Noninvaziv M-mod ekokardiyografi ile Fare Kalp Puan utero Ölçümünde

Özet

Ultra yüksek frekans ultrason küçük hayvanlarda kalp anormallikleri incelemek için güçlü bir canlı görüntüleme aracıdır. Bu girişimsel embriyoların fizyolojik durumunu korumak sağlar. Burada, rahimde embriyo E18.5 kalp oranlarını ölçmek için M-modu ultrason kullanımını gösterir.

Özet

Konjenital kalp hastalığı (KKH) doğumda ölüm en sık noninfeksiyöz nedenidir. KKH sıklığı 4 ila 50/1, 000 doğumda (Hastalık ve yaralanma bölgesel tahminler, Dünya Sağlık Örgütü, 2004) arasında değişmektedir. Genellikle yaşam kalitesini tehlikeye ameliyatları KKH nedenlerini bulma önemini bize hatırlatan, kalp kusurları düzeltmek için gereklidir. Mutant fare modelleri ve canlı görüntüleme teknolojisi bu hastalığın etyolojisi incelemek için gerekli araçları haline gelmiştir. Gelişmiş yöntemler embriyolar anormal kalplerin canlı görüntüleme izin rağmen, sonuncusunun fizyolojik ve hemodinamik durumları nedeniyle sık sık cerrahi ve / veya uzun prosedürler için tehlike vardır. Invaziv olmayan ultrason görüntüleme, ancak, cerrahi ve böylece bunların fizyolojisi muhafaza, embriyolar maruz kalmadan kullanılabilir. Bu yazıda, rahimde E18.5 embriyo kalp oranlarını değerlendirmek için basit M-mod ultrason kullanımı. Anormal kalp oranlarının tespiti gerçekten iyi bir göstergesi olduğunuBöylece kalbin disfonksiyon tor ve kalp yetmezliğine yol açabilir gelişimsel kusurları belirlenmesinde bir ilk adım teşkil etmektedir.

Giriş

CHD doğum ¹ ölüm en yaygın bulaşıcı olmayan nedenidir. Birden ameliyatlar genellikle yaşam kalitesi ¹ tehlikeye kalabilir konularda yapısal kusurları düzeltmek için gereklidir. KKH olan çocuklar sık sık gelişim ^2,3 üzerinde utero sonuçlara önemli işaret, onlar ameliyat geçirmiş olsa bile nörolojik bozukluklar gelişir. Böyle hamilelik sırasında virüslere veya kimyasalların (alkol) maruz kalma, neden KKH olarak hem genetik hem de çevresel faktörler. Genetik katkıda incelenmesi erken aşamasında olduğu, ancak hızla büyüyen. Bu katkıda belirlemek ve bir basit ve güçlü bir araç ile mutant fareler fenotiplendirilmesi, kalp gelişimine rollerini anlamak için son derece yararlı olacaktır.

Fare gerçekten KKH incelemek için tercih edilen bir hayvan modeli ve insan vakalarının çoğunda farelerde ^4,5 çoğaltılabilir. Sonuç olarak, fetal fare kalp fenotipleme inc haline gelmiştirreasingly önemli insan KKH etyolojisi araştırmak ve yeterli araçları gerektirir. Sabit örneklerde histolojik çalışmalar çok değerli olmasına rağmen, canlı hayvanların gerçek zamanlı görüntüleme kalbin fizyolojisini anlamak için çok önemlidir. Video mikroskopi canlı görüntüleme sunar. Ancak, böylece onların fizyolojik ve hemodinamik durumu ödün, embriyolar maruz laparotomi gerektirir. Son zamanlarda, ekokardiyografi klinikte yanı sıra farelerde kalp değerlendirmeler için standart görüntüleme tekniği haline gelmiştir.

Fare fetal ekokardiyografi standart klinik ultrason sistemlerinin yanı sıra ultra yüksek frekanslı ultrason sistemleri kullanılarak yapılır. İkincisi 30 MHz veya iki-boyutlu görüntüler oluşturmak ve erken embriyonik aşamalarında değerlendirilmesine izin yüksek frekans dönüştürücüler sağlamaktadır. Bu dönüştürücüler, ancak yeterli görüntüleme uçak elde edilir ve temel kalp pa belirlemek için yeterli olan bir nispeten zayıf bir penetrasyon derinliği (~ 13 mm) sahip, kalp hızı, diyastol ve sistol ve septum ve duvar kalınlığı, sol ve sağ ventrikül iç çapı, laparotomi yapmadan gibi parametlerini.

Bizim çalışmamızda, embriyonik gün E18.5 fare embriyoları kalp oranlarını değerlendirmek için ultra-yüksek frekanslı ultrason sistemi kullandık. Biz 12,7 mm odak uzaklığına sahip fetusların boyutu, verilen ideal 20 mm x 20 mm, bir alan görünümünü sağlayan bir 30 MHz transdüser seçti. Bununla birlikte, daha yüksek frekans dönüştürücü gelişim aşamaları daha önce analiz için seçilebilir. Seçilen M-mode 1,000 kare / sn yüksek temporal çözünürlük hareket sayesinde dokuların görselleştirme sağlar. Tam prosedürü basit ve fetusun fizyolojik ve hemodinamik devletlerin herhangi sarsımına önlemek için mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır. Yaklaşık 8 embriyo analizi, yaklaşık 1 saat gerektirir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu protokolde gösterilen tüm işlemler IRCM Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1.. Ultrason Sistemi ve İstasyon Hazırlama

1. Ultrason görüntüleme sistemi başlatmak ve üreticinin talimatlarına (Şekil 1) 'e göre scanhead hem de fizyolojik kontrol birimi bağlayın. Kardiyak Ölçme Programı ve 30 MHz transdüser karşılık scanhead seçin.
2. Iyonu giderilmiş su ile scanhead ve burunluğu doldurun. Onlar görüntüleme çözünürlüğü ile müdahale gibi hava kabarcıkları kaçının. Görüntüleme platformu yakın bir tutucuya kolu tarafı yukarı (Şekil 1A) ile scanhead yerleştirin.
3. Görüntüleme platformu ve çalışma alanı dezenfekte.
4. Kabarcıkların oluşumunu önlemek ve 37 ° C'de (Şekil 1 B) kendi ön ısıtma kabı kümesinde ters yerleştirmek için tamamen ultrason jel doldurunuz.
5. Oksi düzeylerini doğrulayıngen izofluran ve anestezi için boru sistemi. ~ 8 embriyolar ile bir deney yaklaşık 15-20 L oksijen kullanmak istiyorsunuz.
6. Oftalmik merhem, tüy dökücü krem ve görüntüleme platformu (Şekil 1 B) yakın elektrot jel şişe yerleştirin.
7. Bu kızılötesi ısı lambası fonksiyonlarını doğrulayın. Eğitim sırasında, ısı seviyesi, lambanın konumu ve vücut sıcaklığını ve kalp hızını korumak için farelere lambanın mesafeyi ayarlamak.
   Not: Sistemin ve malzeme Uygun hazırlık kritiktir. Uzun prosedürler sürece anestezi, kalp hızı, kan basıncı ve kan oksijenlenme düzeyini düşürerek kardiyak fonksiyonu deprese fetüsün fizyolojik ve hemodinamik özelliklerini etkileyebilir. (C57BL / 6 ortalama DKBKS) ~ 8 fetus için işlem süresi yaklaşık 1 saat olmalıdır. Diğer fare suşları muhtemelen daha büyük bir kadın boyutu ile, fetus yüksek bir sayı verebilir. Eğitim processi optimize etmek için gerekli olanng zaman.

2. Fare Hazırlık

1. Bu cevap vermeyen hale gelene kadar oksijen içinde% 2 izofluran ile sürekli kaynağı (200 ml / dakika) ile bir oda içinde hamile kadın anestezisi.
2. Oksijen içinde% 1.5 izofluran (200 ml / dakika) sürekli inhalasyon için boru ayarlamak ve bant (Şekil 2A) ile inhalasyon tüp düzeltmek supin pozisyonunda görüntüleme platformda fare yerleştirin. Yeterli anestezi fare rahat bir duruş ve kuyruk ve ayak tutam herhangi bir yanıt yokluğunda prosedür sırasında teyit edilmelidir.
3. Sadece elektrokardiyografi (sağ bacak ve de kurşun II pozisyon denir, sol arka bacak, ön), sol üst ve sağ alt elektrot pedleri yerleştirin elektrot jeli. Kurşun II pozisyon kalp hızını belirlemek için karmaşık iyi tanımlanmış dik pozitif P-dalgası ve QRS sağlar. Bant (Şekil 2A) kullanarak her bir ped için dört pençeleri edin. Gözlerin kurumasını önlemek için, 1 damla uygulamakHer gözün içine göz balsamı.
4. Bir saç kesme makinesi ile kesesi göğüs karın Tıraş. Daha sonra 2 dakika boyunca tüy dökücü krem ​​uygulayın ve dikkatlice kalan saç kaldırmak için bir gazlı bez ve / veya pamuklu çubukla silin. Meme kesmek için dikkatli olun.
5. Vücut sıcaklığı izlemek için dişinin rektuma elektrot jeli ile yağlanan termometre takın (platformu üzerinde bulunan bir kızıl ötesi ısı lambası ayarlanmasıyla 37 ± 0.5 ° C 'de muhafaza edilmesi gerekir). Kalp hızı 450 ± 50 atım / dk (bpm) olmalıdır. Sıcaklık ve kalp atış hızı her ikisi de fizyolojik kontrol birimi (Şekil 1 B) görüntülenir.
   Not: Uzun Anesthetization, saç dökülmesi ve ultrasonik jel (prewarmed rağmen) dişinin kalp hızını etkileyen, hangi hipotermi yol açabilir. Vücut sıcaklığı 36.5 ° C'nin altına düşerse, prosedürü durdurmak ve sıcaklığı ve kalp hızı ayarlamak için ısıtma lambanın konumunu değiştirmek. BEF birkaç dakika bekleyinTekrar devam cevher.

3. Embriyo Tanımlama

1. Yavaşça embriyoları bulmak için çıplak karın bastırın. Yavaş ve hafifçe karın yüzeyinin altında tek bir katmanda embriyoların çoğu var onları dışarı yayıldı. Her uterin boynuz, keseler doğrusal birbirine bağlanır. Yayılan bu düzeni saygı deneyin.
2. Mark kendi anterior / posterior ve dorsal / ventral yönleri ile kalıcı bir kalem ile kadın çıplak karın her embriyo. Yönlendirmeyi bilmek prob ile kalp yerini kolaylaştıracaktır. (, Şekil 2B, sırasıyla 1, 2, 3 ... ve 1 ', 2', 3 '...) serviks başlayarak Number sağ ve sol embriyolar boynuzları.
   Not: (i) aşırı güçle embriyolar yayılan kaçının. (Şekil 2C) onları izlemek için bir kağıt parçası üzerinde konumlarını kroki. (Ii) C57BL / 6 kadın çöp başına ~ 8 fetüsleri var. Ancak, her çöp içinde 0-2 embriyolar lOnların görüntüleme imkansız hale, diğerleri altında ocated. Analizinde bu embriyolar dışlamak ve gerekirse daha ibrelerin değerlendirmek.

4. Kalp Hızı Ölçümü

1. Çıplak karın prewarmed ultrason jeli küçük bir miktar koyun ve eşit bir şekilde yayıldı. Kabarcık oluşumunu önlemek. Görüntü için belirli bir alan üzerinde jel daha büyük bir miktarda (~ 5 mi) ilave edin.
2. Kalın jel tabakası (10 mm) ile temas probu tutun ve kalpte ararken yavaş yavaş cildin doğru probu hareket ettirin. Kalpte ekranında görüntülenebilir sonra, görüntü düzlemi (Şekil 2D) kendi en büyük boyut olarak ventriküller için prob açısını ayarlamak.
3. Görüntü elde başlayın. Önkol istasyonunda dinlenme ile, izleme ekranından (Şekil 2B) canlı bir görüntü elde etmek için ultrason jeli üzerinde dönüştürücüyü yerleştirin. Üst transdüktörün sırtı bakımı ve scanhead yönelim tıklayarak(görüntünün sol üst köşede) n işaretleyici ekranda görsel el hareketi ve alan koordinasyonunu sağlar.
4. Serviks başlayarak, ekranda atan kalp görselleştirmek için (sırasıyla sağ veya sol uterin boynuz 1 veya 1 ') işaretli yakın embriyo hareket. Odak derinliği sabit olduğundan, hafifçe istenen görüntü uçağı elde etmek için jel ile temasını kaybetmeden yukarı / aşağı ve yanlara probu hareket ettirin.
5. Daha iyi veri toplama için odak bölgesini temsil sarı kesikli çizgi ile gösterilen bölgede ekranın merkezinde kalpte yerleştirin.
6. Canlı kayıt edinin. Izci görüntü elde edilir ve (Şekil 3A) kayda devam. Istikrarlı kayıt 10 saniyelik minimum elde edildikten sonra, Kaydı durdurmak ve kaydetmek.
7. Bir sonraki embriyo geçin.
8. Tüm embriyolar kayıtların listesini görmek için klavyede, basın "Browse" incelenmiştir kez. Kaydedilen her M-mod Traci oynang, ortalama kalp hızı (Şekil 3B) elde etmek üzere bitişik tepe (saat / akış döngüsü) arasındaki mesafe çoklu ölçümler (izleme başına en az 5) yerine getirir.
   Not: Bazı protokoller sallayarak önlemek için scanhead için bir sabit stand kullanmanızı öneririz. Ancak, bu yan embriyoların gözlem zorlaştırır, analiz açısını sınırlamaktadır. Bekleme her embriyo için ayarlanmalıdır gibi aynı zamanda, analiz yavaşlatır. Istasyondaki kol yerleşme süre scanhead tutan verimli sallayarak aza indirir. 5-10 hamile kadın ile eğitim sonucu optimize etmek için tavsiye edilir.

5. Genotiplemesi

1. Temiz cerrahi makas ve forseps kullanarak, uzunlamasına deri ve karın kas tabakası deşmek. Her uterus boynuz keseler bulun ve numaraları maç. Yukarıda kullanılan sırayla embriyo ortaya çıkarmak için yumurta sarısı kese açık kesin. Doğrusal bir şekilde değilse, bir parça embriyo pozisyonların krokiciltte işaretleri artık görünür bir kez kağıt gerekli olacaktır.
2. Genomik DNA, çok verimli bir şekilde embriyonik kuyrukları ayıklanır gibi genotipleme için kuyruğun sadece yaklaşık 4 mm kesin.
   Not: (i) Cerrahi müdahale görüntüleme odasından ayrı bir yerde gerçekleştirilebilir gerekebilir. Ancak, hareket etmek için fare ve sayılı embriyoların izlemek için görüntüleme platformda cerrahi işlem için önemlidir. Cerrahi prosedür optimize etmek için hayvan tesis yöneticisi danışın. Fetuslar görüntüleme sonra genotiplendirebilmek kaldırılır (ii) hamile kadın hızla kan kaybından dolayı ölür. Bizim Hayvan Bakım Komitesi tarafından önerilen, kuyruk kesme sonra, fetusun hipotermi tarafından anestezi için buz üzerinde 3 dk yerleştirilir ve daha sonra makasla kesilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Yukarıdaki yöntem rahimde E18.5 fare embriyoları kalp oranlarına endotel hücrelerinde varlığında ya da serin proteaz furin yokluğu etkisini değerlendirmek için kullanıldı. Furin temel kalıntılarının sonra proprotein dönüştürücülerin (PC'ler) o çatlatma protein öncülerinin ailesine aittir. Furin ve alt tabakalar salgı proteinlerdir ve ayrılması Golgi aygıtının, endozomlar ya da hücre yüzeyinde meydana gelebilir. Furin Temel alt-tabakalar TGFb, kalp ve gelişiminde önemli bi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

M-mod ekokardiyografi fare embriyoları utero kalp oranları ölçmek için etkili ve basit bir yöntemdir. Piyasada mevcut dönüştürücüler küçük atan kalpleri görselleştirmek için yeterli çözünürlüğü sağlar. Böylece, bu tür nabız ölçümü gibi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, son derece doğru bir kalp atış hızı ölçümü, izin ve yüksek çözünürlüklü video mikroskobu yerine kullanabilirsiniz. Ancak, mevcut araçları embriyoların her görselleştir...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	CP0406v2	1-chloro-2,2,2-trifluoroethyl difluoromethyl ether
Ultrasound gel	Parker Laboratories Inc.	Aquasonic Clear
Electrode gel	Parker Laboratories Inc.	Spectra 360
Ophthalmic gel	Novartis	Tear-Gel
Depilatory cream	Church Dwight Co., Inc.	Nair
Hair clipper
Gauze/cotton swap	Q-tips
Permanent marker
High-Resolution In vivo Ultrasound Imaging System	Visual Sonics	Vevo770
30 MHz Transducer	Visual Sonics	RMV707B
Imaging platform and physiology controller unit	Visual Sonics
Anesthetic System	Cyprane North America Inc.	312462
Infrared heating lamp