Überwachen von Änderungen in Membran-Polarity, Membrane Integrity und intrazelluläre Ionenkonzentrationen in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Verwenden von Fluoreszenzfarbstoffen

Zusammenfassung

Anders als bei Eukaryonten zu sehen, gibt es nur wenig Untersuchungen, die detailliert Membrandepolarisation und Ionenkonzentrationsänderungen in Bakterien, in erster Linie ihrer geringen Größe macht herkömmliche Messverfahren schwierig. Hier haben wir ausführlich Protokolle zur Überwachung solcher Veranstaltungen in der deutlichen Gram-positive Erreger Streptococcus pneumoniae Verwendung Fluoreszenztechniken.

Zusammenfassung

Membran-Depolarisation und Ionenflüsse sind Ereignisse, die ausgiebig in biologischen Systemen aufgrund ihrer Fähigkeit, tiefgreifend beeinträchtigen Zellfunktionen, einschließlich Energetik und Signaltransduktion untersucht worden sind. Während beide Fluoreszenz-und elektrophysiologischen Methoden, einschließlich Elektrodenverbrauch und Patch-Clamp, sind gut für die Messung dieser Ereignisse in eukaryotischen Zellen entwickelt haben Methodik zur Messung von ähnlichen Veranstaltungen in Mikroorganismen schwieriger zu entwickeln, bewährt aufgrund ihrer geringen Größe in Kombination mit der immer komplexer äußeren Oberfläche von Bakterien Abschirmen der Membran. Während unserer Studien des Todes-Einweihung in Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken), wollten wir die Rolle der Membran Ereignisse, einschließlich der Änderungen in der Polarität, Integrität und intrazellulären Ionenkonzentrationen aufzuklären. Suche in der Literatur fanden wir, dass nur sehr wenige Studien existieren. Andere Forscher hatten Radioisotop-Aufnahme oder Ionen-Gleichgewicht Grippe messen überwachtxes und Membranpotential und eine begrenzte Anzahl von Studien, vor allem in Gram-negative Organismen, hatte einige Erfolge gesehen mit Carbocyanin oder oxonol fluoreszierenden Farbstoffen Membranpotential zu messen, oder Laden Bakterien mit Zell-permeant acetoxymethyl (AM)-Ester-Versionen von ionensensitiven fluoreszierende Indikatorfarbstoffe. Wir haben deshalb festgelegt und optimierte Protokolle für die Messung Membranpotential, Bruch, und Ionentransport in der Gram-positiven Organismus S. pneumoniae. Wir entwickelten Protokollen unter Verwendung des Bis-Oxonol-Farbstoff DiBAC ₄ (3) und der Zell-impermeante Farbstoff Propidiumiodid zu Membrandepolarisation und Bruch zu messen, die jeweils, ebenso wie Verfahren, um optimal die Pneumokokken mit den AM-Ester der ratiometrische Farbstoffe laden Fura-2, PBFI und BCECF um Veränderungen der intrazellulären Konzentration von Ca ^{2 +,} K ⁺ und H ^+, jeweils zu erfassen, unter Verwendung eines Fluoreszenz-Plattenleseerfassungs. Diese Protokolle sind die ersten ihrer Art für die Pneumokokkenund die meisten dieser Farbstoffe nicht in andere Bakterienspezies verwendet wurde. Obwohl unsere Protokolle für S. optimiert pneumoniae, glauben wir, diese Ansätze sollten einen hervorragenden Ausgangspunkt für ähnliche Studien in anderen Bakterienarten bilden.

Einleitung

Unser Labor hat ein Protein-Lipid-Komplex aus menschlicher Milch namens Hamlet (für Menschen Alpha-Lactalbumin Aus tödlich Tumorzellen), die Apoptose in Tumorzellen induziert identifiziert, aber auch in der Lage, eine Vielzahl von Bakterienarten ^1,2 töten. Die Arten, die sich als besonders sensitiv waren diejenigen, die die Atemwege zielen, mit Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) Anzeigen des größten Empfindlichkeit und ein Apoptose-ähnlichen Phänotyp Todes ^2,3. Membrandepolarisation und spezifische Ionentransportereignisse sind gut beschrieben und entscheidenden Ereignisse während der Apoptose in eukaryotischen Zellen, insbesondere in den Mitochondrien, wo radioaktive TPP ^+-Ionen und Fluoreszenzfarbstoffe einschließlich JC-1 und TMRE wurden zur Depolarisation der Mitochondrienmembran ³ zeigen, ^-5. So haben wir versucht, mehr über die Wirkung von HAMLET auf diesen Membran-bezogene Funktionen in der Pneumokokken zu lernen, wie wir unsere Anstrengungen konzentrierenein besseres Verständnis der mechanistischen Komponenten des Apoptose-ähnlichen Phänotyps in Bakterien mit großem Potential zur Identifizierung neuer antibakterielle Therapien oder Impfstoffkandidaten in den Prozess.

In dem Bestreben, Protokolle für unsere mechanistische Untersuchungen zu schaffen, haben wir entdeckt, dass im Gegensatz zu den gut beschriebenen Methodik in eukaryontischen Systemen, gibt es sehr wenige veröffentlichte Studien Detaillierung Elektrophysiologie und Ionentransportmechanismen der bakteriellen Membran ^6,7. Dies ist vor allem auf die kleinere Größe der Mikroorganismen und ihrer Oberflächenarchitektur, insbesondere die Anwesenheit von Zellwand beschränkt, dass die Zugänglichkeit der Membran für die Verwendung von herkömmlichen Methoden, wie eukaryontische Patch-Clamping, obwohl einige Studien mit riesigen Protoplasten wurden mit unterschiedlichem Erfolg durchgeführt worden zurückzuführen ^8,9. Wie die Arbeit mit diesen riesigen Protoplasten ist keine ideale oder sogar praktische Methode für die meisten Bakterienarten, da es Menschen erfordertipulated Bakterien in einer unnatürlichen und abiotischen Zustand die begrenzte Studien der Bakterienmembran Polarität, die durchgeführt wurden in erster Linie verwendet Durchflusszytometrie und die Verwendung von Cyanin-und Oxonol-Farbstoffe fluoreszierende ^10-16.

Statt der Durchflusszytometrie, welche einzelnen Fluoreszenzmesswerte zu einem einzigen Zeitpunkt Punkt sammelt von einem Bakterium, entschieden wir uns, eine Fluoreszenzdetektion Plattenlesegerät verwenden, um Fluoreszenzintensität der Bakteriensuspensionen in einer 96-Well-Plattenformat im Laufe der Zeit zu erkennen. Dies ermöglichte es uns, eine Population von Bakterien zu verschiedenen Zeitpunkten mit viel größerer Einfachheit und Leichtigkeit zu behandeln und überwachen kontinuierlich die Fluoreszenz-Kinetik der gesamten Bevölkerung für längere Zeit, die nur schwer mittels Durchflusszytometrie zu erreichen ist. Nach dem Testen eine Vielzahl der potentialsensitive Fluoreszenzfarbstoffe (einschließlich der oben zur Verwendung mit der genannten Mitochondrien) erzielten wir die besten technischen und praktischen Erfolg mit derBis-Oxonol-Farbstoff genannt DiBAC ₄ (3) (Bis-(1,3-dibutylbarbituric Säure) Trimethinoxonol) auf Änderungen in der Polarität zu überwachen.

Wir fanden es auch wertvoll, um gleichzeitig Störungen in der Unversehrtheit der Membran unter Verwendung von Propidiumiodid (PI) zu überwachen. Dieser Farbstoff fluoresziert bei der Bindung an Nukleinsäure, ist aber nur in der Lage, dies zu tun, wenn die Integrität der Bakterienmembran beeinträchtigt wird, so dass es die beliebte Komponente verwendet, um tote Zellen zu erkennen im Live-tot-Färbung-Assays. Zusätzlich zu PI, SYTOX grün und TO-PRO-1 sind Fluoreszenzfarbstoffe, die eine ähnliche Wirkung besitzen und wurden zuvor für Bakterien in einigen Studien unter Verwendung der Durchflusszytometrie Nachweisverfahren ¹⁷ verwendet. Wir entschieden uns, PI wegen seiner Anregungswellenlänge, die uns zu seiner Fluoreszenz gleichzeitig mit DiBAC in einer gegebenen Probe zu überwachen erlaubt zu verwenden.

In unseren Studien haben wir, dass HAMLET, sowie ein weiteres verwandtes Protein-Lipid-Komplex mit der bakteriziden Aktivität beobachtetals Eloa induzierte Depolarisation und Bruch der Bakterienmembran bekannt, wie durch Zunahme der Fluoreszenz der beiden Farbstoffe bei der Behandlung der Pneumokokken ^3,18,26 angegeben. Für beide Komplexe beobachteten wir, dass die Fluoreszenzintensität der DiBAC ₄ (3) vor der Erhöhung der Intensität des PI erhöht, was anzeigt, daß die Depolarisation stattgefunden vor Bruch und ist daher ein bestimmtes Ereignis durch unsere bakterizide Protein-Lipid-Komplexen von induzierten Interesse. Diese Unterscheidung ist wichtig zu machen, als Bruch der Membran selbst verursachen unspezifische Depolarisation. Messung und Analyse sowohl DiBAC ₄ (3) und PI-Fluoreszenz-Kinetik gleichzeitig erlaubt es uns, diese Beziehung zwischen den beiden Membran Ereignisse, die ein zusätzlicher Vorteil der Verwendung Fluorometrie statt Durchflusszytometrie ist zu prüfen.

Um bakterielle Ionenfluss zu überwachen, hat es einige bisherigen Erfolge mit der Verwendung von Radioisotopen, einschließlich der Aufnahme von Mess45 Ca ^{2 +} in der Pneumokokken ^19,20, die wir auch in unseren bisherigen Untersuchungen ^{18, 21} verwendet. , Die Arbeit mit diesen radioaktiven Ionen hat jedoch mehrere Nachteile. Sie können teuer, zeitaufwendig und schwierig, und auch die einzelnen aussetzen Durchführung des Experiments zu schaden, abhängig von der Isotopen von Interesse. Zusätzlich ist es schwierig, schnelle Änderungen im Laufe der Zeit zu überwachen. Somit Richtung einer alternativen Methode der Messung, die Acetoxymethyl-(AM)-ester Versionen von ionensensitiven Fluoreszenzindikatorfarbstoffe verwendet wandten wir. An sich ist der Indikatorfarbstoff gegeben und nicht durch die Membran leicht, aber mit der Zugabe des lipophilen Estergruppe kann die jetzt ungeladenes Molekül durch die Membran des Bakteriums geben. Beim Eintritt in den Innenraum, die Bakterien Esterasen spalten die Estergruppe, so dass der Farbstoff in der Zelle frei und wieder aufgeladen, deutlich verlangsamt seine Fähigkeit, die Zelle zu verlassen und so der Farbstoff to reichern sich über die Zeit. Jedoch ist die Verwendung dieser Ester Farbstoffe nur in einigen Bakterienspezies beschrieben worden, um Veränderungen der intrazellulären Ca ^{2 + +} H ^22-24 und ¹⁶ zu erkennen, mit unterschiedlichen Methoden der Beladung, Detektion und Erfolg.

Mit dem Wunsch, Änderungen der intrazellulären Ca ^{2 +} zu überwachen und K ⁺ und H ^{+-Konzentrationen} in S. pneumoniae bei Behandlung mit HAMLET und andere Verbindungen, die wir erfolgreich erstellt Protokolle, um fluoreszierende Indikatorfarbstoffe in Bakterienzellen effizient zu laden. Effektive Laden in Bakterien erforderlich, die sowohl Probenecid Farbstoffretention erhöht durch die Blockierung Anionen-Transporter und Antriebsladung, eine proprietäre Verbindung von Life Technologies, die Beladungseffizienz erhöht. Fura-2/AM (Erfassungs Ca ^{2 +),} PBFI / AM (Erfassungs K ⁺⁾ und BCECF / AM (Erfassungs H ⁺⁾ wurden erfolgreich in sowohl nicht eingekapselte und eingekapselt Pneumokokken st geladenRegen eine Messung der resultierenden Fluoreszenz-Muster nach der Zugabe von Ionophoren, wie Ionomycin (Ca ^{2 +} Entkoppler) Valinomycin (K ⁺ Entkoppler) und CCCP (H ⁺ Entkoppler) unter Verwendung eines Fluoreszenz-Plattenleseerfassungs ^{18, 21.}

Protokoll

1. Vorbereiten bakterielle Kulturen

1. Wachsende Kultur für den Einsatz in Experimenten
   1. In einem 37 ° C Wärmeblock, eine gefrorene auftauen Lager-Fläschchen von S. pneumoniae und fügen den Inhalt in 9 ml frisches, vorgewärmtes Todd-Hewitt-Medium mit 0,5% Hefeextrakt (THY) für ein Gesamtvolumen von 10 ml in einem Glaskulturröhrchen.
   2. Inkubieren statisch bei 37 ° C, bis die Kultur die mittlere Log-Phase (Abs _{600 nm} ≈ 0,5-0,6) erreicht.

2. Erkennen Depolarisation der Membran und Rupture

1. Vorbereiten Reagenzien
   1. Bereiten Sie eine 50 uM Lager von DiBAC ₄ (3) in 100% DMSO und eine 2 mg / ml Stamm von PI in ddH ₂ O. Die DiBAC ₄ (3) stock ist bei -20 ° C stabil für mindestens 6 Monate. Der PI-Lager ist bei 4 ° C stabil für mindestens 6 Monate.
   2. Wickeln Sie Aktien in Folie aus dem Licht zu schützen.
2. VerladungBakterien
   1. Pellet die Bakterienzellen aus Schritt 1.2.2 durch Zentrifugation bei 2.400 × g für 10 min bei Raumtemperatur und zweimal waschen durch Entfernen des Überstands, Resuspendieren des Pellets in 10 ml 1 × phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), und erneut zentrifugieren bei 2.400 xg für 10 min.
   2. Überstand abnehmen und das Pellet erneut in PBS auf das ursprüngliche Volumen. Dies wird für etwa 10 ⁸ koloniebildenden Einheiten von Bakterien pro ml ist. Entfernen 1 ml (ausreichend für 5 Proben) der Zellen gewaschen und in einen Mikrozentrifugenröhrchen.
   3. Diese Zellen werden 25 ul einer 1 M steril filtrierten Stammlösung von Glucose (in ddH ₂ O hergestellt und durch einen 0,45 um Filter filtriert) für eine Endkonzentration von 25 mM Glucose inkubiert und in einem 37 ° C-Heizblock fünfzehn min. HINWEIS: Dieser liefert Energie für alle ATP-abhängigen Membrankanäle und zellulären Komponenten. Die Notwendigkeit für diesen Schritt kann je nach Experiment.
   4. In 5 ul der 50 uM DiBAC ₄ (3) Lager und 10 ul der 2 mg / ml PI Lager. Dies sorgt für eine Endkonzentration von 250 nM und 20 &mgr; g / ml. Gründlich durch und Abpipettieren mehrmals. In 200 ul dieser Zellsuspension zu jeder Probe und einer klaren 96-Well-Platte.
3. Detektieren der Fluoreszenz
   1. Legen Sie die Platte in einem vorgewärmten (37 ° C) Fluoreszenzdetektion Plattenlesegerät.
   2. Stellen Sie sicher, dass geeignete Filter sind im Ort für DiBAC ₄ (3) (490 nm Anregung, 516 nm Emission) und PI (535 nm Anregung, 617 nm Emission)-Erkennung.
   3. Um (und gleichzeitig zu überwachen) Ausgleich der DiBAC ₄ (3) über die Membran, setzen Sie den Leser auf Fluoreszenzmessungen für ca. 30-40 min dauern jeden min oder bis Messwert stabilisiert erlauben, dies dient als "Vorbehandlung" Lesen.
   4. Werfen Platte und fügen Sie die experimentellen Mittel der Wahl und immediately legen die Platte wieder in den Leser weiter überwachen DiBAC ₄ (3) und PI-Fluoreszenz für die gewünschte Länge der Zeit. Wenn die Behandlung mehrere Proben auf einmal, mit einer Mehrkanalpipette kann hilfreich sein, um den Agenten gleichzeitig in alle Vertiefungen hinzuzufügen.
   5. Exportieren Sie die Messwerte mit einer Datenanalyseprogramm wie Microsoft Excel. Plot Fluoreszenz über die Zeit zu Depolarisation der Membran und Bruch zu evaluieren. Steigende Fluoreszenz DiBAC und PI zeigt, dass Depolarisation und Bruch auftreten.

3. Erfassen von Änderungen in der intrazellulären Ca ^{2 +-oder} K ^{+-Konzentrationen}

1. Vorbereiten Reagenzien und Ladepuffer
   1. Bereiten Sie die folgenden Reagenzien: 5 mM Stamm der ionensensitiven Fluoreszenzfarbstoff (Fura-2/AM oder PBFI / AM, fügen Sie die entsprechende Menge an DMSO in ein Röhrchen mit 50 ug der Farbstoff), "100x" Probenecid (1 hinzufügen ml PBS auf eine 77 mg Ampulle). Das gelösteFarbstoffe können bei -20 ° C eingefroren und einmal in Lösung für 3 Monate stabil, wohingegen die Probenecid in Lösung stabil bei -20 ° C für 6 Monate.
   2. Herstellung von 1 ml 2 × Ladepuffer wie folgt: In den Boden eines 15 ml konischen Kunststoffrohr verzichten 20 ul 100x Konzentrat Antriebsladung (bei 2-8 ° C für 6 Monate), gefolgt von 2 ul 5 mM Ionen empfindlichen Farbstoff direkt in die Antriebsladung. Vortex kurz mischen. In 960 ul PBS, gefolgt von 20 ul 100x Probenecid. Mischen Sie die Mischung ein letztes Mal. In Folie wickeln, um vor Licht zu schützen.
2. Laden der Bakterien, die mit Farbstoff
   1. Pellet und waschen Sie den mittleren logarithmischen Phase Bakterienkultur wie in 2.2.1 beschrieben. Überstand entfernen und Pellet erneut in 5 ml PBS, eine "2x" Zellsuspension zu machen.
   2. 1 ml der Zellsuspension 2x auf das 2x Ladepuffer. Dies wird für ein Endvolumen von 2 ml, und letzte Konzentr bereitzustellenErwartungen über 1x Antriebsladung, 5 uM Fluoreszenzfarbstoff und 1x Probenecid. HINWEIS: Diese Suspension bietet genügend Volumen für 10 Proben, da jede Probe auch für die Messung werden 200 ul enthalten.
   3. Inkubation in einem 37 ° C Wasserbad für 75 min, vor Licht geschützt. HINWEIS: Der Farbstoff wird in die Bakterienzellen in der Abwesenheit von glykolytischen Substraten und in Gegenwart von Probenecid zu Efflux des Farbstoffs zu minimieren geladen.
   4. WASH 1: Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 2.400 × g für 10 min, zu entfernen Standes und Resuspension in 2 ml PBS, 1x Probenecid. WASH 2, 3: Wiederholen Sie Schritt 3.2.4 2x. Inkubieren bei 37 ° C für weitere 30 min. Dies ermöglicht es Zeit für bakterielle Esterasen, die Estergruppe Uhr von den verinnerlichten Fluoreszenzfarbstoffe hydrolysieren.
   5. WASH 4: Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 2.400 × g für 10 min, zu entfernen Standes und Resuspension in 2 ml PBS, 1x Probenecid. HINWEIS: Je nach experiment, Glucose kann wieder hier, um neue Energie zu tanken die Bakterien aufgenommen werden.
3. Detektieren der Fluoreszenz
   1. Vorwärmen die Fluoreszenzdetektion Plattenleser Plattenlesegerät auf 37 ° C
   2. Für jede gewünschte Probe, 200 ul der beladenen Zellen (aus Schritt 3.2.8) in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte. (Führen Sie die folgenden Schritte bis zur Fertigstellung für ein gut / Probe zu einem Zeitpunkt).
   3. Um eine Basislektüre für einen Brunnen, Platz Platte in der Fluoreszenzdetektion Plattenleser, um die Fluoreszenz (340 nm Anregung / 510 nm Emissions für "Wert 1" und 380 nm Anregung / 510 nm Emissions für "Wert 2") am messen sollen jede Sekunde für eine min.
   4. Werfen Platte, fügen Sie die Therapie der Wahl zu diesem auch (in einem kleinen Volumen von ca. 5 ul), schnell zu pipettieren, oben und unten ein paar Mal, um zu mischen und sofort wieder auf das in der Fluoreszenz-Detektionsplatte-Leser, jeden sec für die gewünschte lesen Dauer. (Wenn die inProjektoren mit dem Plattenlesegerät zugeordnet sind, diese könnten auch verwendet werden, um nahtlos fügen Sie die gewünschte Behandlung, wodurch die Notwendigkeit, um den Lese Auswerfen der Platte).
   5. Exportieren Sie die Messwerte mit einer Datenanalyseprogramm wie Microsoft Excel. Berechnen Sie das Verhältnis der Fluoreszenzwerte für jede Zeitpunkt berechnet, indem ein Wert von Wert 2, und zeichnen Sie die Verhältniswerte in einer Grafik.

4. Erfassen von Änderungen in der intrazellulären pH-Wert

1. Vorbereiten Reagenzien und Puffer Kalibrierung
   1. Bereiten Sie die folgenden Reagenzien: 5 mM Stamm BCECF / AM (. Fügen Sie die entsprechende Menge DMSO in ein Röhrchen mit 50 ug des Farbstoffs Dieser Bestand ist bei -20 ° C 3 Monate haltbar), 100x Probenecid (1 ml PBS auf eine 77-mg-Durchstechflasche). 1 mM Stoffaufbereitung Nigericin in Ethanol (erforderlich, um den intrazellulären pH-Wert (pH-Wert ins Gleichgewicht _i) der Zellen auf den pH-Wert der umgebenden Puffer Dieser Bestand ist sTabelle bei -20 ° C für 6 Monate);. 0,5 mM Stamm von Carbonyl Cyanid 3-chlorphenylhydrazon (CCCP) in DMSO (protonophore die Protonenantriebskraft entkoppeln Dieser Bestand ist bei -20 ° C stabil für 6 Monate)
   2. Vorbereitung 10 ml der folgenden hohen Kalium Puffer: 135 mM KH ₂ PO _4/20 mm NaOH (einbasischen) und 110 mM K ₂ HPO _4/20 mm NaOH (dibasischen). Filter sterilisieren unter Verwendung eines 0,45 um-Filter. (Diese Puffer können bei 4 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.)
   3. Mischen der hohen Kaliumpuffer in den notwendigen Mengen, um hohe Kaliumpuffer mit mindestens 5-6 pH-Werten im Bereich von 6,5 bis 8,0 zu schaffen.
   4. Herstellung von 1 ml 2 × Ladepuffer wie folgt: In den Boden eines 15 ml konischen Kunststoffrohr verzichten 40 ul 100x Antriebsladung, gefolgt von 20 ul 5 mM ionenempfindlichen Farbstoff direkt in die Antriebsladung. Vortex kurz mischen. In 900 ul PBS, gefolgt von 40 ul 100x Probenecid. VortEx die Mischung ein letztes Mal. In Folie wickeln, um vor Licht zu schützen.
2. Laden der Bakterien, die mit Farbstoff
   1. Pellet und waschen Sie die 8 ml der mittleren logarithmischen Phase Bakterienkultur wie in 2.2.1 beschrieben. Überstand entfernen, Pellet erneut in 2 ml PBS, eine "4x" Zellsuspension zu machen.
   2. 1 ml der Zellsuspension 4x an den 2x Ladepuffer. Dies wird für ein Endvolumen von 2 ml, und Endkonzentrationen von Zellen 2x, 2x Antriebsladung 50 um Fluoreszenzfarbstoff und 2x Probenecid bereitzustellen.
   3. Inkubation in einem 30 ° C Wasserbad für 40 min, vor Licht geschützt. HINWEIS: Der Farbstoff wird in die Bakterienzelle bei der niedrigeren Temperatur von 30 ° C und in Abwesenheit von glykolytischen Substrate Efflux des Farbstoffs zu minimieren geladen.
   4. WASH 1: Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 2.400 xg für 10 min Überstand zu entfernen, um überschüssige Farbe zu entfernen, und resuspendieren in 4 ml PBS, enthaltend 2x Probenecid einnd 1 mM Glukose (Kraft zu tanken, um die Bakterien). WASH 2, 3: Wiederholen Sie Schritt 4.2.7 zweimal mit endgültigen Resuspension in 4 ml PBS (für eine Endkonzentration von 1x Zellen) enthält, 2x Probenecid und 10 mM Glucose.
   5. Inkubieren bei 37 ° C für 5 min. Dadurch können die Zellen vollständig mit Energie zu versorgen und damit Zeit für die bakterielle Esterasen, um die Uhr Estergruppe vom verinnerlicht BCECF spalten.
3. Gründung Hintergrundfluoreszenz und in vivo Eichkurve
   1. Vorwärmen die Fluoreszenzdetektion Plattenleser Plattenlesegerät auf 37 ° C
   2. Zu bestimmen, die Hintergrundfluoreszenz, Filter-sterilisiert etwa 500 ul der belasteten und erregt bakteriellen Suspension (aus Schritt 4.2.7), um die Bakterien zu entfernen, und mit 200 &mgr; l Filtrat nach der Vertiefung der 96-Well-Platte.
   3. Zeigen Platte in der Fluoreszenzdetektion Plattenleser, um die Fluoreszenz zu messen (490 nm Anregung / Emission 530 nm für"Wert 1" und 440 nm Anregung / 530 nm Emissions für "Wert 2") für 1 min. Dieses Hintergrundfluoreszenz sollte vor der Berechnung der Verhältnisse sowohl für die Eichkurve und die experimentellen Proben abgezogen.
   4. Um eine in vivo-Eichkurve zu erhalten, waschen Sie 500 ul Aliquots der geladenen und energiegeladen Zellen aus Schritt 4.2.7 und resuspendieren einmal in hohen Kalium-Puffer bei verschiedenen pH-Werten (im Bereich von 6,5 bis 8,0).
   5. Mit 20 &mgr; M Nigericin zu den Proben, um den intrazellulären pH-Wert der Zellen, den pH-Wert der umgebenden Puffer äquilibriert und bei 37 ° C für 5 min. Gib 200 ul Bakterien / pH Pufferkombinationen in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte.
   6. Zeigen Platte in der Fluoreszenzdetektion Plattenleser, um die Fluoreszenz für ein paar Minuten zu messen, um eine stetige Lektüre für jeden gut zu etablieren. Exportieren Sie die Messwerte mit einer Datenanalyseprogramm wie Microsoft Excel.
   7. Nach Abzug der background Fluoreszenzwerte, berechnen Sie das Verhältnis der Fluoreszenzwerte durch Division von Wert 1 Wert 2. Zeichnen Sie die Ratio-Werte für jede pH-Puffer, um die Eichkurve zu erstellen. (Eine Eichkurve sollte für jede neue Charge des beladenen Zellen erzeugt werden, wie die Menge an Fluoreszenzfarbstoff, der in den Bakterien beladen ist, kann jedes Mal variieren).
4. Messen von Veränderungen der intrazellulären pH-Wert
   1. Für jede gewünschte Probe, 200 ul der belasteten und erregten Zellen (aus Schritt 4.2.7) in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte.
   2. Zeigen Platte in der Fluoreszenzdetektion Plattenleser und messen die Fluoreszenz der Proben alle 5 Sekunden für 5 min.
   3. Werfen Sie die Platte, und fügen Sie 10 uM CCCP, um ein gut (dient als positive Kontrolle für die Verringerung der intrazellulären pH-Wert) und der Versuchsmittel (n) von Interesse für den anderen Brunnen. Um deren Auswirkungen genau zu vergleichen mit der Zeit, fügen Sie die CCCP und Mittel der Wahl in der gleichen Zeit mit Uhrultichannel Pipette.
   4. Sofort die Platte zurück auf die Platte-Leser und weiter Fluoreszenzmessung alle 5 Sekunden für 10 min. Als zusätzliche Kontrolle, werfen Sie die Platte und mit 20 uM Nigericin für alle Proben, um den pH _i der Bakterien auf den pH-Wert der umgebenden Puffer ins Gleichgewicht, und lesen für 5 min.
   5. Nach Subtraktion der Hintergrund-Fluoreszenz-Werte berechnen die Verhältnisse der Fluoreszenz für jede Probe. Interpolieren des pH _i für jede Messung aus der Eichkurve.

Ergebnisse

Bei allen Experimenten, gibt es eine Reihe von Proben und in jeder Vertiefung vorhanden Bedingungen. Somit wird jedes Verfolgung stellt die Fluoreszenzintensität einer gesamten Bakterienpopulation im Laufe der Zeit. Die Ergebnisse sollten leicht zu interpretieren sein, mit einer klaren Unterscheidung zwischen der Fluoreszenz der behandelten Proben und die der unbehandelten Kontrollen. Die Kinetik und der Grad eines beobachteten Fluoreszenzänderung kann Informationen über die möglichen Mechanismus und das Au...

Diskussion

Trotz der Einschränkung, dass Größe stellt für die Verwendung von klassischen Methoden der Elektrophysiologie, Änderungen in der Polarität und der Unversehrtheit der Membran und Änderungen der Ionenkonzentration in Bakterien zu detektieren, haben wir einen Weg, um diese Ereignisse zu messen beschrieben in S. pneumoniae Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen. Unsere Protokolle sind die ersten ihrer Art für die Pneumokokken und einer der wenigen, für die Bakterienarten im Allgemeinen beschrieben wird. Dur...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Todd-Hewitt broth	Bacto, BD Diagnostics	249240
Yeast Extract	Bacto, BD Diagnostics	212750
Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2)	Invitrogen (GIBCO)
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879	DMSO
DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol)	Molecular Probes	B-438
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4170	Make up in deionized water
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich
PowerLoad	Molecular Probes	P10020	100x concentrate
Probenecid	Molecular Probes	P36400	Make 100x stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial
Fura-2/AM	Molecular Probes	F1221	Special packaging (50 µg aliquots)
PBFI/AM	Molecular Probes	P1267	Special packaging (50 µg aliquots)
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143
KH2PO4	JT Baker	3246-01	monobasic
NaOH	JT Baker	5565-01
K2HPO4	JT Baker	4012-01	dibasic
BCECF/AM	Molecular Probes	B1170	Special packaging (50 µg aliquots)
CCCP	Sigma-Aldrich		Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm, dissipating the electrical potential and the H+ gradient.
Culture tube	VWR	53283-802	Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass
Spectrophotometer	Thermo Scientific		Spectronic 20D+
15 ml Plastic conical tube	Corning	430790
Clear 96-well polystyrene microtiter plate	Fisher Scientific	12-565-501
Plate reader	BioTek	Synergy 2 Multi-Mode
Gen5 software	BioTek	Gen5™ Software