היווצרות בועה. להוסיף כמות גדולה יותר של ג'ל (~ 5 מיליליטר) באזור המסוים לתמונה.
2. החזק את הבדיקה במגע עם השכבה העבה ג'ל (10 מ"מ) ולהזיז את החללית בהדרגה לכיוון העור תוך מבט ללב הפועם. ברגע שהלב הפועם מוצג על המסך, להתאים את הזווית של החללית יש שני חדרים בגודל הגדול ביותר שלהם במטוס ההדמיה (איור 2 ד).
3. בגין רכישת תמונה. עם הזרוע מונחת על התחנה, למקם את המתמר על הג'ל אולטרסאונד כדי לקבל תמונה בשידור חי במסך הצפייה (איור 2 ד). שמירה על הרכס של המתמר בחלק העליון ולחיצה על נטייה scanheadסמן n (בפינה השמאלית העליונה של התמונה) מאפשר התיאום של תנועת היד והאזור דמיינו על המסך.
4. החל מצוואר הרחם, לעבור לעובר הקרוב המסומן (1 או 1 'בקרן רחם ימינה או שמאלה, בהתאמה) כדי להמחיש את הלב הפועם על המסך. בגלל עומק מוקד קבוע, בעדינות להזיז את החללית למעלה / למטה ולצדדים מבלי לאבד מגע עם ג'ל להשיג מטוס תמונה הרצויה.
5. מקם את הלב הפועם במרכז המסך באזור המסומן בקו המקווקו הצהוב המייצג את אזור המוקד לרכישת נתונים טוב יותר.
6. לרכוש את הקלטת החיה. השג את תמונת הסקאוט ולחדש את ההקלטה (איור 3 א). ברגע שמינימום של 10 שניות של הקלטה יציבה מתקבל, לעצור את ההקלטה ולשמור.
7. המשך לעובר הבא.
8. ברגע שכל העוברים מנותחים, "עיון" לחץ במקלדת כדי להציג את רשימת ההקלטות. שחק כל טרייסי M-מצב נרשמהng ולבצע מדידות מרובות (לפחות 5 לעקיבה) של המרווח בין פסגות סמוכות (זמן / זרימת מחזור) כדי להשיג את קצב לב הממוצע (איור 3 ב).
   הערה: פרוטוקולים יש הטוענים שימוש במעמד נייח לscanhead להימנע מטלטול. עם זאת, הוא מרסן את הזווית של ניתוח, מה שהופך את ההתבוננות בעוברים לרוחב קשה. היא גם מאיטה את הניתוח, כעמדה צריכה להיות מותאמת לכל עובר. מחזיק scanhead תוך יישוב הזרוע בתחנת יעילות ממזער רועד. אימון עם 5-10 נשים בהריון מומלץ כדי לייעל את התוצאה.

5. Genotyping

1. בעזרת מספריים כירורגית נקיים ומלקחיים, לחתוך אורכי העור ושכבת שריר של הבטן. אתר את שקים בכל קרן רחם ולהתאים את המספרים. גזור לפתוח את שק החלמון לחשוף את העובר בצו שימוש מעל. אם לא בהסדר ליניארי, הסקיצה של עמדות עובר על פיסהנייר יהיה חיוני ברגע שהסימנים על העור כבר לא נראים לעין.
2. לחתוך רק ~ 4 מ"מ מזנב לגנוטיפ כמו הדנ"א הגנומי מופק ביעילות רבה מזנבות עובריים.
   הערה: (i) ההליך כירורגי יכול להיות שיש לבצע במיקום נפרד מחדר ההדמיה. עם זאת, חשוב שלא להזיז את העכבר ויש לי את ההליך כירורגי על פלטפורמת ההדמיה כדי לעקוב אחר העוברים הממוספרים. התייעץ עם מנהל מתקן בעלי החיים כדי לייעל את ההליך הכירורגי. (Ii) הנקבה בהריון במהירות מתה כתוצאה מאיבוד דם כעוברים יוסרו לגנוטיפ לאחר הדמיה. לאחר קיצוץ זנב, העוברים ממוקמים 3 דקות על קרח להרדמה על ידי היפותרמיה ולאחר מכן ערפו את הראש עם מספריים, כפי שהומלצו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים שלנו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

השיטה הנ"ל הייתה בשימוש כדי להעריך את ההשפעה של הנוכחות או עדר של furin פרוטאז סרין בתאי האנדותל בקצב לב של עוברי עכברים בE18.5 ברחם. Furin שייך למשפחה של convertases proprotein (מחשבים) שמבשרי החלבון ידבקו אחרי שאריות בסיסיות. Furin והמצעים שלה הם חלבוני הפרשה ומחשוף יכול להתרחש ב...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

אקו M-המצב הוא שיטה יעילה ופשוטה למדידה בקצב לב ברחם של עוברי עכברים. מתמרים זמין מסחרי לספק רזולוציה מספיקה כדי להמחיש את לב פועם קטן. לפיכך, הם מאפשרים מדידת קצב לב מאוד מדויקת, בהשוואה לשיטות אחרות כגון מדידת דופק, ויכולים להוות תחליף מיקרוסקופיה וידאו ברז...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	CP0406v2	1-chloro-2,2,2-trifluoroethyl difluoromethyl ether
Ultrasound gel	Parker Laboratories Inc.	Aquasonic Clear
Electrode gel	Parker Laboratories Inc.	Spectra 360
Ophthalmic gel	Novartis	Tear-Gel
Depilatory cream	Church Dwight Co., Inc.	Nair
Hair clipper
Gauze/cotton swap	Q-tips
Permanent marker
High-Resolution In vivo Ultrasound Imaging System	Visual Sonics	Vevo770
30 MHz Transducer	Visual Sonics	RMV707B
Imaging platform and physiology controller unit	Visual Sonics
Anesthetic System	Cyprane North America Inc.	312462
Infrared heating lamp