ניטור שינויים בממברנה קוטביות, ממברנה יושרה, וריכוזי יון תאיים ב<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; שימוש צבעי ניאון

Summary

שלא כמו שראה לאאוקריוטים, יש מיעוט מחקרים ששלילת קוטביות קרום פירוט וריכוז יונים שינויים בחיידקים, כגודלם הקטן בעיקר הופך את השיטות מקובלות של מדידה קשה. כאן, אנו פרוטוקולי פרט לניטור אירועים כאלה בפתוגן גראם חיובית המשמעותי Streptococcus pneumoniae תוך שימוש בטכניקות הקרינה.

Abstract

נתיבי שלילת קוטביות קרום ויון הם אירועים שנחקרו רב במערכות ביולוגיות בשל היכולת שלהם להשפיע עמוקות תפקודים תאיים, כולל האנרגטיקה וtransductions אות. בעוד שני שיטות הניאון ואלקטרו, ובכלל זה שימוש אלקטרודת ותיקון-clamping, פותחו גם למדידת אירועים אלה בתאי אוקריוטים, מתודולוגיה למדידת אירועים דומים במיקרואורגניזמים הוכיחו יותר מאתגר כדי לפתח בהתחשב בגודל הקטן שלהם בשילוב עם יותר מורכב משטח חיצוני של חיידקי מיגון הממברנה. במהלך הלימודים של מוות חניכה בStreptococcus pneumoniae (pneumococcus) שלנו, אנחנו רוצים להבהיר את התפקיד של אירועי קרום, לרבות שינויים בקוטביות, יושרה, וריכוזי יון תאיים. חיפוש בספרות, מצאנו כי מעט מאוד מחקרים קיימים. חוקרים אחרים היו במעקב ספיגת radioisotope או שיווי משקל כדי למדוד שפעת יוןXES וקרום פוטנציאלי ומספר מצומצם של מחקרים, רובם באורגניזמים גראם שליליים, שראו הצלחה מסוימת באמצעות carbocyanine או oxonol צבעי ניאון למדידת פוטנציאל ממברנה, או טעינת חיידקים עם acetoxymethyl תא permeant (AM) גרסאות אסתר של יון רגיש צבעי ניאון מחוון. לפיכך, אנו הוקמו ומותאמים פרוטוקולים למדידת פוטנציאל ממברנה, קרע, ויוני תחבורה באורגניזם גראם החיובי ס דלקת ריאות. פיתחנו פרוטוקולים באמצעות צבע bis-oxonol DiBAC ₄ (3) ויודיד propidium לצבוע תאי impermeant למדוד שלילת קוטביות קרום וקרע, בהתאמה, כמו גם שיטות לטעינה אופטימלית pneumococci עם אסטרים AM של צבעי ratiometric פורע-2, PBFI, וBCECF כדי לזהות שינויים בריכוזי תוך תאיים של Ca ^{2 +,} K ^+, ו-H ^+, בהתאמה, באמצעות קורא צלחת הקרינה איתור. פרוטוקולים אלה הם הראשונים מסוגם לpneumococcusורוב הצבעים האלה לא היה בשימוש בכל מיני חיידקים אחרים. למרות שהפרוטוקולים שלנו כבר מותאמים לס pneumoniae, אנו מאמינים גישות אלו צריכות להוות נקודת התחלה מצוינת למחקרים דומים במינים חיידקים אחרים.

Introduction

המעבדה שלנו זיהתה חלבון מורכב שומנים מחלב אדם בשם המלט (לאדם Alpha-lactalbumin Made קטלני לתאים סרטניים), שגורם לאפופטוזיס בתאים סרטניים, אבל הוא גם מסוגל להרוג מגוון רחב של מיני חיידקי ^1,2. המינים שנמצאו להיות רגיש במיוחד היו אלה המכוונים את דרכי נשימה, עם Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) בו מוצגות הרגישות הגדולה ופנוטיפ כמו אפופטוזיס, מות ^2,3. אירועי תחבורת שלילת קוטביות קרום ויון ספציפיים שתוארו היטב ואירועים מכריעים באפופטוזיס בתאי אוקריוטים, בפרט במיטוכונדריה, שבו יונים רדיואקטיביים TPP ⁺ וצבעי ניאון כולל JC-1 וTMRE היו בשימוש כדי להדגים שלילת קוטביות של קרום המיטוכונדריה ^{3 -5.} לפיכך, אנו מבקשים ללמוד יותר על ההשפעה של המלט על תכונות הקשורות לממברנה אלה בpneumococcus כפי שאנו מתמקדים מאמצינולפתח הבנה טובה יותר של הרכיבים מכניסטית של פנוטיפ כמו אפופטוזיס, בחיידקים, עם פוטנציאל גדול לזיהוי טיפולי אנטיבקטריאלי רומן או מועמדי חיסון בתהליך.

במבקש להקים פרוטוקולים עבור המחקרים מכניסטית שלנו, גילו כי בניגוד למתודולוגיה שתוארה היטב במערכות אוקריוטים, יש מעט מאוד מחקרים שפורסמו מפרטים מנגנוני אלקטרופיזיולוגיה והובלת יונים של ^6,7 קרום החיידק. זו מיוחסת בעיקר לגודל הקטן יותר של מיקרואורגניזמים ואדריכלות פני השטח שלהם, ובמיוחד את נוכחותו של דופן תא, המגבילה את הנגישות של הקרום לשימוש בשיטות אוקריוטים קונבנציונליות כמו הידוק תיקון, אם כי כמה מחקרים באמצעות protoplasts הענק בוצעו בהצלחה מעורבת ^8,9. ככל שעבודה עם protoplasts הענק אלה היא לא שיטה אידיאלית או אפילו מעשית עבור רוב מיני חיידקים שכן היא דורשת גברחיידקי ipulated במצב לא טבעי ואביוטי, המחקרים מוגבלים של קוטביות קרום חיידק שכבר בוצעו היו בעיקר מועסקים cytometry זרימה והשימוש בצבעי ניאון cyanine וoxonol ^10-16.

במקום cytometry זרימה, המרכזת את קריאות הקרינה בודדות מחיידק אחד בכל נקודת זמן אחת, בחרנו להשתמש בקורא צלחת גילוי הקרינה כדי לזהות עוצמת הקרינה של השעיות חיידקים בפורמט צלחת 96 היטב לאורך זמן. זה אפשר לנו לטיפול באוכלוסייה של חיידקים בנקודות זמן שונים בפשטות רבה יותר ולהקל, ולפקח באופן רציף קינטיקה הקרינה של האוכלוסייה כולה לפרקי זמן ארוכים, שקשה להשיג באמצעות cytometry זרימה. לאחר בדיקת מגוון רחב של הצבעים הפוטנציאליים רגישים ניאון (כוללים אלה שהוזכרו לעיל לשימוש עם מיטוכונדריה), השגנו ההצלחה הטכנית ומעשית הטובה ביותר באמצעותצבע bis-oxonol נקרא DiBAC ₄ (3) (BIS-(oxonol חומצת 1,3-dibutylbarbituric) trimethine) כדי לעקוב אחר שינויים בקוטביות.

מצאנו גם את זה חשוב כדי לפקח במקביל לשיבושים ביושרה של הקרום באמצעות יודיד propidium (PI). צבע זה מאיר על כריכה לחומצות גרעין, אבל הוא רק מסוגל לעשות זאת כאשר על שלמות קרום החיידק נפגעת, מה שהופך את המרכיב הפופולרי המשמש לגילוי תאים מתים במבחנים מכתים חיים מתים. בנוסף לPI, Sytox ירוק וTO-PRO-1 צבעי ניאון שדומים בפעולה וכבר שימשו בעבר לחיידקים בכמה מחקרים באמצעות cytometry זרימת שיטות זיהוי ^17. אנחנו בחרנו להשתמש PI עקב גל העירור שלה, שאיפשר לנו לעקוב אחר הקרינה שלה במקביל לDiBAC במדגם נתון.

במחקרים שלנו, יש לנו ציינו כי המלט, כמו גם אחר מורכבת חלבון שומנים בדם הקשורים לפעילות bactericidalהמכונה ELOA, שלילת קוטביות וקרע מושרה של קרום החיידק כפי שצוין על ידי עלייה בקרינה של שני הצבעים על הטיפול בpneumococci ^3,18,26. עבור שני מתחמים, הבחין כי עוצמת הקרינה של DiBAC ₄ (3) עלתה לפני העלייה בעוצמתו של צרכן, מצביע על כך ששלילת הקוטביות התרחשה לפני הקרע, והוא, אם כן, אירוע ספציפי הנגרם על ידי קומפלקסי חלבוני שומנים בדם bactericidal שלנו ריבית. הבחנה זו חשובה לעשות, כמו קרע של הקרום יכול לגרום לעצמו שלילת קוטביות לא ספציפית. קינטיקה (3) וקרינת PI מדידה וניתוח שני DiBAC ₄ אפשרה במקביל לנו לבחון את הקשר הזה בין אירועי קרום שתיים, אשר מהווה יתרון נוסף של שימוש בfluorometry במקום cytometry זרימה.

כדי לעקוב אחר שטף יון חיידקים, יש כבר כמה הצלחה קודמת עם שימוש ברדיואיזוטופים, כולל מדידת ספיגה של45 Ca ^{2 +} בpneumococcus ^19,20, שיש לנו גם שימוש במחקרים האחרונים שלנו ^{18, 21.} עם זאת, יש בעבודה עם יונים רדיואקטיביים אלה יש כמה חסרונות. הם יכולים להיות יקרים, גוזלים זמן, ומבולגן, והוא יכול גם לחשוף את פרט ביצוע הניסוי כדי לפגוע, תלוי באיזוטופ של עניין. בנוסף, קשה לעקוב אחר שינויים מהירים לאורך זמן. לפיכך, פנינו לכיוון שיטה חלופית של מדידה שמעסיקה גרסאות אסתר acetoxymethyl (PM) של צבעי ניאון מחוון יון רגיש. על ידי עצמו, צבע המחוון טעון ואינו עובר דרך הממברנה בקלות, אבל עם התוספת של קבוצת אסתר lipophilic, המולקולה כעת בלתי טעונים יכולה לעבור דרך הממברנה של החיידק. עם כניסתו לפנים, esterases החיידקים לדבוק קבוצת אסתר, והשאיר את צבען חופשי בתוך התא והואשם שוב, להאט באופן משמעותי את יכולתה לצאת מהתא ומאפשר לא לצבועo מצטברת בתוך לאורך זמן. עם זאת, שימוש בצבעי אסתר אלה תוארו רק בכמה מיני חיידקים כדי לזהות שינויים בתאיים Ca ^{2 + 22-24} ו-H ^+16, עם שיטות שונות של העמסה, איתור, והצלחה.

עם רצון לעקוב אחר שינויים בתאיים Ca ^{2 +} וגם רמות K ⁺ ו-H ⁺ בס pneumoniae על טיפול עם המלט ותרכובות אחרות, יצרנו בהצלחה פרוטוקולים כדי לטעון צבעי ניאון מחוון ביעילות לתאי חיידקים. טעינה יעילה לחיידקים נדרשים שני פרובנציד שמגביר אצירת צבע על ידי חסימת אניון-מובילים וPowerLoad, מתחם קנייני מחיים טכנולוגיים שמגביר את יעילות טעינה. Fura-2/AM (גילוי Ca ^{2 +),} PBFI / AM (גילוי K ^+), וBCECF / AM (גילוי ⁺ H) הועמסו בהצלחה לתוך st pneumococcal שני unencapsulated והמארזגשמים המאפשרים מדידה של דפוסי הקרינה וכתוצאה מכך לאחר תוספת של יונופורים, כגון ionomycin (Ca ^{2 +} uncoupler), valinomycin (K ⁺ uncoupler) וCCCP (H ⁺ uncoupler) באמצעות צלחת גילוי הקרינה קורא ^{18, 21.}

Protocol

1. הכנת תרבויות חיידקים

1. גידול התרבות לשימוש בניסויים
   1. בבלוק חימום 37 מעלות צלזיוס, להפשיר מניות בקבוקון קפוא של ס דלקת ריאות ולהוסיף התוכן שלה ל9 מיליליטר של טרי, prewarmed מרק טוד יואיט עם 0.5% תמצית שמרים (THY) עבור נפח כולל של 10 מיליליטר בצינור תרבות זכוכית.
   2. דגירה באופן סטטי על 37 מעלות צלזיוס עד התרבות מגיעה שלב אמצע יומן _(600nm אבס ≈ 0.5-0.6).

2. איתור ממברנה שלילת קוטביות ושבר

1. ריאגנטים הכנה
   1. הכן מלאי 50 מיקרומטר של DiBAC ₄ (3) בDMSO 100%, ומ"ג / מיליליטר מניות 2 של PI בDDH ₂ O. DiBAC ₄ (3) המניות היא יציבה ב -20 מעלות צלזיוס במשך לפחות 6 חודשים. מניית PI היא יציבה על 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 6 חודשים.
   2. לעטוף את המניות בנייר כסף כדי להגן מפני האור.
2. טעינהבקטריה
   1. גלולה תאי חיידקים מהצעד 1.2.2 על ידי צנטריפוגה ב2,400 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר ולשטוף פעמיים על ידי הסרת supernatant, resuspending גלולה ב10 מיליליטר של 1x פוספט שנאגר מלוח (PBS), ו צנטריפוגות שוב ב2,400 XG עבור 10 דקות.
   2. הסר supernatant וגלול resuspend ב PBS לנפח המקורי. זה יספק כ 10 ⁸ יחידות מושבה יוצרים של חיידקים למ"ל. הסר 1 מיליליטר (מספיק ל 5 דגימות) של התאים נשטפו ומקום לתוך צינור microcentrifuge.
   3. לתאים אלה, להוסיף 25 μl של 1 פתרון M-מעוקר מסנן מניות של גלוקוז (שהוכן DDH ₂ O ומסונן באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר) לריכוז סופי של 25 גלוקוז מ"מ, ו דגירה בבלוק חימום 37 מעלות צלזיוס במשך חמישה עשר דקות. הערה: זה מספק אנרגיה לכל ערוצי הקרום תלוי ATP ומרכיבים תאיים. הצורך בשלב זה עשוי להשתנות, בהתאם לניסוי.
   4. הוסף 5 μl של 50 מיקרומטר DiBAC ₄ (3) המניות ו10 μl של מניית 2 מ"ג / מיליליטר לצרכן. זה מספק לריכוזים סופיים של 250 ננומטר ו20 מיקרוגרם / מיליליטר, בהתאמה. מערבבים היטב על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים. הוסף 200 μl של השעיה תא זה לזה גם דוגמא של צלחת 96 היטב ברורה.
3. גילוי הקרינה
   1. צלחת מקום בקורא צלחת גילוי הקרינה (37 מעלות צלזיוס) prewarmed.
   2. ודא כי מסננים מתאימים נמצאים במקום במשך ₄ DiBAC (3) (עירור 490 ננומטר, 516 פליטת ננומטר) וPI (535 עירור ננומטר, 617 פליטת ננומטר) זיהוי.
   3. כדי לאפשר (ולפקח במקביל) איזון של ₄ DiBAC (3) על פני הקרום, להגדיר את הקורא לקחת מדידות הקרינה בכל דקה במשך כ 30-40 דקות, או עד שהקריאה תתייצב; זו משמשת כקריאה "טיפול מקדים".
   4. הוצא את צלחת ומוסיף את הסוכן הניסיוני של בחירה וimmediately למקם את הצלחת בחזרה בקורא להמשיך ולעקוב אחר DiBAC ₄ (3) וקרינה לצרכן לכל האורך הרצוי של זמן. אם טיפול בכמה דגימות בבת אחת, בעזרת פיפטה רבה יכול להיות מועיל כדי להוסיף את הסוכן בו זמנית לכל הבארות.
   5. לייצא את הקריאה לתכנית ניתוח נתונים, כגון Microsoft Excel. הקרינה עלילה לאורך זמן כדי להעריך את שלילת קוטביות קרום וקרע. הקרינה הולך וגדל של DiBAC וPI מציינת כי שלילת קוטביות וקרע מתרחשים.

3. איתור שינויים תאיים Ca ^{2 +} או ⁺ ריכוזי K

1. ריאגנטים הכנה וחיץ טעינה
   1. הכן את ריאגנטים הבאים: 5 מניות מ"מ של צבע יון רגיש ניאון (Fura-2/AM או PBFI / AM, להוסיף את הכמות המתאימה של DMSO לצינור המכיל 50 מיקרוגרם של הצבע), "100x" פרובנציד (להוסיף 1 מיליליטר של PBS לבקבוקון 77 מ"ג). Solubilizedאפשר להקפיא צבעים ב-20 ° C פעם אחת והם יציבים בתמיסה במשך 3 חודשים, ואילו פרובנציד הוא יציב בתמיסה ב -20 מעלות צלזיוס במשך 6 חודשים.
   2. הכן 1 מיליליטר של 2x טוען הצפת כדלקמן: בחלק התחתון של צינור חרוטי פלסטיק 15 מיליליטר, לוותר 20 μl של 100x להתרכז PowerLoad (יציב ב-C ° 2-8 למשך 6 חודשים), ואחריו 2 μl של יון 5 מ"מ רגיש לצבען ישירות לתוך PowerLoad. בקצרה מערבולת לערבב. הוספת 960 μl של PBS ואחריו 20 μl של 100x פרובנציד. מערבולת את התערובת בפעם אחרונה. עוטף בנייר כסף כדי להגן מפני אור.
2. טוען חיידקים עם צבע
   1. גלולה ולשטוף את תרבות חיידקים בשלב אמצע היומן כפי שמתואר ב2.2.1. הסר supernatant וגלול resuspend ב 5 מיליליטר של PBS כדי להפוך את ההשעיה "2x" תא.
   2. הוסף 1 מיליליטר של ההשעיה תא 2x לטוען 2x הצפת. זה יספק עבור נפח סופי של 2 מיליליטר, וconcentr הסופיations של 1x PowerLoad, 5 מיקרומטר צבע פלואורסצנטי, ופרובנציד 1x. הערה: השעיה זה מספקת מספיק נפח ל10 דגימות מאז היטב כל דגימה למדידה תכיל 200 μl.
   3. דגירה באמבט 37 ° C מים ל75 דקות, מוגן מפני אור. הערה: הצבע הוא נטען לתוך תאי חיידקיים בהעדר כל מצעי glycolytic ובנוכחות פרובנציד כדי למזער את הזרימה של הצבע.
   4. 1 WASH: גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב2,400 XG עבור 10 דקות, להסיר supernatant, resuspend ב 2 מיליליטר PBS המכיל פרובנציד 1x. WASH 2, 3: חזור על השלב 3.2.4 2x. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות נוספות. זה יאפשר זמן לesterases חיידקים לhydrolyze קבוצת אסתר AM מצבעי הניאון הפנימו.
   5. 4 WASH: גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב2,400 XG עבור 10 דקות, להסיר supernatant, resuspend ב 2 מיליליטר של PBS המכיל פרובנציד 1x. הערה: בהתאם לexperimeNT, גלוקוז ניתן להוסיף לכאן שוב כדי להמריץ מחדש את החיידקים.
3. גילוי הקרינה
   1. Prewarm קורא צלחת צלחת קורא גילוי הקרינה ל37 ° C.
   2. עבור כל דגימה רצויה, להוסיף 200 μl של התאים עמוסים (מצעד 3.2.8) לבארות של צלחת 96 היטב. (בצע את השלבים הבאים עד להשלמתו ול/ דגימה אחת בכל פעם).
   3. להקים בסיס קריאה לטוב, צלחת מקום בצלחת קורא גילוי הקרינה כדי למדוד את הקרינה (פליטת ננומטר 340 עירור ננומטר / 510 ל" ערך 1 "ו380 עירור / פליטת ננומטר 510 ננומטר עבור" ערך 2 ") בשעה בכל שניות לדקות אחד.
   4. הוצא צלחת, להוסיף את טיפול בחירה לטוב, כי (בנפח קטן של כ 5 μl), פיפטה במהירות למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לערבב, ומייד מכניסים לצלחת קורא גילוי הקרינה לקרוא כל שניות לרצויות אורכו של הזמן. (אם בjectors קשורים לקורא הצלחת זמין, אלה יכולים לשמש גם כדי להוסיף בצורה חלקה הטיפול הרצוי, ומבטל את הצורך להפסיק את הקריאה ולהוציא את הצלחת).
   5. לייצא את הקריאה לתכנית ניתוח נתונים, כגון Microsoft Excel. לחשב את היחס שבין ערכי הקרינה עבור כל נקודת זמן על ידי חלוקת 1 ערך לפי ערך 2, ולהתוות את ערכי יחס על גרף.

4. שינויים בזיהוי תאיים pH

1. ריאגנטים הכנה ומאגרי כיול
   1. הכן את ריאגנטים הבאים: 5 מניות מ"מ של BCECF / AM (. להוסיף את הכמות המתאימה של DMSO לצינור המכיל 50 מיקרוגרם של צבע המניה זו היא יציבה ב-20 מעלות צלזיוס למשך 3 חודשים); 100x פרובנציד (להוסיף 1 מיליליטר של PBS לבקבוקון 77 מ"ג);. הכנת מניית 1 מ"מ של nigericin באתנול (חובה לאזן את רמת חומציות התוך התאית _(i-pH) של תאי ה-pH של החיץ סביב המניה זה שלשולחן ב-20 מעלות צלזיוס למשך 6 חודשים);. 0.5 מניית מ"מ של ציאניד 3-chlorophenylhydrazone קרבוניל (CCCP) DMSO (protonophore לנתק את כוח מניע פרוטונים מלאי זה הוא יציב ב -20 מעלות צלזיוס במשך 6 חודשים)
   2. הכן 10 מיליליטר של מאגרי האשלגן גבוהים הבאים: 135 מ"מ KH ₂ PO _4/20 מ"מ NaOH (monobasic) ו110 מ"מ K ₂ HPO _4/20 מ"מ NaOH (dibasic). סנן לעקר באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר. (ניתן לאחסן מאגרים אלה על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש).
   3. מערבבים את מאגרי האשלגן גבוהים בפרופורציות הדרושות ליצירת מאגרי אשלגן גבוהים עם לפחות 5-6 ערכי pH הנעים 6.5-8.0.
   4. הכן 1 מיליליטר של 2x טוען הצפת כדלקמן: בחלק התחתון של צינור חרוטי פלסטיק 15 מיליליטר, לוותר 40 μl של 100x PowerLoad, ואחריו 20 μl של צבע יון רגיש 5 מ"מ ישירות לתוך PowerLoad. בקצרה מערבולת לערבב. הוספת 900 μl של PBS ואחריו 40 μl של 100x פרובנציד. ווארטלשעבר התערובת הפעם אחרונה. עוטף בנייר כסף כדי להגן מפני אור.
2. טוען חיידקים עם צבע
   1. גלולה ולשטוף 8 מיליליטר של תרבית חיידקי שלב אמצע היומן כפי שמתואר ב2.2.1. הסר supernatant, גלולה resuspend ב 2 מיליליטר של PBS כדי להפוך את ההשעיה "4x" תא.
   2. הוסף 1 מיליליטר של ההשעיה תא 4x לטוען 2x הצפת. זה יספק עבור נפח סופי של 2 מיליליטר, וריכוזים סופיים של תאי 2x, 2x PowerLoad, 50 מיקרומטר צבע פלואורסצנטי, ו2x פרובנציד.
   3. דגירה באמבט 30 ° C מים ל40 דקות, מוגן מפני אור. הערה: הצבע הוא נטען לתוך תאי חיידקים בטמפרטורה נמוכה יותר של 30 מעלות צלזיוס ובהעדר כל מצעי glycolytic כדי למזער את הזרימה של הצבע.
   4. 1 WASH: גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב2,400 XG עבור 10 דקות, להסיר supernatant כדי להיפטר מעודפי צבע, וresuspend ב 4 מיליליטר PBS המכיל פרובנציד 2xגלוקוז מ"מ nd 1 (לreenergize החיידקים). WASH 2, 3: חזור על שלב 4.2.7 פעמיים, עם resuspension הסופי ב4 מיליליטר PBS (לריכוז סופי של תאי 1x) המכיל פרובנציד 2x ו10 גלוקוז מ"מ.
   5. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. זה יאפשר לתאים כדי להמריץ באופן מלא ולאפשר זמן לesterases חיידקים לדבוק קבוצת אסתר AM מBCECF הפנים.
3. הקמת הקרינה רקע ובעקומת כיול vivo
   1. Prewarm קורא צלחת צלחת קורא גילוי הקרינה ל37 ° C.
   2. כדי לקבוע הקרינה רקע, מסנן לעקר על 500 μl של השעיה הטעונה ומלאה אנרגיה חיידקים (מצעד 4.2.7) כדי להסיר את החיידקים, ולהוסיף 200 μl של תסנין אל הבאר של צלחת 96 היטב.
   3. מניחים צלחת בצלחת קורא גילוי הקרינה כדי למדוד את הקרינה (פליטת ננומטר 490 עירור ננומטר / 530 עבור"ערך 1" ו440 פליטת ננומטר עירור / 530 ננומטר עבור "ערך 2") דקות 1. הקרינה רקע זה צריכה להיות מופחת לפני החישוב של היחס לשני עקום הכיול והדוגמות הניסיוניות.
   4. כדי לקבל עקומת כיול in vivo, לשטוף 500 aliquots μl של התאים הטעונים ומלאים אנרגיה מהצעד 4.2.7 פעם אחת וresuspend במאגרי האשלגן גבוהים בערכים שונים pH (החל 6.5-8.0).
   5. הוסף 20 nigericin מיקרומטר לדגימות כדי לאזן את רמת חומציות התוך התאית של תאי ה-pH של החיץ שמסביב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הוסף 200 μl שילובי חיץ חיידקים / pH לבארות של צלחת 96 היטב.
   6. מניחים צלחת בצלחת קורא גילוי הקרינה כדי למדוד את הקרינה לכמה דקות כדי לקבוע קריאה מתמדת לכל אחד. לייצא את הקריאה לתכנית ניתוח נתונים, כגון Microsoft Excel.
   7. לאחר הפחתת baערכי הקרינה ckground, לחשב את היחס שבין ערכי הקרינה על ידי חלוקת 1 ערך לפי ערך 2. מגרש את ערכי יחס לכל חיץ pH כדי ליצור עקומת הכיול. (עקום כיול צריך להיות שנוצר עבור כל קבוצה חדשה של תאים טעונים, ככמות של צבע ניאון שהוא נטען לתוך החיידקים יכולה להשתנות בכל פעם).
4. שינויי מדידה בpH תאיים
   1. עבור כל דגימה רצויה, להוסיף 200 μl של תאים הטעונים ומלאים אנרגיה (מצעד 4.2.7) לבארות של צלחת 96 היטב.
   2. מניחים צלחת בצלחת קורא גילוי הקרינה ולמדוד את הקרינה של הדגימות כל 5 שניות למשך 5 דקות.
   3. להוציא את הצלחת ולהוסיף 10 CCCP מיקרומטר גם אחד (משמש כביקורת החיובית להפחתת ה-pH תאיים) וסוכן הניסוי (ים) של עניין לבארות האחרות. כדי להשוות במדויק את ההשפעות שלהם לאורך זמן, להוסיף את CCCP וסוכנים של בחירה באותו הזמן באמצעות amפיפטה ultichannel.
   4. מייד להחזיר את הצלחת לצלחת הקורא ולהמשיך מדידת הקרינה כל 5 שניות ל10 דקות. כבקרה נוספת, להוציא את הצלחת ולהוסיף 20 מיקרומטר Nigericin לכל הדגימות לאזן _i-pH של החיידקים ה-pH של החיץ שמסביב, ולקרוא למשך 5 דקות.
   5. לאחר הפחתת ערכי הקרינה רקע, לחשב את היחס בין הקרינה לכל דגימה. לשרבב את _i-pH לכל קריאה מעקום הכיול.

תוצאות

לכל הניסויים, יש דגימה אחת וקבוצה של תנאים נוכחים בכל טוב. לפיכך, כל עקיבה מייצגת את עוצמת הקרינה של אוכלוסייה שלמה של חיידקים לאורך זמן. התוצאות צריכה להיות לפרש בקלות, עם הבחנה ברורה בין הקרינה של דגימות מטופלים ושל בקרות שלא טופלו. קינטיקה ומידת שינוי שנצפה בקר...

Discussion

למרות המגבלה שהגודל מציג לשימוש בשיטות אלקטרופיזיולוגיה קלאסיות כדי לזהות שינויים בקוטביות ושלמותו של הקרום והשינויים בריכוזי יונים בתוך חיידקים, שתארנו דרך למדוד את האירועים הללו בס דלקת ריאות באמצעות צבעי ניאון. הפרוטוקולים שלנו הם הראשונים מסוגם תיארו לpneu...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Todd-Hewitt broth	Bacto, BD Diagnostics	249240
Yeast Extract	Bacto, BD Diagnostics	212750
Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2)	Invitrogen (GIBCO)
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879	DMSO
DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol)	Molecular Probes	B-438
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4170	Make up in deionized water
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich
PowerLoad	Molecular Probes	P10020	100x concentrate
Probenecid	Molecular Probes	P36400	Make 100x stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial
Fura-2/AM	Molecular Probes	F1221	Special packaging (50 µg aliquots)
PBFI/AM	Molecular Probes	P1267	Special packaging (50 µg aliquots)
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143
KH2PO4	JT Baker	3246-01	monobasic
NaOH	JT Baker	5565-01
K2HPO4	JT Baker	4012-01	dibasic
BCECF/AM	Molecular Probes	B1170	Special packaging (50 µg aliquots)
CCCP	Sigma-Aldrich		Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm, dissipating the electrical potential and the H+ gradient.
Culture tube	VWR	53283-802	Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass
Spectrophotometer	Thermo Scientific		Spectronic 20D+
15 ml Plastic conical tube	Corning	430790
Clear 96-well polystyrene microtiter plate	Fisher Scientific	12-565-501
Plate reader	BioTek	Synergy 2 Multi-Mode
Gen5 software	BioTek	Gen5™ Software